專利名稱：：氰戊菊酯殘留的間接競爭酶聯免疫吸附分析試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種氰戊菊酯殘留的間接競爭酶聯免疫吸附分析(ELISA)試劑盒，主要適用于大批量水樣品中氰戊菊酯殘留的快速測定。
背景技術：
：氰戊菊酯是一種合成菊酯類農藥，由于殺蟲譜廣、供應充足，價格又相對較低，因此在茶葉生產中應用普遍。在我國，氰戊菊酯主要用于棉花、茶葉、果樹和蔬菜種植中。然而，氰戊菊酯是一種高毒物質，對于大鼠急性經口LD50為451mg/kg，而對于魚類和水生的無脊推動物的毒性更高。目前氰戊菊酯已成為影響我國茶葉出口的一個重要限制因素。常用的氰戊菊酯的分析方法主要有高壓液相色譜法，氣相色譜連接電子捕獲檢測器法和液質聯用法。應用這些理化分析技術對環境、生物、食品等樣品中痕量氰戊菊酯殘留進行分析，不僅儀器化程度要求較高，并且需要經過繁復的分離、提取、凈化、衍生等前處理過程，分析速度慢、成本高，前處理過程需要使用大量的有機溶劑，又造成了新的環境污染。隨著待檢樣品、特別是要求現場快速檢測樣品量的迅速增加，傳統的農藥殘留分析手段難以適應要求，因此，迫切需要開發和應用高效率農藥殘留快速分析技術。
發明內容(一)要解決的技術問題為了解決目前農藥殘留儀器分析方法成本高和操作復雜以及快速檢測技術中特異性差、靈敏度低和檢測結果不穩定等缺點，本發明提供一種具有高特異性、高靈敏度、高準確度、高精確度、操作方法簡單，并能用于大批量樣品快速檢測的氰戊菊酯殘留的間接竟爭酶聯免疫吸附分析試劑盒。(二)技術方案本發明試劑盒包括包被氰戊菊酯抗原的酶標板、濃縮洗滌液、氰戊菊酯標準品、氰戊菊酯特異性抗體、酶標記物、底物顯色液和反應終止液。其中，所述包被抗原是3-[(土)氰基[(CIS)2-[3-氯苯基]3-甲基丁羰基氧基]苯氧基]苯丙酸與載體蛋白的偶聯復合物，所述載體蛋白優選為卵清蛋白。其中所述氰戊菊酯特異性抗體是由3-[(±)氰基[(CIS)2-[3-氯苯基]3-甲基丁羰基氧基]苯氧基]苯丙酸與載體蛋白偶聯作為免疫原制備獲得，可以是通過雜交瘤方法制備得到的單克隆抗體，或者是直接免疫動物得到的多克隆抗體。所述，載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白(BCG)、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白等常用載體蛋白，優選為牛血清白蛋白；所述多克隆抗體可以是鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，優選為兔源多克隆抗體。其中，包被抗原的酶標板的制備過程中，所用包被液可以是0.05MpH9.6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含1%明膠的上述包被液。其中，酶標記物為酶標二抗，標記酶可以是辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。其中，濃縮洗滌液的配方為每20mL蒸餾水中加入氯化鈉7~9g、磷酸二氫鉀0.1~0.3g、磷酸氫二鈉24g、氯化鉀3-6g、吐溫-200.5~3mL。濃縮洗滌液的濃度是正常使用時的50倍。當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液由A液和B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，終止液為12mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液。具體地說，A液配方可為每lOOOmL水中加入過氧化脲lg，10.3g檸檬酸，35.8gNa2HPCV12H20,吐溫-20lOO(xL,pH5;B液配方可為每1000mL蒸餾水中加入四甲基聯苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g檸檬酸，pH2.4-2.8。當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。本發明試劑盒的分析原理是當酶標板預包被抗原時，加入待測氰戊菊酯樣品和多克隆抗體，固相包被抗原和待測氰戊菊酯相互竟爭與抗體反應，由于每個孔中的固相抗原和加入的抗體含量均一致，所以當待測的氰戊菊酯濃度高時，則被結合在固相抗原上的抗體少，加入的酶標二抗與被固定抗體結合量少，最后加入底物液和顯色液，顯色反應淺，用酶標儀檢測的OD值低，表明抑制率高；反之，當待測氰戊菊酯濃度低時，則所測的OD值高，抑制率低。根據用已知的氰戊菊酯濃度檢測所作的標準曲線，可以推算出待測氰戊菊酯的濃度。(三)有益效果本發明的優點是能準確靈敏地檢測不同來源的水樣中氰戊菊酯殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠低于傳統的儀器檢測方法。本發明對解決大批量樣品的氰戊菊酯殘留現場監控技術具有重要的現實意義。具體實施例方式下面實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。實施例l試劑盒操作及結果計算試劑盒操作及結果計算待測樣品經前處理后，用含甲醇50%的PBS定容備用。拆開真空包裝袋并取出酶標板，在室溫下平衡5分鐘備用。配制Omg/L,0.05mg/L,0.5mg/L，5mg/L，50mg/L,100mg/L，200mg/L的氰戊菊酯標準液，加入50pL標樣或處理好的樣品到各孔中，標樣和樣品做2-4個重復，加入50pL稀釋的抗體，37'C孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗26次，將酶標板倒置在吸水紙上拍干；加入按1:1000稀釋好的酶標羊抗兔二抗100pL，37"C孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用PBST洗板2-6次，拍干；取A液和B液等體積混勻，每孔加100pL，在暗處顯色10~15分鐘，每孔加入50^il的終止液終止反應，酶標儀上測定各孔在波長為450nm處的OD值。將含0標準液孔的OD值減去含最大濃度標準液孔的OD值定為Bo，其余孔經同樣方法校正后的OD值定為B;以B/Bo值為縱坐標，相應標準品濃度的log值為橫坐標，繪制氰戊菊酯標準抑制曲線。其中，曲線回歸方程為y=-0.30x+1.71，R2=0.98,抑制中濃度IC50=10.7mg/L，最低檢測限IC20=1.0mg/L。實施例23-[(±)氰基[(CIS)2-[3-氯苯基l3-甲基丁羰基氧基苯氧基l苯丙酸的合成l-漠-3-(二甲氧基甲基)苯的合成將18.5g(O.lmol)3-溴苯甲醛，置于100mL的三口瓶中，加入5mL甲醇，室溫下攪拌約2min,再向體系內滴加12.2g(0.118mol)原酸三甲酯和10mL甲醇的混合溶液，待攪拌均勻后滴入2滴濃硫酸，此時體系略微放熱。室溫下攪拌，TLC監測反應進度。待反應進行完全后，用40mL乙醚稀釋反應體系，再用10mL5。/。的Na2C03水溶液洗滌有機相，當搖振后有大量白色固體析出，而且有機相和水相的界面不清晰，加入30mL去離子水洗滌有機相，再用10mL去離子水洗滌，分出有機相，用無水MgS04干燥。減壓蒸餾，在0.5mmHg下收集9910rC的餾分。得無色粘稠液體，約16.16g，產率70.3%。4-羥基苯丙酸苯甲酯的制備616.6g(O.lmol)對羥基苯丙酸，和32mL(0.3mol)節醇，置于100mL單口燒瓶中，加入50mL無水甲苯，室溫下攪拌均勻，再滴入5滴85%的H3P04,加熱會餾分水，反應約12小時，此時體系呈黃色澄清，共分出約0.7mL水，停止反應，待體系恢復至室溫，向體系內加入50mL乙酸乙酯，稀釋反應體系，再用25mL飽和的NaHC03水溶液分2兩次洗滌有機相，再用去離子水洗滌有機相3次，每次10mL，分出有機相用無水MgS04干燥。減壓蒸餾，在lmmHg時收集216217'C的餾分。得淡黃色粘稠狀液體20.68g，產率約為80.7%4-(3-二甲氧基甲基)苯氧基苯丙酸苯甲酯的制備稱20.68g(0.08mol)4-羥基苯丙酸苯甲酯置于250mL的三口燒瓶中，用120mL無水DMF溶解，體系內通入N2氣后攪拌；再稱3.9g50%的NaH分批快速加入燒瓶中，此時體系內立即出現淺黃色濁狀物，隨后黃色隨NaH的加入不斷變深，而且有氣泡(泡沬)產生，體系溫度上升約10。C;加完NaH，攪拌約20min,待體系顏色變成棕黃色時，再向燒瓶中加入18.6g(0.08mol)I，和50mL無水吡啶，再在攪拌下加入0.87gCuCl和0.44gCu屑，此時體系立刻變成深棕色；投料完畢后升溫至回流，TLC監測反應進度；待原料反應完全后，停止加熱，讓體系恢復至室溫；用1500mL乙酸乙酯稀釋反應體系，此時立即有大量棕色凝膠狀不溶物析出，抽濾將濾液分出，用乙酸乙酯洗滌不溶物，將洗液和濾液合并，制成4-(3-二甲氧基甲基)苯氧基苯丙酸苯甲酯的乙酸乙酯溶液。4-(3-甲醛苯氧基)苯丙酸苯甲酯的制備用200mL10。/。的稀鹽酸與2000mL4-(3-二甲氧基甲基)苯氧基苯丙酸苯甲酯的乙酸乙酯溶液混合攪拌，TLC監測，待4-(3-二甲氧基甲基)苯氧基苯丙酸苯甲酯的點消失后，用去離子水洗滌有機相至有機相呈中性為止，用無水MgS04干燥。將有機相濃縮后柱層析(石油醚乙酸乙酯=5:l)得黃色粘稠油狀液體約10g，產率為30.8%。3-[3-[氰基(羥基)甲基沐氧基沐丙酸苯甲酯的制備將0.85g(13mmol)KCN溶于3mL去離子水中，置于冰水洛中冷卻；將0.9g(2.5mmo1)4-(3-甲醛苯氧基)苯丙酸苯甲酯的15mLTHF溶液加入KCN水溶液中，攪拌至體系的溫度為0'C左右；用滴液漏斗向體系內緩慢滴加40%H2S04，冰水洛下攪拌反應，TLC監測反應進度，待4-(3-甲醛苯氧基沐丙酸苯甲酯的點消失后停止攪拌，用30mL二氯甲垸稀釋反應體系，再用去離子水洗滌有機相3次，每次15mL，分出有機相，用無水MgS04干燥。旋轉蒸發儀上減壓蒸出溶劑，得黃色粘稠油狀液體約0.93g,產率為96%。S-氟戊菊酸的制備取100g外消旋的氰戊菊酸加入200mL的甲苯和300mL的甲醇，攪拌加熱至回流。然后停止加熱，加入42g的(S)-(-)-a-甲基芐胺(約30min加完)，停止反應，反應液室溫冷卻，過濾收集固體，并用甲醇沖洗固體三次。將所收集的固體加入400mL甲醇，加熱回流lh,然后室溫冷卻，過濾收集固體。然后在2000mL甲醇中重結晶收集到的固體。收集到的固體加入300mL3mol/L的HC1,然后加入500rnL的二乙醚抽提酸化的S-氰戊菊酸，分液收集有機相，旋轉蒸發脫去溶劑得白色固體33,2g，熔點為103.3-106.3°C。[a]D20°C=36.7[C=1,CH3CH2OH]e.e.=95.7%手性拆分檢測色譜條件Agilent6890,色譜柱HP530m，載氣N2，流速2.0mL/min.氣化室升溫程序70°C保持lmin，15°C/min升溫至280°CS-氟戊菊酰氯的制備將0.53g(2.5mmo1)(S)-菊酸溶于5mL無水二氯甲烷，置于冰鹽洛中冷卻至0。C左右，攪拌下用滴管移入0.55mL(7.5mmol)SOCl2和lmL無水二氯甲烷的混合溶液，滴加完畢，讓體系在冰鹽洛中攪拌10min,再撤去冰鹽洛，升溫至回流反應3小時，體系由無色逐漸變成黃色，反應完畢，用旋轉蒸發儀減壓蒸除溶劑和過量的S0Cl2，得粗酰氯，封口干燥放置。3-[(士)氟基[(CIS)2-[3-氯苯基]3-甲基丁羰基氧基苯氧基]苯丙酸苯甲酯的制備把1.5g(3.87mmo1)3-[3-[氰基(羥基)甲基]苯氧基]苯丙酸苯甲酯溶于10mL無水二氯甲烷中，冰鹽洛下冷卻至O'C，再在攪拌下滴加0.8g(3.46mmo1)粗(S)-菊酰氯和2mL無水二氯甲烷的混合溶液，滴加完畢立即加入lmL無水吡啶，此時體系內立即產生大量白色霧狀物，冰鹽洛下攪拌10min，再撤去冰浴，將體系置于室溫中攪拌反應，體系呈黃色澄清，TLC監測反應進度，待反應完全，停止攪拌，用25mL二氯甲烷稀釋反應體系，用lOmL稀鹽酸洗滌有機相，再用去離子水洗滌有機相至中性，分出有機相，用無水MgS04干燥；將有機相用旋轉蒸發儀減壓蒸除溶劑，柱層析(石油醚乙酸乙酯=5:1)得黃色粘稠油狀液體1.58g,產率為78.4%。1HNMR(CDC13)圖譜顯示該化合物為兩種光學異構體的混合物，S0.71(dd,3H，CH3),1.00(dd,3H，CH3)，2.32(m，lH，Me2CH),2.69(t,2H,CH2),2.97(t，2H，CH2)，3.22[dd,lH,CHC(0)],5.12(s,2H,CH2Ar),6.30(d,lH，CHCN),6.86誦7.35(m，17H,Ar)。3-[(士)氟基[(CIS)2-[3-氯苯基]3-甲基丁羰基氧基]苯氧基I苯丙酸的制備在氮氣保護下，將0.79g(1.35mmo1)3-[(士)氰基[(CIS)2-[3-氯苯基]3-甲基丁羰基氧基]苯氧基]苯丙酸苯甲酯用8mL無水二氯甲烷溶解，加入0.24mL(1.68mmol)三甲基碘硅烷，35"C反應約1小時，用30mL二氯甲烷稀釋反應體系，再用去離子水洗滌有機相3次，每次10mL，分出有機相用無水MgS04干燥，將有機相旋轉蒸發儀減壓蒸除溶劑，柱層析(石油醚乙酸乙酯=3:1，含2.5%乙酸)得淡黃色粘稠液體約0.5g，產率為75%。1HNMR(CDC13)圖譜顯示該化合物為兩種光學異構體的混合物，S0.70(dd,3H，CH3),1.00(dd,3H，CH3),2.31(m，lH，Me2CH),2.69(t，2H，CH2)，2.95(t，2H，CH2),3.24[dd,lH,CHC(0)],6.32(d,lH，CHCN),6.89曙7.35(m,12H,Ar)。LC-MSD-Trap畫VLm/z[M+Na〗+=C28H26ClNNa05理論值514.1,實測值514.1。實施例3氰戊菊酯多克隆抗體制備以活性酯法將半抗原與牛血清白蛋白偶聯，稱2mg偶聯物溶于lmL生理鹽水中，和lmL完全弗氏佐劑混合，充分乳化后注射新西蘭大耳白兔大腿，以后每隔兩周加強免疫一次，換用不完全弗氏佐劑與免疫原混合，免疫部位為頸背部皮下，從第三次免疫開始，每次免疫后一周從兔耳靜脈釆血檢測血清效價。總共免疫5次，最后一次免疫后一周從兔頸動脈采全血，用35%的飽和硫酸銨鹽析法粗提兔抗血清，最后用DE-52陰離子交換層析法進一步純化，獲得較純的氰戊菊酯多克隆抗體。DE-52陰離子交換純化抗體(1)DE-52預處理以lmg粗IgG需5g濕重纖維素計算，稱適量DE-52加0.5mol/LNaOH浸泡30min，蒸餾水反復洗至中性；接著用0.5mol/LHCl浸泡30min,蒸餾水反復洗至中性；再用0.5mol/LNaOH浸泡30min，蒸餾水反復洗至中性，最后用0.01mol/L、pH7.4的PBS充分平衡過夜。U)裝柱裝柱前用真空泵抽去DE-52溶液中的氣泡，裝柱過程中不能產生氣泡，上樣前柱床用0.01mol/L、pH7.4的PBS平衡。(3)上樣用46mL的PBS將適量的粗IgG稀釋，然后沿柱臂緩慢加在柱床上表面，待樣品進入柱床后開始洗脫。(4)洗脫以0.01mol/L、pH7.4的PBS作洗脫液，流速0.5mL/min，收集第一和第二吸收峰。(5)收集液冷凍干燥，4"C保存。實施例4酶標板的制備用包被緩沖液(0.05MpH9.6碳酸鈉緩沖液)將氰戊菊酯抗原稀釋成l|ig/mL，每孔加入100(iL,37。C溫育2h并4。C過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次30秒，拍干，然后在每孔中加入150-200pL封閉液，37'C溫育2h，傾去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。實施例5氟戊菊酯殘留分析酶聯免疫吸附檢測試劑盒的組建本例中，試劑盒包含如下部分(1)包被氰戊菊酯抗原的酶標板(2)海綿支架(3)氰戊菊酯標準品(4)氰戊菊酯多克隆抗體(5)辣根過氧化物酶標羊抗兔抗體(6)濃縮洗滌液配方為氯化鈉8g、磷酸二氫鉀0.2g、磷酸氫二鈉3g、氯化鉀5g、吐溫-202mL、蒸餾水20mL。(7)顯色液A液配方過氧化脲lg，10.3g檸檬酸，35.8gNa2HP0412H20，吐溫-20100pL,蒸餾水1000mL,pH5。(8)顯色液B液配方四甲基聯苯胺(TMB)700mg(40mLDMSO溶解)，10.3g村檬酸，蒸餾水1000mL,pH2.5。實施例6試劑盒特異性實驗選擇常用II型菊酯類農藥甲氰菊酯(fenpropathrin)、溴氰菊酯(deltmethrin)、氟胺氰菊酯(fluvalinate)、氯氰菊酉旨(cypermethrin)和功夫菊酯(cyhalothrin)、為待測物，測得各種物質的抑制中濃度(IC5Q)，再用下式計算抗體對這些物質的交叉反應性；交叉反應率愈小，則抗體對氰戊菊酯的特異性愈強，反之則抗體的特異性差。交叉反應(CR%)=1<:5()(氰戊菊酯)/1(:5()(供試物^100%。實驗測定結果見表l,釆用間接ELISA法，多克隆抗體對常用11型菊酯類農藥的交叉反應均小于3%,說明該試劑盒的特異性好，ii可保證對樣品中氰戊菊酯殘留測定結果的可靠性。表1交叉反應<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>ni:所用被測物濃度為10mg/L時，抑制率小于10%實施例7回收試驗供試的自來水與井水水樣采自中國農業大學西校區，河水水樣采自北京巿小清河。添加氰戊菊酯的來源不同的水樣進行不同的前處理后進行酶聯免疫測定分析，結果見表2。表2水樣中氰戊菊酯的添加回收率Table2Recoveryoffenveleratefromthespikedwatersamplesbypretreatment<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權利要求1.一種檢測氰戊菊酯殘留的酶聯免疫吸附分析試劑盒，包括包被氰戊菊酯抗原的酶標板、濃縮洗滌液、氰戊菊酯標準品、氰戊菊酯特異性抗體、酶標記物、底物顯色液和反應終止液。2.根據權利要求l所述的試劑盒，其特征在于制備氰戊菊酯特異性抗體的免疫原為3-[(±)氰基[(CIS)2-[3-氯苯基]3-甲基丁羰基氧基]苯氧基]苯丙酸與載體蛋白的偶聯復合物。3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述氰戊菊酯抗原為3-[(士)氰基[(CIS)2-[3-氯苯基]3-甲基丁羰基氧基]苯氧基]苯丙酸與載體蛋白的偶聯復合物。4.根據權利要求l或2所述的試劑盒，其特征在于所述酶標記物為酶標記二抗。5.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述的濃縮洗滌液的配方為每20mL蒸餾水中加入有氯化鈉7~9g、磷酸二氫鉀0.1~0.3g、磷酸氫二鈉24g、氯化鉀36g、吐溫-200.53mL。6.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液包括A液和B液，所述A液為過氧化氫或過氧化脲、所述B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺、終止液為l~2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為細菌提取堿性磷酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩沖液、終止液為2mol/L的氫氧化鈉。7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述A液配方為每lOOOmL水中加入過氧化脲lg，10.3g檸檬酸，35.8gNa2HP(V12H20，吐溫-20lOO(aL，pH5;所述B液配方為每1000mL蒸餾水中加入四甲基聯苯胺700mg,10.3g檸檬酸，pH2.4-2.8。8.權利要求17任一項所述試劑盒在檢測氰戊菊酯殘留中的應用。全文摘要本發明提供了一種適用于氰戊菊酯殘留檢測的酶聯免疫吸附分析試劑盒，包括包被氰戊菊酯抗原的酶標板、濃縮洗滌液、氰戊菊酯標準品、氰戊菊酯特異性抗體、酶標記物、底物顯色液和反應終止液。本發明的優點是能準確靈敏地檢測水中氰戊菊酯殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠低于傳統的儀器檢測方法。文檔編號G01N33/543GK101526524SQ20081010154公開日2009年9月9日申請日期2008年3月7日優先權日2008年3月7日發明者季李,艇許,高宏斌申請人:中國農業大學