專利名稱：：磺胺甲噁唑單克隆抗體試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發明涉及獸藥殘留檢測分析
技術領域：
中一種檢測磺胺甲噁唑的酶聯免疫試劑盒及檢測方法。
背景技術：
：磺胺甲噁唑是應用廣泛的磺胺類抗生素之一，它有效地控制了動物疾病，促進動物生長，在降低動物源性病原菌排放改進公共衛生方面，發揮了及其重要的作用，取得了良好的經濟效益和社會效益；但長期和大劑量使用，使得磺胺藥在體內蓄積，造成藥物在人體和動物組織內殘留，從而潛在危害人體健康。人體中磺胺藥的蓄積會導致磺胺藥抗藥性的產生，且具有潛在的致癌、致突變性。因此，聯合國食品法典委員會(CAC)和許多國家規定，食品和飼料中磺胺甲噁唑等磺胺類物質單個含量均不得超過100ng/kg。檢測磺胺甲噁唑殘留量的方法主要有微生物法、儀器檢測法、免疫化學法。其中儀器檢測法包括熒光光度法、薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GM)、氣-質聯機法(GC/MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液-質聯機法(HPLC/MS)、毛細管電泳法(CE)等，由于復雜的儀器設備和繁瑣的過程，不適合現場監控和大量樣本篩査。發明創造內容本發明的目的是提供一種檢測磺胺甲噁唑的酶聯免疫試劑盒。本發明所提供的檢測磺胺甲噁唑的單克隆抗體試劑盒，包括磺胺甲噁唑特異性單抗、包被的磺胺甲噁唑與載體蛋白偶聯物和酶標二抗。其中，所述磺胺甲噁唑特異性抗體為磺胺甲噁唑單克隆抗體，為優選的磺胺甲噁唑鼠單克隆抗體，該單抗按常規方法制備；所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)、血蘭蛋白(KLH)等常用載體蛋白，所述磺胺甲噁唑與載體蛋白的偶聯物可通過將磺胺甲噁唑和載體蛋白用戊二醒法或重氮化法進行偶聯得到；所述標記酶可為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酯酶，優選為辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶可通過戊二醛法或過碘酸鈉法交聯在二抗上；所述二抗優選為抗鼠或抗兔抗抗體。為了更為方便現場監控和大量樣本篩查，上述試劑盒還包括磺胺甲噁唑標準溶液、顯色劑、顯色稀釋液、濃縮洗滌液、終止液。所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫，所述B液為四甲基聯苯胺(TMB)，所述顯色稀釋液為醋酸鈉溶液；所述濃縮洗滌液為0.05%-1.2%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述終止液為l-2mol/L的硫酸溶液。本發明的檢測原理為將磺胺甲噁唑與載體蛋白的偶聯物做為包被原吸附于固相載體上，加入樣品和磺胺甲噁唑單克隆抗體，加入酶標二抗，顯色后終止，測樣品吸光值，該值與樣品中磺胺甲噁唑殘留物含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出磺胺甲噁唑的含量，根據酶標板上樣品顏色的深淺能得出大致濃度范圍。本發明的檢測磺胺甲噁唑的酶聯免疫試劑盒主要采用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測動物組織、血清、尿樣、牛奶及飼料等樣品中磺胺甲噁唑的殘留量；對樣品前處理要求低、樣品前處理過程簡單、能同時快速檢測大批樣品；采用高特異性的磺胺甲噁唑單克隆抗體，主要試劑均以工作液形式提供，檢測方法簡便易行；具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點，將在食品和詞料磺胺甲噁唑殘留量的檢測中發揮重要作用。圖1為檢測磺胺甲噁唑的酶聯免疫試劑盒的結構示意圖圖2為磺胺甲噁唑標準曲線具體實施方式實施例1抗原及抗體的制備1.磺胺甲噁唑-載體蛋白偶聯物的制備(1)參照1999年FmakeM,etal.報道的方法合成SMZ-HSA全抗原，具體步驟如下首先取20mgSMZ加到300nl二甲基甲酰胺溶液中，再緩慢加到lml0.5mol/LH2SO4中，然后在磁力攪拌下將lmllmol/LNaN02緩慢加到SMZ溶液中，反應10min，形成重氮鹽。(2)磁力攪拌下，分別取100mgHSA和100mgOVA各加到4ml磷酸鹽緩沖液中。(3)將上述形成的重氮化鹽溶液在磁力攪拌下緩慢加到HSA溶液和OVA溶液中,用1MNaOH將pH維持在8-10，4。C反應lh;(4)將反應液放在生理鹽水中透析3d，每天更換2次生理鹽水，以除去未反應的小分子物質及SMZ等。(5)將橙色的SMZ-HSA和SMZ-OVA溶液分成兩部分，一部分于4'C下保存供紫外和液相測試用，另一部分于-20。C下保存。2.抗磺胺甲噁唑單克隆抗體的制備(1)免疫利用申請人所制備的磺胺甲噁唑-人血清白蛋白(HSA)偶聯物免疫Balb/C小鼠(購自中國軍事科學院實驗動物中心)，免試程序是選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠4只，體重18-22g，取免疫抗原100mg(以蛋白含量計算)，加等體積完全弗氏佐劑乳化，用注射器在安培瓶中反復抽吸攪拌，直至乳化藥液在水中呈不溶液滴(水包油狀態)。于Balb/C小鼠頸背部皮下多點注射進行一免，每只小鼠0.5ml;間隔兩周后，抗原量減半用弗氏不完全佐劑混合，方法同上，進行第二次免疫，再過兩周后，進行第三次免疫，方法同前次。三免后10d免疫鼠尾靜脈采血，通過間接ELISA方法測定免疫鼠血清抗體效價。選擇抗體效價較高者用于細胞融合，融合前二天給小鼠脾內注射含30嗎免疫抗原水劑進行加強免疫。(2)單抗制備免疫鼠眼眶取血后，脊椎脫臼處死，消毒后置于超凈工作臺上的消毒表面皿中，小心取出經免疫已腫大的脾臟，用DMEM培養基沖洗2次，每次3ml。經計數細胞共有5.6"08個，在37。C水浴中，將SP2/0細胞(由北京大學生命學院單抗室提供)和脾細胞按10:1比例混合于50ml離心管中，輕輕攪勻，1000rpm離心5min，棄上清，彈擊管底使細胞混勻成糊狀。將離心管置于37'C水浴中，吸管吸取37'C預熱的0.8ml50%PEG1500(購自Sigma公司)，將吸管插入離心管的底部，左手慢慢旋管，右手邊攪邊加，lmin內加完，將融合液緩緩吸入吸管中，保持0.5min，然后慢慢放出，lmin內完全放出，并于離心管中靜置lmin。靜置之后，立即沿管壁滴加5mlIDMEM不完全培養基(配方DMEM(袋裝)13.5g，青霉素鈉(注射用)10萬單位，硫酸鏈霉素(注射用)IO萬單位，NaHC033.7g，用重蒸水稀釋至1000ml，并用O.lmol/LNaOH或HC1調節pH為7.4)終止融合反應，邊加邊緩慢攪拌，前0.5min加入2ml，后0.5min加入3ml，然后在lmin內加完5ml。補加IDMEM培養基至40ml，1000rpm離心5min，棄上清。吸管吸取lmlHAT(配方20ml胎牛血清，lmlHAT,79mlDMEM配成100ml)選擇培養基后，插入離心管底部，邊輕輕攪拌邊加入，使細胞懸浮，不能吹，然后補加HAT至40ml，并輕輕混勻細胞，每孔O.lml加入已鋪好飼養細胞的96孔板中，共鋪4塊板。融合后隔日更換HAT培養液。融合3-4天后，可見有小量細胞克隆，在融合10天后，換用HT培養基(配方20ml胎牛血清，lmlHT'80mlDMEM配成1OOml)，大約在12-16天左右，雜交瘤細胞克隆生長至孔底1/4，采用間接ELISA檢測培養液上清中的特異性抗體，統計有雜交瘤細胞生長和陽性雜交瘤細胞生長的孔數，計算融合率和陽性率。采用磺胺甲噁唑-卵清蛋白作為篩選抗原，利用ELISA方法篩選出分泌抗磺胺甲噁唑的陽性孔。對篩選出來的陽性孔立刻用有限稀釋法按每孔10、5、2個細胞的比例，將細胞放入預先鋪好飼養細胞的培養板中培養。觀察克隆化細胞數目及狀態，并及時測定每孔上清液陽性，直至找到陽性的單克隆細胞株，最終篩選出分泌抗磺胺甲噁唑的單克隆雜交瘤細胞系，該細胞系編號為A-7-l，于2008年3月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號CGMCCNo.2411。對該細胞系進行染色體計數，結果顯示SP2/0骨髓瘤細胞的染色體數為36對，Balb/C小鼠脾臟細胞的染色體數為20對，而該雜交瘤細胞染色體數目為96-102條之間，可見本試驗所得的單克隆抗體細胞株的染色體數與兩親本細胞的染色體數之和基本相似，證明此細胞為兩親本細胞融合的產物。將該細胞系注射Balb/C小鼠腹腔，生產出單克隆抗體。采用購自Sigma公司的鼠單抗定型ImmunotypeTM試劑盒對本發明所得到的單克隆抗體進行亞型鑒定，結果為小鼠IgG,亞類。3、抗磺胺甲噁唑單克隆抗體的純化具體步驟如下4ml0.06mol/LpH4.8的HAc-NaAc緩沖液分為兩部分，大部分與lml腹水混合，并輕輕攪拌均勻；另有少量的HAc-Aac緩沖液與辛酸(共需辛酸33pL)混合成乳濁液。將辛酸乳濁液慢慢滴加入腹水溶液中，邊加邊輕輕攪拌，加完后持續攪拌30min,此時有大量的白色沉淀。室溫下12000rpm離心30min，留上清液棄掉沉淀，滴加等體積4°CpH7.4的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，用1.0mol/LNaOH溶液調pH為7.4，溶液析出大量沉淀，溶液4。C靜置2h后，4。C12000卬m離心30min。去上清，將沉淀溶解于0.01mol/LpH7.4PBS中，對PBS透析除鹽4次，最后抗體溶液中滴加0.02%NaN3，分裝置于-2(TC保存。測定蛋白濃度為8.25mg/ml。用MbaTrapTMG親和層析柱純化抗體，腹水經平衡緩沖液(PB，0.02mol/LpH7.0)適當稀釋后，上樣用于平衡緩沖液平衡好的MbaTarpTMG親和柱，用平衡緩沖液徹底洗去雜蛋白后，換洗脫液(Gly-HCI，0.01mol/L，pH2.7)將抗體洗下，洗下的抗體立即用中和緩沖液(Tris-HCI，lmol/L，PH9.0)中和，使pH恢復至7.0左右，以免失去活性。4、磺胺甲噁唑兔多克隆抗體的制備新西蘭大白兔3只，平均體重2.5kg，單籠飼養。首免取適量合成的免疫原，用滅菌生理鹽水稀釋后與等量的弗氏完全佐劑混勻，用無菌注射器充分乳化。每只兔子注射抗原量為lmg/mL，經背部皮內多點注射；二免和三免時將弗氏完全佐劑更換為弗氏不完全佐劑，頸背部皮下多點注射，三免后第7天，兔耳緣靜脈采lmL全血，取血清，用間接ELISA測定血清效價。效價達到要求后，進行加強免疫，加強免疫后第7天頸動脈采血。經飽和硫酸銨沉淀法得到純化的多克隆抗體。5、二抗的制備以羊作為免疫動物，以鼠或兔IgG為免疫原進行免疫，得到羊抗鼠或羊抗兔抗抗體實施例2檢測磺胺甲噁唑單克隆抗體試劑盒組裝1.磺胺甲噁唑單克隆抗體試劑盒的結構試劑盒的結構如圖l所示，主要包括l盒體，2鋁膜真空包裝96孔酶標板，3標準磺胺甲噁唑抗原，4酶結合物工作液，5磺胺甲噁唑單克隆抗體工作液，6顯色液A液，7顯色液B液，8顯色液稀釋液，9濃縮洗滌液，IO終止液，ll泡沬托架，泡沫托架上有凹孔，上述試劑瓶均放在凹孔內，泡沫托架和酶標板放在盒體內。其中酶標板由塑料支架和可拆分的塑料條組成。2.所用試劑的配制A標準磺胺甲嗞唑抗原磺胺甲噁唑標準溶液6瓶，其濃度范圍在l-1000Mg/L。B包被液PH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液。C封閉液10%的小牛血清。D濃縮洗滌液0.05°/。-1.2%吐溫的磷酸鹽緩沖液(0.01M,PH7.4)，是正常使用濃度的15倍，l瓶。E磺胺甲噁唑單克隆抗體工作液將抗體進行104倍稀釋使用，即含有0.3-30mg/L的磺胺甲噁唑鼠源單克隆抗體，6-10ml/瓶，l瓶。F酶結合物工作液酶標記抗鼠的抗抗體稀釋液，6-10ml/瓶，l瓶。G底物顯色液A液過氧化氫，6-10ml/瓶，l瓶。H底物顯色B液四甲基聯苯胺(TMB)lml/瓶，1瓶。I顯色液稀釋液0.2mol/L醋酸鈉溶液，10ml/瓶，1瓶。J終止液l-2M硫酸溶液，6-10ml/瓶，l瓶。3.酶標板的制備磺胺甲噁唑和卵清蛋白偶聯物包被的酶標板，制備方法如下用包被緩沖液將磺胺甲噁唑和卵清蛋白偶聯物稀釋成lug/ml，每孔100yl，4'C過夜，倒去包被液，用洗滌液洗三次，每次3min，拍干，然后每孔中加200ul封閉液，37'C溫育2h，倒去孔內液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。4.酶標二抗的制備用改良的過碘酸鈉法來標記辣根過氧化物酶。實施例3檢測樣品中殘留的磺胺甲噁唑l.樣品前處理(1)豬尿的預處理將供試尿液3000卬ra離心lOmin，取上清液體蒸干或在氮氣流中吹干，用lml0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)(配方NaC18g,KC10.2g，Na2HPO4'12H2O2.9g,KH2PO40.2g)溶解殘留物。(2)牛奶樣品的預處理牛奶樣品經3500rpm離心10min，取3ml加入6ml乙酸乙酯上下振蕩10min，室溫3000rpm離心10min，取2ml上層液體蒸干或在氮氣流中吹干，用lml0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。(3)組織樣品的預處理將待檢組織樣品勻漿，取3g待檢組織樣品加入6ml乙酸乙酯上下振蕩10min，室溫3000rpm離心10min，取2ml上層液體蒸干或在氮氣流中吹干，用lml0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。(4)雞蛋樣品的預處理吸取3ml蛋黃加入6ml乙酸乙酯上下振蕩10min，室溫3000rpm離心10min，取2ml上層液體蒸干或在氮氣流中吹干，用lml0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。(5)飼料樣品的預處理稱取飼料lg，加甲醇-水溶液，超聲波提取30min，取3ml上層液氮氣吹干，用lml0.01MpH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解殘留物。2.檢測方法；(1)向96孔酶標板各孔中預孵育30min的樣品或孵育30min的不同濃度標準抗原5(^1然后加磺胺甲噁唑單克隆抗體工作液5(Hi1，37'C孵育30min，洗滌三次，拍干。(2)加酶標二抗每孔加入5000^羊抗鼠酶標二抗100pl,37T:孵育30min，洗滌五次，拍干。(3)加底物加底物溶液，每孔100nl，室溫放置5min。(4)終止反應加終止液5(V1,輕輕振蕩混勻。(5)讀數酶標儀測定每孔的吸光光度值(OD值)。3.結果分析(1)計算每個標準樣品，待測樣和參照樣的OD450值。(2)以標準樣品的濃度為X軸，以抑制率為Y軸作圖，此圖為線性圖，其中，抑制率=(參照OD450-待測OD450)/參照孔x100。/。(3)利用標準曲線計算出待測樣品中的抗原量如圖2所示。相對應的每個樣品的濃度可以從標準曲線上讀出，也可以用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度，利用計算機專業軟件，更利于大批量樣品的快速分析。根據酶標板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的標準溶液顏色的比較，可判斷出樣品濃度大致范圍。實施例4試劑盒的靈敏度，特異性，精密度的測定和保存期實驗(1)靈敏度的測定最低檢測限的定義有多種，本試驗采用抑制率的10%表示最低檢測限。根據試驗結果，確定最低檢測限為10ng/mL。(2)特異性的測定選擇7種磺胺藥物，將不同濃度的磺胺藥代替SMZ標準溶液，測定其標準曲線，并計算抑制濃度，計算交叉反應率。公式交叉反應率=50%抑制的SMZ濃度/50%競爭物濃度X100%。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>圖中結果表明，試劑盒對其他7中磺胺藥的交叉反應率均低于0.1%，說明該試劑盒針對磺胺甲噁唑特異性很高，可保證對動物食品及飼料中磺胺甲噁唑殘留檢測結果的可靠性。(3)精密度試驗精密度又可稱為可重復性，反映測定方法對某一特定樣本的多次測定所得結果的重復程度，這是質量評價的基本參數，可以用變異系數表示。板內變異系數從眾多的樣品中隨機抽取6個樣本按照試劑盒檢測模式進行檢測，每個樣本8個重復。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>板間變異系數:本試驗共選擇5塊板，每塊板3個重復。隨機抽取2個樣品進行板間變異系數的檢測。樣品酶標板123'45NO.70.42'10.4100.4200.420NO.70.'1180.3750.3790.'Ill0.他肌70.4380.4080.4390.4000.380Ms3110.42670.4010.41570.41030.柳平均依:0.41342標準港0.02186變異系數5.1$NO.80.8230.8350.7910.7790.795肌80.7970.8080.7860.7890.813肌80.8310.7820.807.0.7920.802Ms3n0.8170.80830.79670.7900.8033f-均但:0.80818:0.01892變異系數2.3%_總的板問變異系數3.7%_(4)保存期實驗試劑盒保存條件為2-8°C，經過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值、磺胺甲噁唑添加實際測定值、50%濃度均在正常范圍之內。同時做加速老化試驗，將試劑盒放在37'C狀態下6天，測定結果表明試劑盒各項指標完全符合要求，再將試劑盒放入-2(TC冷凍6天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得到試劑盒可以在2-8'C至少可以保存6個月以上。盡管本發明的內容是結合本實施例進行說明，但是不能認為是對本發明范圍的限制，本發明的范圍由所附權利要求書限定。另外，本領域的技術人員在所附權利要求書限定的范圍內對本發明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發明的保護范圍。權利要求1.一種檢測磺胺甲噁唑的酶聯免疫試劑盒，包括磺胺甲噁唑特異性抗體、包被了抗原的固相載體、磺胺甲噁唑標準溶液、酶結合物工作液、顯色劑、顯色劑稀釋液、濃縮洗滌液、終止液；所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液，所述顯色液A液為過氧化氫，所述B液為四甲基聯苯胺(TMB)；所述顯色稀釋液為醋酸鈉溶液；所述洗滌液為0.05％-1.2％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液；所述終止液為1-2M的硫酸溶液；所述包被抗原過程中所用的包被緩沖液為PH9.6的碳酸鹽緩沖液，所用的封閉液為10％小牛血清。2.根據權利要求1所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于所述磺胺甲噁唑特異性抗體為磺胺甲噁唑單克隆抗體。3.根據權利要求1或2所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于所述二抗為抗鼠或抗兔抗抗體。4.根據權利要求1，2或3所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于所述的酶結合工作液是通過改良的過碘酸納法來標記辣根過氧化物酶。全文摘要本發明公開了一種檢測磺胺甲噁唑的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。本發明所提供的檢測磺胺甲噁唑的酶聯免疫試劑盒，包括磺胺甲噁唑特異性單抗及包被的磺胺甲噁唑與載體蛋白的偶聯物和酶標二抗。該單克隆抗體由雜交瘤細胞系(保藏號為CGMCCNo.2411)所分泌得到的。本發明的的檢測磺胺甲噁唑的酶聯免疫試劑盒能同時快速檢測大批樣品；主要試劑以工作液形式提供，檢測方法方便易行；具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點，將在動物性食品和飼料磺胺甲噁唑殘留量的檢測中發揮重要作用。文檔編號G01N33/543GK101275947SQ20081009741公開日2008年10月1日申請日期2008年5月26日優先權日2008年5月26日發明者吳國娟,吳紅軍,張中文,紅沈,王彥英,王星星,瑋郭,彥陸申請人:北京農學院