專利名稱：肺吸蟲病檢測裝置及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測裝置，特別涉及一種肺吸蟲病檢測裝置及其制備方法。
背景技術：
肺吸蟲病(Paragonimiasis )是一種常見和重要的人獸共患寄生蟲病，主 要流行于亞洲、非洲和拉丁美洲，尤以亞洲地區多見，在我國流行于22個省、 市、自治區，估計每年感染者約200萬之多，嚴重危害人類健康，尤其是青少 年、兒童的健康。肺吸蟲病主要是肺吸蟲蟲體(幼蟲或成蟲)在人體組織與器官內移行、寄 居造成的機械性損傷，及其代謝物等引起的免疫病理反應。在我國，致病蟲種 主要為衛氏肺吸蟲和斯氏肺吸蟲，其成蟲寄生于人、犬、果子貍等肉食動物的 肌肉和器官如肝、肺中；尤其斯氏肺吸蟲作為僅在我國流行的一種吸蟲，其在 人體內不能發育成熟，而以幼蟲在人體內移行、竄擾，常常引起游走性皮下包 塊或結節，腦占位性病變和內臟損傷等肺外型寄生蟲表現，造成多器官、組織 的損害。肺吸蟲病根據肺吸蟲寄生部位不同，出現復雜的病理變化和多種多樣 的臨床表現，臨床癥狀不典型，易與其他疾病混淆，誤診率極高。對于感染早 期、低度感染及肺外型肺吸蟲病患者，以發現蟲卵或蟲體的病原學檢測方法往 往難以獲得檢測結果，因此，肺吸蟲病的診斷和鑒別診斷在很大程度上需依賴 于免疫學^f企測。目前，用于肺吸蟲病的免疫學檢測方法種類較多，包括抗體檢測方法如皮 內試驗(IT)、補體結合試驗(CFT)、間接血凝試驗(IHA)、對照免疫電泳試驗 (CIEP)、免疫熒光試驗(IFAT)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等；以及抗原檢測方法如多克隆或單克隆抗體ELISA法等。抗體檢測方法敏感性高，但因治愈后 抗體在體內仍可維持較長時間，致使療效考核效果不理想，尤其在疫區反復感 染人群中無法區別是現行感染還是既往感染；抗體檢測中使用的抗原，如蟲體 抗原、排泄分泌抗原等，均為粗抗原，易出現同源吸蟲間交叉反應，并嚴重依 賴于蟲體來源的成分；各實驗室的檢測抗原制備不一致，導致無法對檢測結果 進行比較等問題。此外，循環抗原(CAg)檢測，即對蟲體的代謝產物及腺體分 泌液、子宮液、脫落的蟲體皮層表膜等抗原性物質的檢測，方法特異性高，能 反映感染蟲荷；因CAg出現較抗體產生為早，有早期檢測價值；而且經有效治療 使蟲體死亡后抗原消失快，可用于確診和(或)療效考核，但其不足之處在于 敏感性較低，并受多種因素干擾。這一現狀嚴重影響了臨床上肺吸蟲感染的早 檢測、早預防、早治療，限制了人肺吸蟲感染的流行病學調查研究。因此，篩 選一種高度特異、敏感的用于肺吸蟲病的單一檢測抗原成分，并制成肺吸蟲病 檢測裝置，準確、快速、簡便地進行肺吸蟲病的診斷與鑒別診斷、以及療效考 核具有重要意義及廣闊的應用前景。發明內容有鑒于此，為了解決現有肺吸蟲病免疫學才企測方法中抗體檢測法存在的療 效考核效果不理想、有交叉反應干擾、以及無法對各實驗室的檢測結果進行比 較等技術問題，發明人采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE )、 雙向凝膠電泳(2-DE)、蛋白免疫印跡(Western Blotting)、質i普等技術對 肺吸蟲的成蟲、幼蟲及嚢坳期的蟲體蛋白進行分析，識別出蟲體排泄分泌物中 能用于免疫檢測的特異性抗原，通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)獲得其 編碼基因片段(Genbank登錄號為AY083923 )，根據所得序列推導的多肽由165 個氨基酸組成，命名為肺吸蟲排泄分泌蛋白(Excretory-secretory protein, ESP),制備該蛋白并經動物免疫制備出特異性抗體，再進一步制得肺吸蟲病檢 測裝置。本發明的目的在于，提供一種肺吸蟲病檢測裝置，包括標記墊、檢測層，標記墊中含有經標記的4企測抗原，所述檢測抗原為氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示的肺吸蟲ESP蛋白；進一步，所述標記墊中含有經膠體金標記的檢測抗原；進一步，所述檢測層7上包被有抗人IgG抗體形成的檢測線8和抗肺吸蟲 ESP蛋白的多克隆抗體形成的質控線9;進一步，所述包被有檢測線8和質控線9的檢測層7貼附于背板10上，樣 品墊1、標記墊3及吸收墊5順序貼附于檢測層7上，蓋板6扣蓋在貼附有樣 品墊1、標記墊3及吸收墊5的檢測層7上；所述蓋板6上設有加樣孔2和觀 察孔4。本發明的另一目的在于，提供所述肺吸蟲病檢測裝置的制備方法，包括以 下步驟a. 肺吸蟲ESP蛋白的制備肺吸蟲ESP蛋白的氨基S^列如SEQ ID No. 2 所示，其編碼基因序列如SEQ ID No. l所示，根據氨基酸或核香酸序列制備， 即得肺吸蟲ESP蛋白；b. 抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體的制備用肺吸蟲ESP蛋白于哺乳動物 的肌肉或皮下注射進行多次免疫，收集被免疫動物的血液，分離血清，即得抗 肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體；c. 標記墊的制備用標記物對肺吸蟲ESP蛋白進行標記，制得標記的肺吸 蟲ESP蛋白；將玻璃纖維素膜置濃度為0. 01 mol/L、 pH值為8. 2的磷酸鹽緩沖 液即PBS緩沖液中浸泡30分鐘，于溫度為37。C條件下烘干，再將上述標記的 肺吸蟲ESP蛋白溶液均勻地鋪在玻璃纖維素膜上，0.5 ml/mm2，冷凍干燥，即 得標記墊；d. 檢測層的制備將硝酸纖維素即NC膜置濃度為0. 01-0. 05 mol/L、 pH 值為8.0-8.2、含有質量百分濃度為1%的牛血清白蛋白即BSA、質量百分濃度 為1°/ 的吐溫-20的PBS緩沖液中浸泡30分鐘，于溫度為37。C的條件下烘干； 用抗體稀釋液即濃度為0. 01 mol/L、 pH值為8. 0-8. 2、含有質量百分濃度為1% 的BSA的PBS緩沖液，對濃度為1 mg/ml的抗人IgG抗體溶液、濃度為1 mg/ml的抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體溶液分別進行1: 500-1: 1000稀釋；將稀釋 后的抗人IgG抗體溶液、抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體溶液，用點膜儀以每 厘米2-3 pl體積分別噴到NC膜上，形成檢測線和質控線；包被有檢測線和質 控線的NC膜經真空干燥后，用濃度為0.01 mol/L、 pH值為8.8-9.0、含有質 量百分濃度為1%的BSA的PBS緩沖液封閉2小時，再用濃度為0. 01 mol/L、 pH值為8. 8-9. 0的PBS緩沖液洗滌，真空干燥，即得檢測層；e. 樣品墊的制備將吸水濾紙置濃度為0. 01 mol/L、 pH值為7. 2的PBS 緩沖液中浸泡30分鐘，于溫度為37。C條件下烘干，即得樣品墊；f. 吸收墊的制備取吸水濾紙，即得吸收墊；g. 檢測裝置的制備將包被有檢測線8和質控線9的檢測層7貼附于背板 10上，樣品墊l、標記墊3及吸收墊5順序貼附于檢測層7上，蓋板6扣蓋在 貼附有樣品墊1、標記墊3及吸收墊5的檢測層7上；蓋板6上設有加樣孔2 和觀察孔4，即得;險測裝置；進一步，所述步驟a中肺吸蟲ESP蛋白的制備采用以下方法 以斯氏貍殖吸蟲成蟲總RNA為模板，采用如下筒并引物上游引物5，-TCA (AG) GG (AGCT) CA ( AG ) TG ( CT ) GG ( AGCT ) TC ( AGCT ) TG ( CT ) TGG-3,、 下游引物5，-CCA ( AG ) CT ( AG ) TT ( CT ) TT ( AGCT ) AC ( AG ) ATCCA (AG ) TA-3，， 進行逆轉錄聚合酶鏈式反應，得到肺吸蟲ESP蛋白的編碼基因片段，再將所得 編碼基因片段與pQE-80L表達載體進行TA連接，轉化入BL21大腸桿菌感受態 細胞，用含氨千青霉素的LB平板進行篩選培養，將陽性宿主菌接種于含氨節青 霉素的液體LB培養基中培養，用異丙基硫代半乳糖苷即IPTG誘導表達后，超 聲破碎，離心收集上清液，以Nr-NTA樹脂親和層析法進行純化，即得肺吸蟲 ESP蛋白；進一步，所述步驟b中抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體的制備采用以下方法將1 mg/ml肺吸蟲ESP蛋白溶液與弗氏完全佐劑(Freund，s complete adjuvant, FCA)或弗氏不完全佐劑(Freund，s incomplete adjuvant, FIA)等體積混合，充分乳化，制備肺吸蟲ESP蛋白免疫抗原，免疫雄性新西蘭白兔； 免疫步驟如下初次免疫，以弗氏完全佐劑免疫抗原于家兔后腿、腹部皮下多 點注射，每只1 ml;間隔l-2周，第二次免疫，以弗氏不完全佐劑免疫抗原于 家兔后腿肌肉或背部皮下多點加強免疫，每只lml;之后連續免疫2次，每次 間隔2周，免疫成分、劑量、途徑同第二次免疫；第四次免疫后5-7天，對經 瓊脂雙擴散試驗測定抗體效價達1 : 32以上的家兔，頸動脈》文血，離心分離血 清，血清經飽和硫酸銨溶液沉淀、透析，即得抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體；進一步，所述步驟c中標記墊的制備采用以下方法用三蒸水溶解氯金酸，制成O. lg/L溶液，置沸水浴中煮沸，按4: l的比 例加入質量百分濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，于沸水浴中快速攪拌，直至溶液 呈穩定的紅色，繼續于沸水浴中加熱10分鐘，冷卻至室溫后補足失水，檢測 顆粒均勻度及粒度；取均勻的粒度為15-20 nm的膠體金100 ml，用碳酸鉀溶 液調pH值至8. 8-9. 0,于室溫、快速攪拌條件下緩慢加入濃度為1. 5-2. 0 mg/ml 的肺吸蟲ESP蛋白溶液3-5 ml，繼續攪拌10-15分鐘，加入BSA至最終質量百 分濃度為1-2%,再攪拌10-15分鐘；所得溶液于4000 r/min離心20分鐘，棄 沉淀，上清液以10000 r/min離心60分鐘，棄去上清液，沉淀用濃度為0.01 mol/L、 pH值為8. 0-8. 2、含有質量百分濃度為1-2%的BSA的PBS緩沖液洗滌， 再用濃度為0. 01 mol/L、 pH值為8. 2、含有質量百分濃度為1%的BSA、質量百 分濃度為0. 02°/。的疊氮化鈉的PBS緩沖液5-10 ml重懸，制得膠體金標記的肺 吸蟲ESP蛋白溶液；將玻璃纖維素膜置濃度為0. 01 mol/L、 pH值為8. 2的PBS 緩沖液中浸泡30分鐘，于溫度為37。C條件下烘干，再將上述膠體金標記的肺 吸蟲ESP蛋白溶液均勻地鋪在玻璃纖維素膜上，0.5 ml/mm2，冷凍干燥，即得 標記墊。本發明所述肺吸蟲病檢測裝置，與肺吸蟲病免疫4企測常用的ELISA法比 較，主要具有以下優點(l)具有高度特異、敏感性，肝吸蟲病、血吸蟲 病的交叉反應干擾小，假陽性率低于ELISA法，可用于肺吸蟲病的診斷與鑒 別診斷；(2)具有療效考核的作用，在肺吸蟲病患者經有效藥物治療后3-6月，檢測結果將轉陰，轉陰率高于ELISA法，可用于肺吸蟲病的療效考核；(3) 使用經過純化的單一抗原蛋白，不依賴于蟲體來源的成分，可對各實驗室的檢 測結果進行比較；(4)無需任何特殊儀器，可用于現場操作；(5)方法簡便， 為一步反應，不需由專業人員操作；(6)檢測快速，IO分鐘以內可獲結果；(7) 檢測成本低；(8)檢測過程對人體無危害，對環境無污染；(9)貯存方便，對 溫度要求不高，置4。C下有效保存期可達12個月，在室溫下可保存6個月。本發明的其他優點、目標，和特征在某種程度上將在隨后的說明書中進 行闡述，并且在某種程度上，基于對下文的考察研究對本領域技術人員而言 將是顯而易見的，或者可以從本發明的實踐中得到教導。本發明的目標和其 他優點可以通過下面的說明書和權利要求書來實現和獲得。
為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖和優 選實施例對本發明作進一步的詳細描述，其中圖1為肺吸蟲ESP蛋白編碼基因RT-PCR擴增產物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為雙酶切陽性克隆質粒的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3為重組表達載體pQE-8 0L/ESP的定向構建流程圖；圖4為大腸桿菌誘導表達產物的SDS-PAGE圖；圖5為肺吸蟲病檢測裝置的剖面圖；圖6為檢測線陽性結果原理圖；圖7為質控線原理圖；圖8為肺吸蟲病檢測裝置檢測結果圖。
具體實施方式
下面參照優選實施例對本發明進行詳細的描述。應當理解，下面的優選 實施例僅為了說明本發明，而不是為了限制本發明的保護范圍。 一、肺吸蟲病檢測裝置的制備1、肺吸蟲ESP蛋白的制備a. 引物的設計與合成根據吸蟲半胱氨酸蛋白酶M酸保守序列，設計并合成如下簡并引物 上游引物:5' -TCA ( AG) GG (AGCT) CA (AG) TG (CT) GG (AGCT) TC (AGCT) TG ( CT ) TGG-3';下游引物5' -CCA ( AG ) CT ( AG ) TT ( CT ) TT ( AGCT ) AC ( AG ) ATCCA ( AG ) TA-3';b. 肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的RT-PCR擴增取2條斯氏貍殖吸蟲成蟲(共60 mg)，用Tripure試劑(美國Roche 7> 司)于冰浴下勻漿，按照Tripure試劑說明提取蟲體總RNA;以提取的蟲體總RNA為模板，利用RT-PCR試劑盒(北京博大泰克生物基因技 術有限責任公司)進行逆轉錄及cDNA擴增以01igo(dT),6為引物進行逆轉錄為 cDNA時，37。C水浴2小時，95。C熱變性5分鐘；以步驟a所述簡并引物進行PCR 擴增雙鏈cDNA時，94。C預變性5分鐘，然后94。C l分鐘、43°C 2分鐘、72°C 2 分鐘，共45個循環，最后72'C 5分鐘；PCR結束后，采用質量百分濃度為1%的瓊 脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果如圖l所示，其中1泳道為PCR分子量標準，2 泳道為PCR產物，從圖可知，在約50G bp的位置出現一條特異性DNA條帶，與理 論預測值相符；利用Silver Beads DM膠純化回收試劑盒(上海生物工程技術服務有限 公司)對PCR產物進行純化，按照試劑盒說明操作，選擇約500 bp的目的片段 進行切膠回收純化；c. 肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的克隆進行TA連接，轉化入CaClr法制備的DH5oc大腸桿菌感受態細胞，并涂布在藍 白斑篩選培養基平板上，挑取白色菌落，接種到含氨節青霉素的液體LB培養基 中，于溫度為37°C、 150 r/min振搖過夜，石威裂解法小量提取質粒，用PCR方 法(以質粒為模板，采用步驟b所述PCR反應條件進行PCR擴增)和AcoR I 、Hind III雙酶切鑒定陽性克隆質粒；d. 陽性克隆質粒序列測定取步驟c所得陽性克隆質粒，委托上海生物工程技術服務有限公司測定插 入片段的序列，獲得495bp的cDNA序列(如SEQ ID No. 1所示)，在Genbank 中進行注冊，登錄號為AY083923;根據所得序列，用DNASIS程序推導出其編 碼的氨基酸序列(如SEQ ID No. 2所示)；e. 肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的PCR擴增依據肺吸蟲ESP蛋白的基因序列，結合pQE-80L表達載體上的內切酶位點， 設計表達引物，并在上游引物引入勘/z^I酶切位點(下劃線部分)，在下游引物 引入"'/^/ III酶切位點(下劃線部分)，同時在5，末端添加相應的酶切保護堿基上游引物，5，-CGGGATCCCAAGGTCAATGTGGCTC-3，;下游引物，5，-CCAAGCTTGATTGTTAAAAATAGTTGG-3，;利用上述表達引物，以步驟c所得陽性克隆質粒為模板，采用步驟b所述 PCR反應條件進行PCR擴增，切膠回收，純化PCR產物，按照步驟c所述再次 進行TA克隆，并經測序鑒定；f. 肺吸蟲ESP蛋白重組表達載體的構建及陽性克隆的篩選將步驟e測序鑒定后的陽性克隆質粒用勘/W I和"'/7d/ III進行雙酶切，雙 酶切產物用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，結果如圖2所示，其中1泳道為雙酶切 產物，2泳道為DNA分子量標準，從圖可知，酶切后得到兩條帶，其中一條約 500 bp,與目的片段大小一致；切膠回收純化該片段，并在T4DM連接酶的作 用下，與經勘/W I和III雙酶切消化后的pQE-80L載體(德國Qiagen乂^ 司)相連接，將連接產物轉化入CaCl2法制備的BL21大腸桿菌感受態細胞，用 含氨節青霉素的LB平板進行篩選培養，從LB平板上隨機挑取3個白色菌落， 接種于液體LB培養基中，于溫度為37。C、 150r/min振搖過夜，堿裂解法小量 提取質粒，以質粒為才莫板，采用步驟b所述PCR反應條件進行PCR擴增，瓊脂 糖凝膠電泳鑒定有無插入片段后，再通過序列測定確保插入方向正確；測序結 果表明實驗獲得的質粒為含有肺吸蟲ESP蛋白編碼基因的重組質粒；重組表達載體pQE-80L/ESP的定向構建流程如圖3所示；g. 肺吸蟲ESP蛋白的誘導表達挑取步驟f經測序鑒定的陽性克隆菌落，同時設pQE-80L空載體轉化菌落 和BL21空菌抹菌落為對照，接種于含氨節青霉素的液體LB培養基中，于溫度 為37°C、 150 r/min振搖過夜，取3 ml過夜培養菌液接種于300 ml含氨千青 霉素的液體LB培養基中，于溫度為37°C、 200 r/min振搖培養l小時，加入 濃度為200 mmol/L的IPTG誘導劑300 ^tl，繼續培養5小時，收集全部菌液， 9 000 g離心5分鐘，去除上清液，沉淀用等體積的濃度為0.01 mol/L、 pH 值為7. 2的PBS緩沖液洗滌3次后，用5倍體積的細菌裂解液重懸，水浴超聲， 條件為超聲5秒間隔5秒，重復50次，功率200 W;取超聲后的勻漿物，離心， 分別收集沉淀和上清液，用SDS-PAGE凝膠電泳檢測目的蛋白的表達情況，結果 如圖4所示，其中1泳道為誘導表達菌林，2泳道為未誘導菌抹，3泳道為空載 體菌抹，4泳道為蛋白質分子量標準，從圖可知，肺吸蟲ESP蛋白被BL21大腸 桿菌在IPTG誘導下高效表達，表達產物分子量大小為22 kDa，與預計大小相 一致；h. 肺吸蟲ESP蛋白大腸桿菌表達產物的純化將超聲勻漿后的離心上清液，利用載體C末端引入的6個His tag標簽， 以Ni2+-NTA樹脂(德國Qiagen公司)親和層析法純化目的蛋白，按照說明書中 所述步驟進行純化，即制得肺吸蟲ESP蛋白，置4。C保存；2、抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體的制備將1 mg/ml肺吸蟲ESP蛋白溶液與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑等體積 混合，充分乳化，制備肺吸蟲ESP蛋白免疫抗原，免疫雄性新西蘭白兔；免疫 步驟如下初次免疫，以弗氏完全佐劑免疫抗原于家兔后腿、腹部皮下多點注 射，每只lml;間隔2周，第二次免疫，以弗氏不完全佐劑免疫抗原于家兔后 腿肌肉或背部皮下多點加強免疫，每只1 ml;之后連續免疫2次，每次間隔2 周，免疫成分、劑量、途徑同第二次免疫；第四次免疫后7天，對經瓊脂雙擴 散試驗測定抗體效價達1 : 32以上的家兔，頸動脈i文血，離心分離血清，血清透析，即制得抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體，置-20x:冷凍保存；3、 標記墊的制備用三蒸水溶解氯金酸，制成O. lg/L溶液，置沸水浴中煮沸，按4: l的比 例加入質量百分濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，于沸水浴中快速攪拌，直至溶液 呈穩定的紅色，繼續于沸水浴中加熱10分鐘，冷卻至室溫后補足失水，檢測 顆粒均勻度及粒度；取均勻的粒度為20 nm的膠體金100 ml ，用濃度為0. 2 mol/L 的碳酸鉀溶液調pH值至9. 0，于室溫、快速攪拌條件下緩慢加入濃度為2. 0 mg/ml的肺吸蟲ESP蛋白溶液5 ml,繼續攪拌10分鐘，加入BSA至最終質量 百分濃度為1%,再攪拌IO分鐘；所得溶液于4000 r/min離心20分鐘，棄沉 淀，上清液以10000 r/min離心60分鐘，棄去上清液，沉淀用濃度為0. 01 mol/L、 pH值為8. 2、含有質量百分濃度為1%的BSA的PBS緩沖液洗滌2次，再用濃度 為0. 01 mol/L、 pH值為8. 2、含有質量百分濃度為1°/。的BSA、質量百分濃度為 0. 02%的疊氮化鈉的PBS緩沖液10 ml重懸，制得濃度為5 ^g/ml的膠體金標記 的肺吸蟲ESP蛋白溶液；將玻璃纖維素膜置濃度為0.01 mol/L、 pH值為8.2 的PBS緩沖液中浸泡30分鐘，于溫度為37。C條件下烘干，再將上述膠體金標 記的肺吸蟲ESP蛋白溶液均勻地鋪在玻璃纖維素膜上，0. 5ml/mm2，冷凍干燥， 置4'C保存備用；4、 才企測層的制備將NC膜置濃度為0. 01mol/L、pH值為8. 2、含有質量百分濃度為1%的BSA、 質量百分濃度為1°/ 的吐溫-20的PBS緩沖液中浸泡30分鐘，于溫度為37。C的 條件下烘干；用抗體稀釋液即濃度為0. 01 mol/L、 pH值為8. 2、含有質量百分 濃度為1°/。的BSA的PBS緩沖液，對濃度為1 mg/ml的兔抗人IgG抗體溶液、濃 度為1 mg/ml的兔抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體溶液分別進行1: 1000稀釋； 將稀釋后的兔抗人IgG抗體溶液、兔抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體溶液，用 Bio-dot ZX1000點膜〗義(BioDot/^司)的氣動噴頭(AIR-JET)以每厘米3 pl 體積分別噴到NC膜上，形成檢測線和質控線，檢測線距標記墊5 mm，質控線距吸收墊12mm，兩線距離7mm;包被有檢測線和質控線的NC膜經真空干燥后， 用濃度為0. 01 mol/L、 pH值為9. 0、含有質量百分濃度為1%的BSA的PBS緩沖 液封閉2小時，再用濃度為0. 01 mol/L、 pH值為9. 0的PBS緩沖液洗滌，真 空干燥，置4'C保存備用；5、 樣品墊的制備將吸水濾紙置濃度為0. 01 mol/L、 pH值為7. 2的PBS緩沖液中浸泡30分 鐘，于溫度為37。C條件下烘干，置4。C保存備用；6、 吸收墊的制備 取吸水濾紙，備用；7、 檢測裝置的制備如圖5所示，將寬5 mm、長80 mm、包被有4企測線8和質控線9的4企測層 7貼附于背板10上，再將寬5隱、長分別為25隱、8 mm、 30 mm的樣品墊l、 標記墊3及吸收墊5順序貼附于檢測層7上，蓋板6扣蓋在貼附有樣品墊1、 標記墊3及吸收墊5的^r測層7上，蓋板6上設有加樣孔2和觀察孔4，即得。二、肺吸蟲病4企測裝置的4企測方法1、才企測原理以膠體金標記的肺吸蟲ESP蛋白作為檢測抗原，以抗人IgG抗體為檢測線， 抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體為質控線，利用免疫滲濾技術來檢測樣品中是 否含有抗肺吸蟲IgG抗體。檢測時，若樣品中含有抗肺吸蟲IgG抗體，其先和 膠體金標記的肺吸蟲ESP蛋白結合，形成抗原-抗體復合物；由于毛細管作用， 反應復合物沿NC膜向前泳動，到達檢測線時，遇到包被在NC膜上的抗人IgG 抗體，就會形成如圖6所示的，膠體金標記的肺吸蟲ESP蛋白-抗肺吸蟲IgG 抗體-抗人IgG抗體復合物，從而富集在檢測線上，形成紫紅色沉淀線；未結合 抗肺吸蟲IgG抗體的膠體金標記的肺吸蟲ESP蛋白則通過;^測線，形成如圖7 所示的，抗原-抗體復合物，富集在質控線上，形成紫紅色沉淀線，判為陽性結 果；若樣品中不含有抗肺吸蟲IgG抗體，不能與膠體金標記的肺吸蟲ESP蛋白 結合，到達檢測線時，就不會形成如圖6所示的復合物，而未結合抗肺吸蟲IgG抗體的膠體金標記的肺吸蟲ESP蛋白通過檢測線，富集在質控線上，形成紫紅 色沉淀線，判為陰性結果。2、 ；險測方法取出檢測裝置，在加樣孔內加入待測血清15-20 放置約5-10分鐘， 觀察結果。3、 結果判定結果判定見圖8, A為陽性結果；B為陰性結果。當檢測條出現肉眼可見的 紫紅色質控線，同時出現肉眼可見的紫紅色檢測線，結果判為陽性，記為"+ "; 檢測線顏色越深，說明被檢測樣品的抗體水平越高；當檢測條出現肉眼可見的 紫紅色質控線，沒有出現肉眼可見的紫紅色檢測線，結果判為陰性，記為"-"; 當檢測條沒有出現肉眼可見的紫紅色質控線，不管是否出現肉眼可見的紫紅色 檢測線，結果都判為;f企測條失效，應廢棄。三、肺吸蟲病檢測裝置的鑒定1、特異性方法采用本發明所述裝置對肺吸蟲病患者、肝吸蟲病患者、血吸蟲病 患者和健康者血清進行;險測，并與ELISA法進行比較；ELISA法為常規方法， 即將抗原包被于PVC條板，取待測血清IO 加PBS緩沖液90 于溫 度為37。C條件下孵育30分鐘，洗滌3次，加入辣根過氧化物酶(HRP)標 記的第二抗體，于溫度為37。C條件下作用30分鐘，洗滌3-5次，3，3，5，5-四曱基聯苯胺(TMB)顯色，用酶標儀測OD值，待檢孔OD值大于陰性對照 2. 1倍者為陽性。結果見表l。本發明所述裝置和ELISA法檢測肺吸蟲病患者血清抗體 的陽性率分別為96.5% ( 55/57 )和100.0% ( 57/57 )，兩法間差異無顯著性 (尸〉0.05);采用本發明所述裝置檢測肝吸蟲病患者血清、血吸蟲病患者 血清和健康者血清，除血吸蟲病患者血清的交叉反應率為5. 0°/。外，其余兩 者均為陰性，假陽性率低于ELISA法。結論本發明所述裝置具有高度特異性，可以用于肺吸蟲病的診斷，以及肺吸蟲病與其它吸蟲病的鑒別診斷。表1、本發明所述裝置與ELISA法檢測不同血清的結果SS 本發明所述裝置 ELISA法血清來源 _例數 陽性例數陽性率(％) 陽性例數 陽性率(％)肺吸蟲病患者^ ^71 ioo. o~~肝吸蟲病患者 20 0 0 3 15.0血吸蟲病患者 20 1 5.0 15 75.0健康者 50 0 0 1 2. 02、敏感性方法采用本發明所述裝置對28例疑似肺吸蟲病患者血清進行檢測，并與 ELISA法進行比較；ELISA法為常規方法。結果見表2。兩種方法檢測結果的總符合率為100% (21/28)。經x2檢 驗，兩法間差異無顯著性(P 〉 0. 05 )。檢測結果呈陽性的21例病人最終確診為 肺吸蟲病患者，因此，兩種方法的敏感性均為100%。結論本發明所述裝置具有高度敏感性。表2、本發明所述裝置與ELISA法檢測敏感性比較ELISA法本發明所述裝置_ 合計+ —— 0 7 7合計 21 7 283、療效考核作用方法在肺吸蟲病患者經有效藥物治療后3個月與6個月，采用本發明所 述裝置對7例肺吸蟲病患者血清進行檢測，并與ELISA法進行比較；ELISA法為常規方法。結果采用本發明所述裝置;^測，7例肺吸蟲病患者經有效藥物治療后3 個月，有4例轉陰，轉陰率57. 1%;治療后6個月，7例全部轉陰，轉陰率100. 0%; 而采用ELISA法分別于治療后3個月、6個月檢測，無1例轉陰。結論采用本發明所述裝置檢測，轉陰率明顯高于ELISA法，可用于肺吸 蟲病的療效考核。4、 穩定性將本發明所述裝置分別置4'C和室溫保存，每隔一個月檢測一次。結果表 明，4。C保存的裝置12個月內，室溫保存的裝置6個月內，都能夠對肺吸蟲病 患者進行快速(IO分鐘以內)、靈敏的診斷與鑒別診斷。5、 重復性取肺吸蟲病患者血清和健康者血清各20例，釆用本發明所述裝置分別連續 進行5次測定，結果陽性和陰性結果不變，顯示本發明所述裝置的^r測重復性 良好。盡管通過參照本發明的某些優選實施例，已經對本發明進行了描述，但 本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣 的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和范圍。序 列 表<110> 中國人民解放軍第三軍醫大學 < 12 0>肺吸蟲病4企測裝置及其制備方法<160> 2<210〉 1<211> 495<212〉 RNA<213〉 斯氏貍殖吸蟲(Pagumogonimus skrjabini) <220〉<221> CDS<222> (1)…(495)<400> 1caaggtcaatgtggctectgctgggcgtttteggtagtaggaaat45GlnGlyGlnCysGlySerCysTrpAlaPheSerValValGlyAsn11015attgaaggtcaatggtttetcaagaccggtcagcUateagtctg90lieGluGlyGlnTrp 20PheLeuLysThrGly 25GlnLeulieSerLeu 30agcaaacagcaattggtcgattgtgacaaggtggaccacggatgc135SerLysGlnGlnLeu 35ValAspCysAspLys 40ValAspHisGlyCys 45aatggtggatggccaccatacacatacggcgagateaaaeggUg180AsnGlyGlyTrpPro 50ProTyrThrTyrGly 55GlulieLysArgLeu 60ggtggcttagagacgcaacaagactatccctatattggaagacag225GlyGlyLeuGluThrGlnGlnAspTyr 20ProTyrlieGlyArgGlnggg tea Gly Seretc gca Leu Alactt cag Leu Gintgt aat Cys Asnggc acg Gly Thrtgt Cysatt liegaa Glutac Tyrcct Progaa Glu65aga atg Arg Met80 gtt ctg Val Leu95 cac gga His Gly110 tac cga Tyr Arg125 get aga Ala Arg140 aat ggt Asn Gly15570 75 gat aag teg aag ttg ttg acg aaa ate gac 270 Asp Lys Ser Lys Leu Leu Thr Lys lie Asp85 90 gag aga gat gag tat aaa cag gca get tgg 315 Glu Arg Asp Glu Tyr Lys Gin Ala Ala Trp100 105 cca atg get tea act etc aat gcc aat tat 360 Pro Met Ala Ser Thr Leu Asn Ala Asn Tyr115 120 tec gga ate agt cat ccg tec agg tat gag 405 Ser Gly lie Ser His Pro Ser Arg Tyr Glu130 135 ctg aac cac ggc gta ctg act gtg ggc tat 450 Leu Asn His Gly Val Leu Thr Val Gly Tyr145 150 att ccc tac tgg att gtt aaa aat agt tgg 495 lie Pro Tyr Trp lie Val Lys Asn Ser Trp160 165<210> 2<211> 165<212> PRT<213> 斯氏貍殖吸蟲<400〉 2Gin Gly Gin Cys Gly 1 5(Pagumogonimus skrjabini )Ser Cys Trp Ala Phe Ser Val Val Gly Asn10 15lie Glu Gly Gin Trp Phe Leu Lys Thr Gly Gin Leu lieTrp 20 Leu 35 Pro 50 Thr 65 Met 80 Leu 95 Gly 110 Arg 125 Arg 140 Gly 155Ser Lys Gin Gin Leu Val Asp Cys Asp Lys Val Asp HisAsn Gly Gly Trp Pro Pro Tyr Thr Tyr Gly Glu lie LysGly Gly Leu Glu Thr Gin Gin Asp Tyr Pro Tyr lie GlyGin Thr Cys Arg Met Asp Lys Ser Lys Leu Leu Thr LysGly Ser lie Val Leu Glu Arg Asp Glu Tyr Lys Gin AlaLeu Ala Glu His Gly Pro Met Ala Ser Thr Leu Asn AlaLeu Gin Tyr Tyr Arg Ser Gly lie Ser His Pro Ser ArgCys Asn Pro Ala Arg ]Leu Asn His Gly Val Leu Thr ValGly Thr Glu Asn Gly lie Pro Tyr Trp lie Val Lys AsnGly 25 Lys 40 Gly 55 Pro 70 Leu 85 Tyr 100 Thr 115 His 130 Val 145 lie 160Ser Leu 30Gly Cys 45Arg Leu60 Arg Gin75 lie Asp90 Ala Trp105 Asn Tyr120 Tyr Glu135 Gly Tyr150 Ser Trp16權利要求
1、一種肺吸蟲病檢測裝置，包括標記墊、檢測層，其特征在于標記墊中含有經標記的檢測抗原，所述檢測抗原為氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的肺吸蟲ESP蛋白。
2、 根據權利要求l所述的肺吸蟲病檢測裝置，其特征在于所述標記墊中 含有經膠體金標記的4全測抗原。
3、 根據權利要求1或2所述的肺吸蟲病檢測裝置，其特征在于所述檢測 層(7 )上包被有抗人IgG抗體形成的沖企測線(8 )和抗肺吸蟲ESP蛋白的多克 隆抗體形成的質控線(9 )。
4、 根據權利要求1或2所述的肺吸蟲病檢測裝置，其特征在于所述包被 有檢測線(8 )和質控線(9 )的檢測層(7 )貼附于背板(10 )上，樣品墊(1 )、 標記墊(3 )及吸收墊(5 )順序貼附于檢測層(7 )上，蓋板(6 )扣蓋在貼附 有樣品墊(1 )、標記墊(3 )及吸收墊(5 )的檢測層(7 )上；所述蓋板(6 ) 上設有加樣孔(2 )和觀察孔(4 )。
5、 根據權利要求3所述的肺吸蟲病檢測裝置，其特征在于所述包被有檢 測線(8 )和質控線(9 )的檢測層(7 )貼附于背板(10 )上，樣品墊(1 )、標 記墊(3 )及吸收墊(5 )順序貼附于檢測層(7 )上，蓋板(6 )扣蓋在貼附有 樣品墊(1 )、標記墊(3 )及吸收墊(5 )的檢測層(7 )上；所述蓋板(6 )上 設有加樣孔(2 )和觀察孔(4 )。
6、 權利要求1所述的肺吸蟲病檢測裝置的制備方法，包括以下步驟a. 肺吸蟲ESP蛋白的制備肺吸蟲ESP蛋白的氨基^列如SEQ ID No. 2 所示，其編碼基因序列如SEQ ID No. l所示，根據氨基酸或核苷酸序列制備， 即得肺吸蟲ESP蛋白；b. 抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體的制備用肺吸蟲ESP蛋白于哺乳動物 的肌肉或皮下注射進行多次免疫，收集被免疫動物的血液，分離血清，即得抗 肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體；c. 標記墊的制備用標記物對肺吸蟲ESP蛋白進行標i己，制得標記的肺吸 蟲ESP蛋白；將玻璃纖維素膜置濃度為0. 01 mol/L、 pH值為8. 2的磷酸鹽緩沖 液即PBS緩沖液中浸泡30分鐘，于溫度為37。C條件下烘干，再將上述標記的 肺吸蟲ESP蛋白溶液均勻地鋪在玻璃纖維素膜上，0.5 ml/mm2,冷凍干燥，即 得標記墊；d. ;險測層的制備將硝酸纖維素即NC膜置濃度為0.01-0.05 mol/L、 pH 值為8.0-8.2、含有質量百分濃度為1%的牛血清白蛋白即BSA、質量百分濃度 為1%的吐溫-20的PBS緩沖液中浸泡30分鐘，于溫度為37。C的條件下烘干； 用抗體稀釋液即濃度為0. 01 mol/L、 pH值為8. 0-8. 2、含有質量百分濃度為1% 的BSA的PBS緩沖液，對濃度為1 mg/ml的抗人IgG抗體溶液、濃度為1 mg/ml 的抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體溶液分別進行1: 500-1: 1000稀釋；將稀釋 后的抗人IgG抗體溶液、抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體溶液，用點膜儀以每 厘米2-3 pl體積分別噴到NC膜上，形成檢測線和質控線；包被有檢測線和質 控線的NC膜經真空干燥后，用濃度為0.01 mol/L、 pH值為8.8-9.0、含有質 量百分濃度為1%的BSA的PBS緩沖液封閉2小時，再用濃度為0. 01 mol/L、 pH值為8. 8-9. 0的PBS緩沖液洗滌，真空干燥，即得檢測層；e. 樣品墊的制備將吸水濾紙置濃度為0. 01 mol/L、 pH值為7. 2的PBS 緩沖液中浸泡30分鐘，于溫度為37。C條件下烘干，即得樣品墊；f. 吸收墊的制備取吸水濾紙，即得吸收墊；g. 檢測裝置的制備將包被有檢測線(8)和質控線(9)的檢測層(7) 貼附于背板(10 )上，樣品墊(1 )、標記墊(3 )及吸收墊(5 )順序貼附于檢 測層(7 )上，蓋板(6 )扣蓋在貼附有樣品墊(1 )、標記墊(3 )及吸收墊(5 ) 的檢測層(7 )上；所述蓋板(6 )上設有加樣孔(2 )和觀察孔(4 ),即得檢測 裝置。
7、根據權利要求6所述的肺吸蟲病檢測裝置的制備方法，其特征在于所述 步驟a中肺吸蟲ESP蛋白的制備采用以下方法以斯氏貍殖吸蟲成蟲總RNA為才莫板，采用如下簡并引物上游引物5，-TCA (AG) GG (AGCT) CA ( AG ) TG ( CT ) GG ( AGCT ) TC ( AGCT ) TG ( CT ) TGG-3，、 下游引物5'-CCA ( AG ) CT ( AG ) TT ( CT ) TT ( AGCT ) AC ( AG ) ATCCA ( AG ) TA-3,， 進行逆轉錄聚合酶鏈式反應，得到肺吸蟲ESP蛋白的編碼基因片段，再將所得 編碼基因片段與pQE-80L表達載體進行TA連接，轉化入BL21大腸桿菌感受態 細胞，用含氨芐青霉素的LB平板進行篩選培養，將陽性宿主菌接種于含氨節青 霉素的液體LB培養基中培養，用異丙基硫代半乳糖苷即IPTG誘導表達后，超 聲破碎，離心收集上清液，以Ni"-NTA樹脂親和層析法進行純化，即得肺吸蟲 ESF蛋白。
8、 根據權利要求6所述的肺吸蟲病檢測裝置的制備方法，其特征在于所述 步驟b中抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體的制備采用以下方法將1 mg/ml肺吸蟲ESP蛋白溶液與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑等體積 混合，充分乳化，制備肺吸蟲ESP蛋白免疫抗原，免疫雄性新西蘭白兔；免疫 步驟如下初次免疫，以弗氏完全佐劑免疫抗原于家兔后腿、腹部皮下多點注 射，每只lml;間隔l-2周，第二次免疫，以弗氏不完全佐劑免疫抗原于家兔 后腿肌肉或背部皮下多點加強免疫，每只lml;之后連續免疫2次，每次間隔 2周，免疫成分、劑量、途徑同第二次免疫；第四次免疫后5-7天，對經瓊脂 雙擴散試驗測定抗體效價達1 : 32以上的家兔，頸動脈放血，離心分離血清， 血清經飽和硫酸銨溶液沉淀、透析，即得抗肺吸蟲ESP蛋白的多克隆抗體。
9、 根據權利要求6所述的肺吸蟲病檢測裝置的制備方法，其特征在于所述 步驟c中標記墊的制備采用以下方法用三蒸水溶解氯金酸，制成O. 1 g/L溶液，置沸水浴中煮沸，按4: 1 的比例加入質量百分濃度為1°/ 的檸檬酸三鈉溶液，于沸水浴中快速攪拌， 直至溶液呈穩定的紅色，繼續于沸水浴中加熱IO分鐘，冷卻至室溫后補足 失水，^r測顆粒均勻度及粒度；取均勻的粒度為15-20nm的膠體金100ml， 用碳酸鉀溶液調pH值至8.8-9.0,于室溫、快速攪拌條件下緩慢加入濃度 為1. 5-2. 0 mg/ml的肺吸蟲ESP蛋白溶液3-5 ml，繼續攪拌10-15分鐘，加入BSA至最終質量百分濃度為1-2%，再攪拌10-15分鐘；所得溶液于4000 r/min離心20分鐘，棄沉淀，上清液以10000 r/min離心60分鐘，棄去上 清液，沉淀用濃度為0.01 mol/L、 pH值為8.0-8.2、含有質量百分濃度為 1-2%的BSA的PBS緩沖液洗滌，再用濃度為0.01 mol/L、 pH值為8.2、含 有質量百分濃度為1%的BSA、質量百分濃度為0. 02%的疊氮化鈉的PBS緩沖 液5-10ml重懸，制得膠體金標記的肺吸蟲ESP蛋白溶液；將玻璃纖維素膜 置濃度為0.01 mol/L、 pH值為8.2的PBS緩沖液中浸泡30分鐘，于溫度 為37。C條件下烘干，再將上述膠體金標記的肺吸蟲ESP蛋白溶液均勻地鋪 在玻璃纖維素膜上，0.5 ml/睡2，冷凍干燥，即得標記墊。
全文摘要
本發明公開了一種肺吸蟲病檢測裝置及其制備方法，該檢測裝置包括標記墊、檢測層，標記墊中含有經標記的檢測抗原，檢測抗原為氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的肺吸蟲ESP蛋白；本發明檢測裝置的制備方法包括肺吸蟲ESP蛋白及其多克隆抗體的制備、標記墊、檢測層、樣品墊、吸收墊及檢測裝置的制備等多個步驟；采用本發明制備方法制得的檢測裝置具有高度特異、敏感性，與肝吸蟲病、血吸蟲病的交叉反應干擾小，假陽性率低于ELISA法，并具有療效考核作用，在肺吸蟲病經有效藥物治療后3-6月，檢測結果將轉陰，轉陰率高于ELISA法，可以準確、快速、簡便地進行肺吸蟲病的診斷與鑒別診斷、以及療效考核，具有重要的臨床應用價值。
文檔編號G01N33/68GK101266252SQ20081006958
公開日2008年9月17日 申請日期2008年4月25日 優先權日2008年4月25日
發明者張錫林 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學