專利名稱：一種用Tb進行表面修飾的羥基磷灰石熒光納米顆粒的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物探針用Tb進行表面修飾的羥基磷灰石熒光納米顆粒及其制備方法。 屬于生物工程及材料科學技術領域。
背景技術：
要想實時觀察生物體內所發生的各種變化，就常常需要用到生物探針。目前被廣泛應用的生物探針材料主要可分為以下兩類第一類，同時也是應用最廣的一類就是具有熒光特性的有機分子，Yang YK， Ko SK， Shin I， Tae J, Synthesis of a highly metal-selective rhodamine-based probe and its use for the in vivo monitoring of mercury. NATURE PROTOCOLS, 2007， 2:1740-1745; TanakaK， MiuraT， UmezawaN， Urano Y， Kikuchi K， Higuchi T， Nagano T， Rational design of fluorescein—based fluorescence probes. Mechanism-based design of a maximum fluorescence probe for singlet oxygen, JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, 2001， 123(11) :2530-2536，這些有機熒光探針雖然靈 敏性較高，但同時也有一個顯著的缺點，那就是有著光漂白性(photobleaching)， Zondervan R， Kulzer F， Kol' chenko M A， 0rrit M， Photobleaching of rhodamine 6G in poly (vinyl alcohol) at the ensemble and single-molecule levels, THE JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY A, 2004， 108(10): 1657 -1665 Talhavini M, Atvars TDZ. Dye-polymer interactions controlling the kinetics of fluorescein photobleaching reactions in poly (vinyl alcohol), /(9OT朋Z /W(9r^^￥/6T^T//M /W(97朋/(X(^y丄C^E￥/5TAT, 1998,114(1) :65-73，在光源激發下，這些熒光探針的熒光發光強度會迅速下降，因此有機熒 光探針不能應用于需要進行長時間連續觀測或需要進行定量檢測的實驗中。第二類生物探針材料——半導體量子點材料，Gao X， Cui Y， Levenson RM， Chung LWK， Nie S， in vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots, NATURE BIOTECHNOLOGY, 2004， 22 (8) :969-976，如CdSe-CdS、 CdSe-ZnS、 InAs、 InP等則克服了這個 缺點，具有相對穩定的熒光發光強度。但由鎘鹽和銦鹽的毒性而引發的生物安全性的問題使 得這類熒光探針材料在生物體內的應用也受到了限制。研究結果表明，納米無機發光材料有可能替代半導體量子點成為一類新的生物探針，Patm CR， Bhattacharya R， Patra S， Basu S, Mukherjee P， Mukhopadhyeiy D， Inorganic phosphate nanorods are a novel fluorescent label in cell biology, JOURNAL OF NAN0BI0TECHN0L0GY，2006， 4:11，理想中的生物熒光探針材料應該具有良好的生物兼容性、生物活性以及光穩定性、 顆粒尺寸最好為納米尺度、且對生物體無毒害。羥基磷灰石(Hydroxyapatite，簡稱HAP，分子式為Ca1Q (P04)6(OH)2)是人體和動物體內 骨骼和牙齒的主要無機組成成分，具有良好的生物兼容性和生物活性，在整形外科和牙科方 面，HAP作為人體骨骼和牙齒的替代物已經得到了廣泛應用。Sautier JM， Nefussi JR， Forest N. Ultrastructural study of bone formation on synthetic hydroxy即atite in osteoblast cultures, CELLS AND MATERIALS, 1991， 1 (33) :209-217，由納米溶解模式可推知，在生物體 內環境中，納米HAP粒子在動力學上可以穩定存在，Tang R， Wang L， 0rme CA， Bush PJ， Nancollas GH， Dissolution at the nanoscale: self—preservation of biominerals, ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION, 2004，43(20):2697-2701。因此納米羥基磷灰石顆粒應該很適合被用作生物探針。但羥基磷灰石本身在可見光激發 下并無明顯的熒光發射，需要用可發光的離子對其進行表面修飾。目前還沒有制備方法簡單、 對生物體基本無毒害作用、可見光激發下熒光明顯且能輕易進入細胞內部的納米羥基磷灰石 相關材料被報道。發明內容為了克服已有生物探針材料的缺點，本發明提出一種制備方法簡單，具有良好生物兼容 性和穩定性的羥基磷灰石熒光納米顆粒的制備方法。本發明的總的技術構思是用Tb對羥基磷灰石進行表面修飾，得到Tb修飾后的羥基磷灰石熒光納米顆粒。提供一種新的生物探針材料-Tb摻雜羥基磷灰石熒光納米顆粒，以及Tb摻雜 羥基磷灰石熒光納米顆粒的制備方法。本發明用Tb對羥基磷灰石進行表面修飾方法是以十六垸基三甲基溴化銨(CTAB)為添 加劑，將鈣鹽溶液逐滴加入含有磷酸根和CTAB的溶液中，同時滴加氨水溶液調節溶液pH值， 羥基磷灰石顆粒從溶液中析出，形成羥基磷灰石乳白色懸浮液，用鹽酸調節溶液的pH值，再 向溶液中滴加TV+溶液，使得羥基磷灰石納米顆粒的表面的部分"2+被化3+所取代，經過濾、洗 滌，真空干燥后收集，得到Tb摻雜羥基磷灰石熒光納米顆粒。本發明提供的Tb摻雜羥基磷灰石熒光納米顆粒，其特征是顆粒呈米粒狀，顆粒長徑約 為40-60nm，短徑約為15-20nm,具有明顯熒光性質，有多個激發譜峰，最大激發峰位于272nm， 在可見光波段(488nm)也有激發峰存在，熒光顆粒最大發射譜峰位于544nm。本發明用Tb進行表面修飾的羥基磷灰石熒光納米顆粒制備方法的具體步驟如下 a)配制含有磷酸根和十六烷基三甲基溴化銨的混合溶液，將濃度為0.85~0.95mM的CTAB和濃度為5.5 6.5mM的磷酸鹽溶液攪拌均勻，用氨水調節混合溶液的pH值，使溶液的p H值為9 10。b) 按反應結束時Ca/P摩爾比為1.65 1.69的量，向混合溶液中滴加濃度為0.5 M鈣鹽溶液， 滴加速度為1滴/秒，用0.1M的氨水調節，使得反應體系的pH值保持在9 10之間，攪 拌，持續反應1 3小時，得到羥基磷灰石溶膠乳白色懸浮液；c) 在羥基磷灰石溶膠中，用1M HCl將體系pH值調節至6.0 7.0，按反應結束時體系中 Tb: (Ca+Tb) =1:100 4:100的量，滴加濃度為4.0 6.0mM的鋱鹽溶液，滴加速度為1 滴/秒；d) 反應22 24小時后，用0.22 pm的微孔濾膜過濾出沉淀，用去離子水和乙醇多次交替徹 底洗滌沉淀后，置于3(TC真空干燥箱中過夜干燥，即可得到Tb修飾后的羥基磷灰石熒光 納米顆粒。本發明的磷酸鹽可為磷酸氫二銨、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉、 磷酸三鉀的一仲，優選為磷酸氫二鈉。本發明鈣鹽可為硝酸鈣、氯化鈣。優選為氯化鈣。本發明鋱鹽可為硝酸鋱、氯化鋱。優選為硝酸鋱。本發明十六垸基三甲基溴化銨的濃度范圍為0.85~0.95mM，優選為0.90mM。 本發明反應體系中磷酸根濃度范圍為5.5 6.5mM，優選為6.0mM。 本發明滴加鈣鹽溶液反應結束時Ca/P摩爾比為1.65 1.69，優選為1.67。 本發明滴加鈣鹽后，用氨水將溶液pH調節至9 10之間，優選為9.5。 本發明滴加鈣鹽后的反應時間為1 3小時，優選為2小時。 本發明滴加鋱鹽之前，用鹽酸將溶液pH調節至6.0 7.0之間，優選為6.5。 本發明Tb: (Ca+Tb)為1:100 4:100，優選為2:100。 本發明滴加鋱鹽后的反應時間為22 24小時，優選為23小時。 本發明反應體系調節pH值的氨水濃度為O.IM。 本發明羥基磷灰石溶膠懸濁液體系pH值調節的鹽酸濃度為1M 。 本發明pH值采用精密pH試紙測定。本發明Tb摻雜納米羥基磷灰石熒光納米顆粒，顆粒呈米粒狀，其長徑約為40-60nm，短 徑約為15-20nm，具有明顯熒光性質，有多個激發譜峰，其最大激發峰位于272nm，在可見 光波段(488nm)也有激發峰，最大發射譜峰位于544nm。本發明Tb摻雜納米羥基磷灰石顆粒，在可見光激發下熒光明顯且能輕易進入細胞內部，用作生物探針材料，具有良好的生物兼容性、生物活性以及光穩定性、顆粒尺寸為納米尺度、 對生物體基本無毒害作用，制備工藝簡單，原材料容易獲得，具有明顯熒光特征，尺寸小， 又可被可見光波段所激發，在生物工程領域具有廣闊的應用前景。
附圖1 Tb修飾后的羥基磷灰石熒光納米顆粒的透射電鏡圖附圖-2 Tb修飾后的羥基磷灰石熒光納米顆粒的X射線衍射圖附圖3激發波長為272nm時，Tb修飾后的羥基磷灰石納米顆粒的熒光發射譜圖附圖4圖(a)為發射波長在544nm時，Tb修飾后的羥基磷灰石納米顆粒的熒光激發光譜圖。圖(b)是圖(a)在300-500nm區域的細節放大圖。
具體實施方式
實施例1一種用Tb進行表面修飾的羥基磷灰石熒光納米顆粒，其制備過程依次為1. 將1.8mmolNa2HPCV 12H20禾口0.27 mmol十六烷基三甲基溴化銨(CTAB )溶解于294mL 去離子水中，用磁力攪拌器攪拌均勻，攪拌速度為200轉/分；2. 上述第一步溶液攪拌10分鐘后，用精密pH試紙測定混合溶液pH值，用O. 1M的氨水調節溶液pH為9. 5;3. 向上述第二步溶液中緩慢滴加濃度為0.5M的氯化鈣溶液6ml，滴加速度為l滴/秒，在滴加氯 化鈣溶液的過程中，用濃度為O. lM的氨水隨時調節溶液pH值，使其始終維持在9.5，得到羥 基磷灰石溶膠；4. 上述第三步溶膠經磁力攪拌一小時后，用lMHCl將體系調至p1^6.5，用精密pH試紙測定混 合溶液pH值。5. 向上述第四步溶膠中緩慢滴加12.2mL5.0mMTb(NO3)3溶液，滴加速度為l滴/秒。6. 上述第五步溶膠經磁力攪拌23小時后，用0.22pm的微孔濾膜濾出沉淀，用去離子水清洗三 遍；7. 將沉淀置于30'C真空干燥箱中干燥12小時，制得Tb修飾的羥基磷灰石納米顆粒。8. 用透射電鏡(JEM-200CX， JEOL Japan)對Tb修飾的羥基磷灰石納米顆粒的形貌進行了分析(見附圖1)，結果表明納米顆粒長徑約為40-60nm，短徑約為15-20nm，用X射線衍射儀 (D/MAX-RA， Rigaku Japan)分析了納米顆粒的相組成(見附圖2)，表明此納米顆粒仍保 持了羥基磷灰石結構。使用日本島津RF-5301pc型熒光分光光度計對納米顆粒的熒光性質進 行了分析(見附圖.3和附圖4)，結果表明此顆粒具有明顯熒光性質，有多個激發譜峰，其最大激發峰位于272nm，在可見光波段(488nm)也有激發峰存在。此熒光顆粒最大發射譜峰位于544nm。 實施例2參照實施例1的制備步驟，不同的是混合溶液中的磷酸鹽采用磷酸氫二銨；鈣鹽采用硝 酸鈣，鋱鹽采用氯化鋱；十六烷基三甲基溴化銨的濃度為0.85mM;磷酸根的濃度為5.5mM; 反應結束時Ca/P摩爾比為1.65;滴加鈣鹽后用氨水調節溶液pH使其為9;滴加鈣鹽后反應1 小時，然后用1MHC1將體系調至pH=6.0;滴加鋱鹽后，Tb:(Ca+Tb)摩爾比為1:100;滴加 鋱鹽后，反應時間為22小時，此時所得到的Tb修飾的羥基磷灰石納米顆粒長徑約為40-50nm， 短徑約為15-17nm，除顆粒形貌大小外其余性質均與實施例1中所得產品一致。 實施例3參照實施例1的制備步驟，不同的是混合溶液中的磷酸鹽采用磷酸氫二鉀；鈣鹽采用硝 酸鈣；十六烷基三甲基溴化銨的濃度為0.95mM;磷酸根的濃度為6.5mM;反應結束時Ca/P 摩爾比為1.69;滴加鈣鹽后用氨水調節溶液pH使其為10;滴加鈣鹽后反應2小時，然后用 1MHCl將體系調至pH-7.0;滴加鋱鹽后，Tb:(Ca+Tb)摩爾比為4:100;滴加鋱鹽后，反應 時間為24小時，此時所得到的Tb修飾的羥基磷灰石納米顆粒長徑約為50-60nm，短徑約為 17-20nm，除顆粒形貌大小外其余性質均與實施例1中所得產品一致。
權利要求
1、一種用Tb進行表面修飾的羥基磷灰石熒光納米顆粒的制備方法，其特征是以十六烷基三甲基溴化銨為添加劑，將鈣鹽溶液逐滴加入含有磷酸根和十六烷基三甲基溴化銨的混合溶液中，滴加氨水溶液調節溶液pH值，羥基磷灰石顆粒從溶液中析出，形成羥基磷灰石乳白色懸浮液，用鹽酸調節溶液的pH值，再向溶液中滴加Tb3+溶液，使得羥基磷灰石納米顆粒的表面的部分Ca2+被Tb3+所取代，經過濾、洗滌、真空干燥后收集，得到Tb摻雜羥基磷灰石熒光納米顆粒。
2、 根據權利要求l所述的制備方法得到Tb摻雜羥基磷灰石熒光納米顆粒，其特征在于該顆 粒呈米粒狀，其長徑為40-60nm，短徑為15-20nm，具有明顯熒光性質，有多個激發譜峰， 最大激發峰位于272nm，在可見光波段也有激發峰，最大發射譜峰位于544nm。
3、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征是具體步驟如下a) 配制含有磷酸根和十六垸基三甲基溴化銨的混合溶液，將濃度為0.85~0.95mM的十六烷基 三甲基溴化銨和濃度為5.5 6.5mM的磷酸鹽溶液攪拌均勻，用濃度為O.IM氨水調節混合 溶液的pH值，使溶液的pH值為9 10;b) 按反應結束時Ca/P摩爾比為1.65 1.69的量，向混合溶液中滴加濃度為0.5 M鈣鹽溶液， 滴加速度為1滴/秒，用0.1M的氨水調節，使得反應體系的pH值保持在9 10之間，攪 拌，持續反應1 3小時，得到羥基磷灰石溶膠乳白色懸浮液；c) 在羥基磷灰石溶膠中，用1M HCl將體系pH值調節至6.0 7.0，，按反應結束時體系中 Tb: (Ca +Tb) =1:100 4:100的量，滴加濃度為4.0 6.0mM的鋱鹽溶液，滴加速度為1 滴/秒；d) 反應22 24小時后，用0.22 nm的微孔濾膜過濾出沉淀，用去離子水和乙醇多次交替徹 底洗滌沉淀后，置于30'C真空干燥箱中過夜干燥，即可得到Tb修飾后的羥基磷灰石熒光 納米顆粒。
4、 根據權利要求1或3所述的制備方法，其特征是所述磷酸鹽包括磷酸氫二銨、磷酸二氫 鉀、磷酸二氫銨、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉或磷酸三鉀。
5、 根據權利要求1或3所述的制備方法，其特征是所述鈣鹽為硝酸鈣、氯化鈣。
6、 根據權利要求1或3所述的制備方法，其特征是所述鋱鹽為硝酸鋱、氯化鋱。
7、 根據權利要求1或3所述的制備方法，其特征是滴加鈣鹽后，用氨水將溶液調節pH 9.5。
8、 根據權利要求1或3所述的制備方法，其特征是滴加鋱鹽前，用鹽酸將溶液pH調節6.5。
9、 根據權利要求1或3所述的制備方法，其特征是所述滴加鈣鹽溶液反應結束時Ca/P摩爾 比為1.67。
10、 根據權利要求1或3所述的制備方法，其特征是所述滴加的鋱鹽溶液應結束時Tb: (Ca +Tb) =2:100。
全文摘要
一種用Tb進行表面修飾的羥基磷灰石熒光納米顆粒的制備方法，以十六烷基三甲基溴化銨為添加劑，將鈣鹽溶液逐滴加入含有磷酸根和十六烷基三甲基溴化銨的混合溶液中，滴加氨水溶液調節溶液pH值，羥基磷灰石顆粒從溶液中析出，形成羥基磷灰石懸浮液，用鹽酸調節溶液的pH值，向懸浮液中滴加Tb<sup>3+</sup>溶液，使得羥基磷灰石納米顆粒的表面的部分Ca<sup>2+</sup>被Tb<sup>3+</sup>所取代，經過濾、洗滌，真空干燥后收集，得到顆粒呈米粒狀，長徑為40-60nm，短徑為15-20nm。本發明制備工藝簡單，原材料容易獲得，具有明顯熒光特征，尺寸小，有良好的生物兼容性，可作為穩定的生物探針材料。
文檔編號G01N21/64GK101255335SQ200810060400
公開日2008年9月3日 申請日期2008年4月10日 優先權日2008年4月10日
發明者唐睿康, 玲 李 申請人:浙江大學