專利名稱：雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離分析方法
技術領域：
本發明涉及雙膦酸鹽類藥物(包括阿倫膦酸鈉、依替膦酸鈉、利塞膦酸鈉、 唑來膦酸等)的分析方法，特別涉及采用梯度淋洗分離、抑制電導檢測器進行 檢測的雙膦酸鹽藥物的離子色譜分析方法。
背景技術：
雙膦酸鹽類藥物是八十年代研究開發出的新型骨吸收抑制劑，目前已成功地 用于骨鈣代謝疾病和一些骨相關疾病的治療。雙磷酸鹽類藥物含量測定方法常 用酸堿電位滴定法、鉬黃或鉬藍比色法、電感耦合等離子體法，但是這些方法 不能用來測定藥物中陰離子雜質；雙膦酸鹽類藥物是一種沸點高的物質，運用 氣相色譜分析時，需要對其進行衍生化；又由于該類藥物分子結構中無生色團， 需經衍生后采用紫外檢測器、熒光檢測器檢測等，操作十分煩瑣。發明內容木發明針對現有技術、方法存在的不足，提供一種雙膦酸鹽類藥物及其雜 質陰離子的離子色譜分離分析方法，此種方法既能保證分析效果，使雙膦酸鹽 藥物與雜質陰離子分離，又能簡化工藝流程，不需衍生就可進行測定。 本發明的技術方案是 一種雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離分 析方法，包括以下步驟(1) 基線測繪將洗脫液用泵輸送入色譜分離柱使其達到平衡，從色譜分離柱 輸出的洗脫液經過抑制器后流入電導流通池，由電導檢測器轉化為電信 號，從而形成基線被測繪。(2) 進樣和離子交換含有雙膦酸鹽類藥物的被測試樣在KOH洗脫液的推動下進入色譜分離柱產生離子交換，帶負電荷的雙膦酸鹽類藥物置換下色譜分 離柱上的氫氧根離子并保留在色譜分離柱上。4(3) 洗脫將洗脫液連續輸送入色譜分離柱不斷將雙膦酸鹽類藥物和雜質陰離 子在色譜分離柱上展開，各種雜質陰離子和雙膦酸鹽類藥物離子產生差速 遷移而相互分離，在不同的保留時間被洗脫。(4) 抑制電導檢測分析從色譜分離柱輸出的含雙膦酸根離子的溶液通過抑制 器后，洗脫液KOH已被轉變成電離很小的水，因此其電導值也很小，而樣 品陰離子則變成其相對應的酸；樣品流過電導流通池時由電導檢測器轉化為電信號，從而形成譜圖被記錄。本發明具有以下有益效果1、 對4種常用雙膦酸鹽類藥物和在生產過程中所帶入的陰離子雜質能進行 良好的分離、分析，.保留時間、峰高、峰面積的相對標準偏差均小于5%，檢測 限可達10—fig/L，在0.2 50mg/L濃度范圍內，峰高對濃度、峰面積對濃度乘良 好的線性關系，相關系數在0. 9995以上。2、 分析時，將試樣直接注入色譜分離柱并經抑制電導檢測器就能獲得譜圖， 去除現有分析方法中的柱前或柱后衍生步驟，使工藝流程大為簡化。3、 本方法可用于雙膦酸鹽類藥物中雜質陰離子的檢測，也可檢測血漿中雙 膦酸鹽類藥物，為雙膦酸鹽類藥物的測定提供了有效的分析手段，擴大了本方 法的應用范圍。
'圖1是根據本發明提供的方法獲得的阿倫膦酸鈉與5種常見陰離子的標準離子色譜圖，圖中，i為r(o. i)， 2為cr(o. 1) ， 3為MV(O. l)， 4為S042—(0. 1)， 5為PO,(O. 1)， 6為阿倫膦酸鈉(10.0);圖2是根據本發明提供的方法獲得的血漿樣品中依替膦酸鈉的色譜圖，圖 中，l為依替膦酸鈉；圖3是根據本發明提供的方法獲得的生理鹽水基質中利塞膦酸鈉的樣品色 譜圖，圖中，1為利塞膦酸鈉(10.0);圖4是根據本發明提供的方法獲得的葡萄糖基質中唑來膦酸的樣品色譜圖， 圖中，1為唑來膦酸(20.0mg/L)。
具體實施方式
雙膦酸鹽藥物在水中可以電離產生有電導響應的陰離子，運用陰離子柱分 離、抑制電導檢測器進行檢測。工藝步驟依次包括基線測繪、進樣和離子交換、 洗脫、抑制電導檢測分析。1、 基線測繪將洗脫液用泵輸送入色譜分離柱使其達到平衡，從色譜分離柱輸出的洗脫液 經過抑制器后流入電導流通池，由電導檢測器轉化為電信號，從而形成基線被測繪。2、 進樣和離子交換含有雙膦酸鹽類藥物的被測試樣在K0H洗脫液的推動下進入色譜分離柱產 生離子交換，帶負電荷的雙膦酸鹽類藥物置換下色譜分離柱上的氫氧根離子并 保留在色譜分離柱上。3、 洗脫將洗脫液連續輸送入色譜分離柱不斷將雙膦酸鹽類藥物和雜質陰離子在色 譜分離柱上展開，各種雜質陰離子和雙膦酸鹽類藥物離子產生差速遷移而相互 分離，在不同的保留時間被洗脫。4、 抑制電導檢測分析 從色譜分離柱輸出的含雙膦酸根離子的溶液通過抑制器后，洗脫液K0H已被轉變成電離很小的水，因此其電導值也很小，而樣品陰離子則變成其相對應的 酸；樣品流過電導流通池時由電導檢測器轉化為電信號，從而形成譜圖被記錄。 根據不同雙膦酸鹽類藥物在陰離子柱中保留強度不同，采用K0H溶液作為洗 脫液并采用不同的梯度淋洗方案。① 、分析阿倫膦酸鈉藥片中阿倫膦酸鈉藥物及雜質離子時，梯度淋洗方案 是0 2min時，濃度選用1 mmol/L的氫氧化鉀；2 12 min時，濃度選用 lmmol/L 18 mmol/L的氫氧化鉀；12. 01 17. OOmin，采用濃度為1 mmol/L的 氫氧化鉀。② 、分析小白兔血漿中依替膦酸鈉藥物含量時，梯度淋洗方案是0 2min 時，濃度選用3 mmol/L的氫氧化鉀；2 12 min時，濃度選用lmmol/L 30ramol/L 的氫氧化鉀；12.01 17.00min，采用濃度為3 ramol/L的氫氧化鉀。③ 、分析生理鹽水基質中利塞膦酸鈉藥物及雜質離子時，梯度淋洗方案是 0 3min時，濃度選用20mmol/L的氫氧化鉀；3. 01 8. 00min時，濃度選用 45,ol/L; 8.01 15.00min，采用濃度為20mmol/L的氫氧化鉀。④ 、分析葡萄糖基質中唑來膦酸及雜質離子時，梯度淋洗方案是0 3min時，濃度選用20mmol/L的氫氧化鉀；3. 01 8. OOmin時，濃度選用45mmol/L的 氫氧化鉀；8. 01 15. OOmin，采用濃度為20mmol/L的氫氧化鉀。分析上述4種雙膦酸鹽類藥物和雜質陰離子時，分離柱是美國Dionex IonPac ASll，尺寸為250 mmX2 mm;保護柱是IonPac AGll，尺寸為50 mmX2 mm;進樣量為25 u L;淋洗液發生器為EG50;電導檢測器為DS6; 但在分析阿倫膦酸鈉藥物、依替膦酸鈉藥物藥物時所用的抑制器為Dionex AAES 自再生抑制器；分析利塞膦酸鈉藥物、唑來膦酸時所用的抑制器為Dionex ASRS-ULTRA自再生抑制器下面根據附圖和具體實施例詳細說明本發明，本發明的目的和效果將變得 更加明顯。實施例1:本實施例是對阿倫膦酸鈉藥片中阿倫膦酸鈉和5種常見陰離子進行分析 使用的儀器Dionex ICS 2000離子色譜儀(美國Dionex公司)；EG50淋 洗液發生器；DS6電導檢測器；Chromeleon 6.5色譜工作站；IonPac AGll保 護柱(50 mmX2 mm); IonPac ASll分離柱(250 mmX2 mm); 25 y L進樣量。 抑制器Dionex AAES自再生抑制器；洗脫液K0H溶液，采用梯度淋洗。0 2min時，濃度選用1 mmol/L的氫 氧化鉀；2 12min時，濃度選用lmmol/L 18 mmol/L; 12. 01 17. OOmin，采用濃度為1 mmol/L的氫氧化鉀。 分析步驟① 、基線測繪將洗脫液用泵輸送入色譜分離柱使其達到平衡，從色譜分離柱輸出的洗脫 液進抑制器后，流入電導流通池時由電導檢測器轉化為電信號，從而形成基線被測繪。② 、譜圖測繪含有雙膦酸鹽類藥物的被測試樣在洗脫液的推動下進入色譜分離柱產生離 子交換，帶負電荷的雙膦酸鹽類藥物置換下色譜分離柱上的氫氧根離子并保留 在色譜分離柱上。將洗脫液連續輸送入色譜分離柱不斷將雙膦酸鹽類藥物和雜質陰離子在色 譜分離柱上展開，各種雜質陰離子和雙膦酸鹽類藥物離子產生差速遷移而相互 分離，在不同的保留時間被洗脫；從色譜分離柱輸出的含雙膦酸根離子的溶液 通過抑制器后，洗脫液KOH已被轉變成電離很小的水，因此其電導值也很小，而樣品陰離子則變成其相對應的酸；樣品溶液流過電導流通池時由電導檢測器轉化為電信號，從而形成譜圖被測繪。所測繪的譜圖見圖l。分析結果藥片中F—的含量為0. 155 mg/g; Cl—的含量為0.222 mg/g; N(V 的含量為0. 0585 mg/g; SO/—的含量為0. 277 mg/g; P043—的含量為0. 0195mg/g;阿倫膦酸鈉的含量為55. i mg/g;阿倫膦酸鈉與r、 cr、 NCV、 SO廣、P043—的加標回收率在87。％到104%之間。 實施例2:本實施例是對小白兔血漿中依替膦酸鈉含量進行分析。使用的儀器與實施例l相同。 抑制器同實施例l相同。洗脫液K0H溶液。梯度淋洗方案是0 2min時，濃度選用3 mraol/L的 氫氧化鉀；2 12 min時，濃度選用lmmol/L 30mmol/L的氫氧化鉀；12.01 17,00min，采用濃度為3訓ol/L的氫氧化鉀。分析步驟同實施例1。所測繪的譜圖見圖2。分析結果是小白兔服藥1小時后采集的血漿樣品中依替膦酸鈉的含量為5. 0 PgM實施例3:本實施例是對利塞膦酸鈉在生理鹽水中的含量進行分析。使用的儀器與實施例l相同。抑制器Dionex ASRS-ULTRA自再生抑制器。洗脫液KOH溶液。梯度淋洗方案是0 3min時，濃度選用20證ol/L的 氫氧化鉀；3.01 8. OOmin時，濃度選用45mmol/L; 8. 01 15. OOmin，采用濃 度為20咖ol/L的氫氧化鉀。分析步驟同實施例1。所測繪的譜圖見圖3。 分析結果如下生理鹽水基質對利塞膦酸鈉的測定沒有產生干擾，樣品色譜峰 峰形很好；利塞膦酸鈉回收率平均值為106.4% 實施例4:本實施例是在葡萄糖溶液介質中對唑來膦酸的含量進行分析。使用的儀器與實施例l相同。 抑制器與實施例3相同。洗脫液KOH溶液。梯度淋洗方案是0 3min時，濃度選用20mmol/L的 氫氧化鉀；3. 01 8. OOrain時，濃度選用45mmol/L的氫氧化鉀；8. 01 15. OOmin，采用濃度為20mmol/L的氫氧化鉀。分析步驟同實施例l。所測繪的譜圖見圖4。分析結果如下葡萄糖基質對唑來膦酸的測定沒有產生干擾，樣品色譜峰峰形很好；唑來膦酸回收率平均值為97. 07%。上述實施例用來解釋說明本發明，而不是對本發明進行限制，在本發明的 精祌和權利要求的保護范圍內，對本發明作出的任何修改和改變，都落入本發 明的保護范圍。
權利要求
1.一種雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離分析方法，其特征在于，包括以下步驟(1)基線測繪將洗脫液用泵輸送入色譜分離柱使其達到平衡，從色譜分離柱輸出的洗脫液經過抑制器后流入電導流通池，由電導檢測器轉化為電信號，從而形成基線被測繪。(2)進樣和離子交換含有雙膦酸鹽類藥物的被測試樣在KOH洗脫液的推動下進入色譜分離柱產生離子交換，帶負電荷的雙膦酸鹽類藥物置換下色譜分離柱上的氫氧根離子并保留在色譜分離柱上。(3)洗脫將洗脫液連續輸送入色譜分離柱不斷將雙膦酸鹽類藥物和雜質陰離子在色譜分離柱上展開，各種雜質陰離子和雙膦酸鹽類藥物離子產生差速遷移而相互分離，在不同的保留時間被洗脫。(4)抑制電導檢測分析從色譜分離柱輸出的含雙膦酸根離子的溶液通過抑制器后，洗脫液KOH已被轉變成電離很小的水，因此其電導值也很小，而樣品陰離子則變成其相對應的酸；樣品流過電導流通池時由電導檢測器轉化為電信號，從而形成譜圖被記錄。
2. 根據權利要求1所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離分析 方法，其特征在于，所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子為阿倫膦酸鈉藥片 中阿倫膦酸鈉藥物及雜質離子、血漿中依替膦酸鈉藥物及雜質離子、生理鹽水 棊質中利塞膦酸鈉藥物及雜質離子或葡萄糖基質中唑來膦酸及雜質離子。
3. 根據權利要求2所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離分析 方法，其特征在于，所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子為阿倫膦酸鈉藥片 中阿倫膦酸鈉藥物及雜質離子，洗脫液為K0H溶液，采用梯度淋洗。0 2min時， 濃度選用1 mmol/L的氫氧化鉀；2 12 min時，濃度選用l咖ol/L 18 mmol/L; 12. 01 17. 00min，采用濃度為1 mmol/L的氫氧化鉀。
4. 根據權利要求2所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離分析 方法，其特征在于，所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子為血漿中依替膦酸 鈉藥物及雜質離子，洗脫液為KOH溶液，采用梯度淋洗。0 2min時，濃度選 用3 mmol/L的氫氧化鉀；2 12 min時，濃度選用lmmol/L 30mmol/L; 12.01 17.00min時，采用濃度為3 mmol/L的氫氧化鉀。
5. 根據權利要求2所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離分析方法，其特征在于，所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子為生理鹽水基質中利塞膦酸鈉藥物及雜質離子，洗脫液為KOH溶液，采用梯度淋洗。0 3min時， 濃度選用20mmol/L的氫氧化鉀；3.01 8.00min時，濃度選用45mmol/L; 8.01 15.00min時，采用濃度為20mmol/L的氫氧化鉀。
6. 根據權利要求2所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離分析 方法，其特征在于，所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子為葡萄糖基質中唑 來膦酸及雜質離子，洗脫液為KOH溶液，采用梯度淋洗。0 3min時，濃度選 用20mmol/L的氫氧化鉀；3.01 8.00min時，濃度選用45mmol/L; 8.01 15.00min 時，采用濃度為20mmol/L的氫氧化鉀。
7. 根據權利要求1所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離分析 方法，其特征在于，分離柱是IonPac ASll，尺寸為250 mmX2 mm;保護柱是 IonPac AGll，尺寸為50 mmX2 mm;進樣量為25 P L;淋洗液發生器為EG50; 電導檢測器為DS6。
8、 根據權利要求3或4所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離 分析方法，其特征在于，所用的抑制器為Dionex AAES自再生抑制器。
9、 根據權利要求5或6所述的雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離 分析方法，其特征在于，所用的抑制器為Dionex ASRS-ULTRA自再生抑制器。
全文摘要
本發明公開了一種雙膦酸鹽類藥物及其雜質陰離子的離子色譜分離分析方法，該方法由基線測繪、進樣和離子交換、洗脫和抑制電導檢測分析這幾個步驟組成；該方法可應用到雙膦酸鹽類藥片、血漿、生理鹽水基質和葡萄糖基質中的雙膦酸鹽的含量測定和陰離子雜質的含量測定。
文檔編號G01N30/00GK101251520SQ20081006001
公開日2008年8月27日 申請日期2008年2月29日 優先權日2008年2月29日
發明者張培敏, 巖 朱, 霞 焦 申請人:浙江大學