專利名稱：甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種酶促化學發光底物，特別是涉及一種甲酯化魯米諾酶促化學發光底物 系統。
背景技術：
近年來隨著分子生物學，基礎免疫學和免疫化學等學科的進展以及應用現代高新技術 建立的儀器分析日趨發展，免疫標記技術也不斷完善和更新；放射免疫，酶聯免疫技術已 逐步被免疫發光技術所取代。現今，酶促底物發光技術已成為推廣及應用最快的免疫分析 方法。酶促底物發光技術是將酶聯免疫方法中的顯色底物更換為發光底物，與相應的酶發 生氧化還原反應，產生光量子；通過計數光量子來確定待檢測物質的量。用于酶促發光法 中的首選標記物即辣根過氧化物酶(HRP)，均以魯米諾(Luminol)類物質作為發光底物， 但必需加入增強劑(液)及催化劑等多種成分以解決光信號弱，靈敏度底和量程短的問題， 經查閱國內，外文獻后發現，大多數研究者都是在增強劑上進行改進以提高技術水平，少 有對發光底物系統，尤其對不需要增強劑的底物系統進行研究。酶促發光免疫檢測技術中 關鍵試劑即發光底物，其原理是底物在特定條件下，經標記在抗原或抗體上的辣根過氧化 物酶(HRP)催化，發生氧化還原反應，產生光子，經化學發光儀測量光信號的強度，以標 準物發光信號的強度為縱坐標(Y軸)以標準物濃度為橫坐標(X軸)得以檢測被測物質的 含量。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種不需要增強劑就可以應用于化學發 光酶免疫測定技術中的甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統。 本發明的技術方案概述如下
一種甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統，由A試劑和B試劑組成，所述A試劑由 0. 90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾和pH為9. 6的0. 01M-0. 05 M碳酸鹽緩 沖液組成，所述B試劑由pH為9. 6的0. 01M-0. 05 M碳酸鹽緩沖液、0. 05mM- 0. lmM過氧 化脲和0. 15mM- 0. 30mM過氧苯酚組成。
優選的是:所述B試劑由pH為9. 6的0. 03 M碳酸鹽緩沖液、0. 07rnM過氧化脲和0. 20mM 過氧苯酚組成。
本發明的優點是
1.檢測范圍廣，本發明的甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統的發光強度在4 6個 量級之間與測定物質濃度間呈現良好的線性關系，在較廣的檢測范圍內確保了高靈敏度， 完全能滿足臨床檢測之需。2. 靈敏度高，本發明的底物系統具有高信號強度和低背景，且無需其它的信號增強劑。
3. 光信號持續時間長，該本發明的底物系統的光信號穩定時間可持續2.5小時，為臨 床檢測中的多次重復測量提供了可靠的保證。
4. 減少抗體用量2-3倍，極大的保證了應用本發明制備的試劑盒系列的低成本。
5. 分析方法簡便快速。
6. 與現有的化學發光底物相比具有組成成份簡單，價格低廉，制備方法簡單。 將本發明的一種甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統，應用于化學發光酶免疫測定技
術中，擬建立一系列新的臨床檢測試劑盒。
圖l為不同辣根過氧化物酶(HRP)化學發光底物系統發光信號強度和持續時間比較。
具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。 實施例1
一種甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統，由A試劑和B試劑組成，所述A試劑由 0. 90rnM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾和pH為9. 6的0. 03 M碳酸鹽緩沖液組 成，所述B試劑由pH為 9. 6的0. 03 M碳酸鹽緩沖液、0. 07mM過氧化脲和0. 20mM過氧 苯酚組成。
實施例2
一種甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統，由A試劑和B試劑組成，所述A試劑由 0. 90rnM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾和pH為9. 6的0. 01M碳酸鹽緩沖液組 成，所述B試劑由pH為 9. 6的0. 01M碳酸鹽緩沖液、0. 08rnM過氧化脲和0. 15rnM過氧苯 酚組成。
實施例3
一種甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統，由A試劑和B試劑組成，所述A試劑由 0. 90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾和pH為9. 6的0. 05 M碳酸鹽緩沖液組 成，所述B試劑由pH為 9. 6的0. 05 M碳酸鹽緩沖液、0. 05mM過氧化脲和0. 30mM過氧 苯酚組成。
實施例4
一種甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統，由A試劑和B試劑組成，所述A試劑由 0. 90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾和pH為9. 6的0. 03 M碳酸鹽緩沖液組 成，所述B試劑由pH為9. 6的0. 03 M碳酸鹽緩沖液、0. ImM過氧化脲和0. 20mM過氧苯 酚組成。
本發明所用的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾制備可以按本領域公知常識進 行制備，其中之一的方法是 (一)試劑 1甲醇
42鎂帶需要用6NHC處理鎂帶，或用砂紙打亮，稱取2.5克 3碘片 4濃硫酸 5濃鹽酸
6 1N氫氧化鈉
7 N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾 (二)操作步驟
1、 無水甲醇的制備將鎂帶2.5克，碘片0.3克加入圓底燒瓶中，再加入30ml甲醇， 可見發生沸騰反應，Mg在I的引發下與水作用生成Methoxide (甲醇鹽)。反應1小時后， 再加入700 ml甲醇，加熱沸騰回流反應30分鐘后，蒸餾，收集流出液即為無水甲醇。
2、 N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾的甲酯化采用蒸餾回流反應裝置附加安全瓶將 N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾，無水甲醇，濃硫酸，濃鹽酸及1N氫氧化鈉分別以適當 的濃度加入到不同反應瓶中，經甲酯化反應后，在20。C-30。C下放置18-30小時，使N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾完全甲酯化，將產物減壓抽干，加入5 ml無水甲醇再減壓抽 干，再加入5 ml無水甲醇減壓抽干，獲得干粉即為甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯 米諾，在室溫下可長期保存。
效果驗證數據檢測靈敏度0. lpg/ml信號持續時間2小時 抗血清稀釋度可達1: 20萬 保質期暫定9個月 保存條件室溫
優點本公司所發明的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾作為酶發光底物與當前現
有的產品比較有下述優點
1靈敏度高
2不需要增強劑
3持續發光時間長
4低的背景信號
以上特點可通過圖1顯示。 圖1中
0. 90 mM甲酯化H- (4-氨基丁酰)-H-乙基-異魯米諾發光信號 ~3—加入增強劑的l. H- (4-氨基丁酰〕-N-乙基-異魯米諾發光信號 ^A—加入增強劑的0. 9mM H- (4-氨基丁醜)-H-乙基-異魯米諾發光信號 +無增強劑的l. 5rnM H- (4-氨基丁翻)-H-乙基-異魯米諾發光信號
1. 5mM N- (4-氨基丁酰)-H-乙基-異魯米諾背景信號 ~^~0.90 mM甲酯化H-(4-氨基丁酰)-H-乙基-異魯米諾背景信號。
權利要求
1.一種甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統，其特征是由A試劑和B試劑組成，所述A試劑由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾和pH為9.6的0.01M-0.05M碳酸鹽緩沖液組成，所述B試劑由pH為9.6的0.01M-0.05M碳酸鹽緩沖液、0.05mM-0.1mM過氧化脲和0.15mM-0.30mM過氧苯酚組成。
2. 根據權利要求l所述的一種甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統，其特征是所述B 試劑由pH為9. 6的0. 03 M碳酸鹽緩沖液、0. 07mM過氧化脲和0. 20mM過氧苯酚組成。
全文摘要
本發明公開了一種甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統，由A試劑和B試劑組成，所述A試劑由0.90mM的甲酯化N-(4-氨基丁酰)-N-乙基-異魯米諾和pH為9.6的0.01M-0.05M碳酸鹽緩沖液組成，所述B試劑由pH為9.6的0.01M-0.05M碳酸鹽緩沖液、0.05mM-0.1mM過氧化脲和0.15mM-0.30mM過氧苯酚組成。本發明的甲酯化魯米諾酶促化學發光底物系統的發光強度在4～6個量級之間與測定物質濃度間呈現良好的線性關系，在較廣的檢測范圍內確保了高靈敏度，完全能滿足臨床檢測之需。
文檔編號G01N21/76GK101526479SQ20081005236
公開日2009年9月9日 申請日期2008年3月4日 優先權日2008年3月4日
發明者徐嘉轍, 趙學勤 申請人:天津遄赫工貿有限公司