專利名稱：艾滋病(hiv-1/2)唾液快速檢測試劑的制作方法
技術領域：
本發明專利是涉及醫學免疫診斷技術領域，特別是艾滋病病毒的唾液檢測試劑。
2.
背景技術：
(1)免疫膠體金技術是上世紀90年代發展起來的一種簡便、快速、準確的檢測技術， 其原理與雙夾心ELISA相似，不同的是使用膠體金結合蛋白質形成的復合物作為探針，且所 使用的試劑事先都被固定在具有微孔的硝酸纖維素膜上。使用時將一端置于檢測液中，硝酸 纖維素膜可被液體穿過，若檢測液中含有相關的抗原或抗體。在檢測區就會出現淡紅色線條。 否則為陰性。該技術問世以來己在臨床上不斷被采用，該方法不依賴于精密的儀器、不依賴 于熟練的技術人員、操作步驟簡捷，比起目前常用的酶聯免疫法具有更大的優點。整個反應 過程約在5分鐘內就可以完成。因而需要的樣品量少，檢測更為敏感和準確。建立上述快速、 簡便、特異的免疫分析方法。
在病毒和細菌等病原生物引起的傳染病中，實驗室診斷有著極重要的價值。實驗室診斷 乂分為病原學診斷和血清學(即免疫學)診斷兩大部分。前者雖具有確診感染和疾病的優點，
但檢出效果很不理想。因此，免疫學診斷已成為許多傳染病的主要檢測手段。 當前國內外使用最廣泛的血清學診斷方法為酶聯免疫吸附試驗(ELISA),檢測的目標物可為
抗體、亦可為可溶性循環抗原。與既往使用的血清學診斷方法(如間接血凝試驗、乳膠凝集
試驗、免疫熒光法和放射免疫試驗等)相比較、該類方法具有敏感性強、特異性高、操作相
對簡便等優點。但該法操作步驟多、技術要求高、檢測時間長達2 3小時，結果需借助儀器
判讀且結果無法保存。這些缺點限制了其在基層和現場的應用和推廣，更無法直接進入家庭。
(2)我國艾滋病膠體金診斷試劑盒的開發起步較晚，據國家藥品監督管理局公布的最新資料，
全國約有5個廠家的產品(均為以血清和血漿為檢測標本)通過了國家檢定，。艾滋病的檢測
可W此可以得到大大的改善。但以上問題仍未完全解決1).采血過程具創傷性，難以為受
檢者接受；2).采血過程存在污染和擴散傳播的潛在危險；3).檢測方法以血清或血漿為
樣品，需抽血分離血清或血漿，難在家中進行自我檢測。艾滋病人唾液中存在特異性抗體己
為大量的研究和調査所證實。以唾液為檢樣檢測艾滋病抗體和循環抗原的方法在國外已經開
始。以唾液為檢樣檢測艾滋病抗體和循環抗原的快速診斷試劑盒的開發，可以解決目前以血
清或血漿為樣品并單純檢測抗體檢測方法所存在的上述缺陷和問題。可以預測，隨著技術的
不斷完善，以唾液為檢樣檢測艾滋病抗體的快速膠體金免疫診斷試劑有著極好的市場前景。
3.
發明內容
本發明專利的目的在于公開一種結構簡單，檢測過程快速準確，應用層析法 (Lateral Flow Iramuno-Assay)膠體金免疫診斷技術的艾滋病唾液快速檢測試劑。膠體金檢測系統使用一種特殊的多孔膜(NC膜)作為固相抗原或抗體載體。該膜具有很強的蛋白吸附
功能，抗原或抗體吸附于NC膜并經干燥處理后即作為固相，可與液相中的相應抗體或抗原快
速結合。而在濕潤狀態下，液相(唾液)中含有的抗體或抗原可因"燈芯引流現象"作快速
定向泳動并與固相抗原或抗體結合成為復合物；結合物載體上預先噴點的結合有膠體金(作
為顯色和指示劑)的相應第二抗體或抗原亦可與該復合物快速結合。由于毛細作用復合物沿
紙條向前移動.移動至檢測線處,復合物被抗人-IgG單克隆抗體捕獲形成Au-fflVAg-mV抗體-
抗人-IgG單克隆抗體夾心物,呈現出一條紫紅色條帶.陰性標本則不會形成夾心物.游離的膠體
金標重組HIV抗原移動至對照線處被HIV單克隆抗體捕獲呈現出一條紫紅色條帶.對照線的
出現表明測試是有效的.
由于這種結合過程為物理過程，反應可在數分鐘內完成且結合非常穩定。這一技術的創
新點為加有輔助劑使抗原或抗體與固相膜載體牢固結合；應用特殊干燥技術使與固相膜載
體結合的蛋白保持穩定，從而達到試劑盒可在常溫下保存18個月到1年；膠體金制備和結合技
術；膠體金結合物的干燥和在常溫下長期保存技術；測試條中各種參試組分的最佳配比；為
達到整個測試反應在數分鐘內一步完成對測試條中各種原材料的測試選定和參試組分的最佳
配比。解決的技術關鍵問題(1).以HIV重組抗原構建高靈敏度的雙抗原夾心法系統，用
于檢測唾液中的特異性HIV抗體；(2).高靈敏度的雙抗原夾心法系統和高靈敏度的雙抗體夾
心法系統中金標記物的制備；(3).唾液快速采樣和樣品濃縮技術。
4.
具體實施例方式
4. 1.生產系統簡介
A用于生產快速免疫診斷試劑的專有設備從美國某公司定購進口。專門適用于在固相表面或 液相中噴點微量液體進行定性或定量反應(最小量4.2nl)。該系統適用于試紙條式系列診斷 產品，生物傳感器，藥物篩選，生物芯片等的研究和生產。包括系列噴點平臺、噴頭、粘貼 器、切割機、烘干機和真空包裝機等設備。該系統的年產量為400萬套(4個操作人員)。 B主要專用生產設備性能
a. 粘貼裝置將膜粘貼于制作母卡的塑料背板上；
b. 噴點系統可點狀或線形無接觸式噴點抗原或抗體以及標記膠體金抗體或抗原于膜或其它
載體上，最小量4. 2 nl/CM。
c. 切割機:可將母卡自動切割為試條，試條寬度任意選擇，最快切割速度為1.2CM/秒。
d. 壓模器:半自動式將裝有試條的試劑盒上下板壓合，最快速度為60個/分。
e. 真空包裝機
4. 2.生產工藝流程的技術路線A生產工藝過程
a. 膜的粘貼將膜粘貼于制作母卡的塑料背板上；
b. 抗原噴點與NC膜的處理NC膜的預切割D抗原(或抗體)噴點于NC膜上D干#0封閉口干 燥；
C.金標記第二抗體(或抗原)噴點于載體上O干燥；
d. 將吸水濾紙、標記第二抗體(或抗原)載體和樣品載體粘貼于噴點有抗原(或抗體)的NC 膜板上制成母卡O半成品質量檢定；
e. 母長切割半成品檢定合格后，將母卡切割成為試條d成品質量檢定；
d.試劑組裝將試條裝入專用塑料盒內，密封、包裝、成盒□保存□出廠。 4. 3、試劑組成采樣器、試劑條。
1) 操作步驟
a. 用采樣器取40 U 1待測微量唾液，加到測試紙條的加樣處。隨即滴加2滴樣本稀釋液， 若一分鐘后未見樣本遷移至檢測窗口，則需再加1滴樣本稀釋液。
b. 加樣后，陽性標本因其強弱不同可在1 20分鐘內檢出，20分鐘后判讀結果無效
2) 結果判斷
陽性測試紙條在檢測區和對照區位置出現紫紅色條帶，任何可見的紫紅色條帶只要在檢
測區出現，不論深淺均解釋為陽性。 陰性測試紙條只在對照線位置出現一條紫紅色條帶。 失效對照區未出現紫紅色條帶或僅在檢測區出現紫紅色條帶
表明不正確的操作過程或試劑盒已變質損壞。
3) 試劑保存于4-30°C，避免凍結。有效期18個月.
權利要求
1.一種艾滋病(HIV-1/2)唾液快速檢測試劑其特征是用于檢測唾液中艾滋病抗體，可用于臨床診斷。(1).以HIV重組抗原構建高靈敏度的雙抗原夾心法系統，用于檢測唾液中的特異性HIV抗體高度純化的HIV重組抗原HIV-1 gp41、P24和HIV-2 gp36、高靈敏度的雙抗原夾心法系統構建。(2).抗HIV抗原HIV-1 gp41、P24和HIV-2 gp36單克隆抗體細胞株克隆、篩選、鑒定，大規模單克隆抗體細胞培養和收獲，以及單克隆抗體純化。(3).上述兩個檢測系統中金標記物的制備高靈敏度的雙抗原夾心法系統和高靈敏度的雙抗體夾心法系統中金標記物的制備。(4).唾液的快速樣品濃縮技術唾液作為待測樣品進行檢測時，由于唾液中含有的特異性抗體和抗原的含量要較血清或血漿少的多，這就需要該檢測系統的靈敏度更強。本項目使用的濃縮墊可使樣品在加樣瞬間濃縮10～100倍，從而提高檢測系統的敏感性。
2. 原材料選擇與制造(1) NC膜選用美國Milipore或國產膜公司膜，膜孔徑(5-8) um。(2) 濾紙墊片普通實驗用濾紙；(3) 樣品稀釋液PBS緩沖液；(4) 抗原膠體金記物(HIV-1/2)重組蛋白抗原和抗HIV-1 gp41, P24和HIV-2 gP36單克隆 抗體膠體金記物)；特異性抗原選用基因工程表達的重組蛋白HIV-1 gP41、 P24和HIV-2 gp36作為固相抗原。
3. 工藝過程和技術參數的確定(1) 艾滋病重組抗原(HIV-1 gp41、 P24和HIV-2gp36)和抗HIV-lgp41， P24和HIV-2 gp36 單克隆抗體的膠體金標記(2) 30 40 nm膠體金溶液的制備；(3) 膠體金溶液結合重組抗原最佳濃度和量的選擇；(4) 試劑盒半成品和成品制備過程中需確定的主要技術參數(5) 抗原噴點濃度、體積和量； (6)完成檢測步驟所需時間的確定。
4. 最佳抗原噴點濃度和抗原膠體金標記物工作濃度 以標準陽性和陰性血清為測試樣品，在保證試劑盒性能(如靈敏度、特異性和精密度)前提下， 采用方陣滴定選擇最佳包被抗原或抗體濃度、待測樣品稀釋濃度和膠體金記抗體相應的工作 濃度，以及加樣體積。根據重復3次的測試結果，確定本試劑盒的配方、參數和條件。
全文摘要
一種艾滋病(HIV-1/2)唾液快速檢測試劑是采用雙抗原夾心法原理，以純化的重組HIV-1/2抗原固定于纖維膜上。使用時加入待測唾液。如樣品中含有抗HIV-1/2特異性抗體，則與膜表面的相應抗原結合形成復合物。復合物被抗人-IgG單克隆抗體捕獲形成Au-HIVAg-HIV抗體-抗人-IgG單克隆抗體夾心物，呈現出一條紫紅色條帶.陰性標本則不會形成夾心物。靈敏度高，更好的特異性和穩定性，具有操作簡便、無需儀器、可單人份及時檢測艾滋病病毒。檢測過程縮減成一步并在5分鐘內完成，應用包括醫院、防疫站、出入境檢疫局，現場的疾病診斷。家庭自檢。艾滋病檢測用唾液直接檢測，避免血液的交叉感染，徹底解決了實驗室檢測技術的缺陷，檢測無創傷，速度快，方便安全。填補了國內空白。
文檔編號G01N33/571GK101539575SQ20081004499
公開日2009年9月23日 申請日期2008年3月17日 優先權日2008年3月17日
發明者潔 陳 申請人:潔 陳