專利名稱：量子點標記免疫層析試紙快速檢測膀胱癌方法
技術領域：
本發明屬于醫學檢驗技術，具體地說是一種量子點標記免疫層析試紙快 速檢測膀胱癌方法。
背景技術：
膀胱癌是一種惡性腫瘤疾病，死亡率高，全球每年約有幾十萬個新膀胱 癌病例發生，患病率越來越高，已經成為導致死亡的重要原因之一。早期發 現，及時診斷是挽救膀胱癌患者的有效手段。現代醫學對膀胱癌檢測最常用
的方法是膀胱鏡、超聲波、CT等。但是膀胱鏡檢測病人很痛苦，很多患者因 此不愿檢測，延誤了病情；而超聲波、CT檢測除了檢查費高外，程序也較煩 瑣。所以發明一種能夠簡便靈敏的檢測膀胱癌的方法，對于提早發現和診斷 膀胱癌疾病，減輕膀胱癌患者痛苦，挽救膀胱癌患者的生命是十分有意義的。
現代醫學研究證明人的尿液中有一種纖維連接蛋白(即Fn),膀胱 癌患者排放的尿液中所含的纖維連接蛋白的量比正常人尿中Fn的量明顯升 高，而且隨著病理分級的增高而增高。檢測病人尿中纖維連接蛋白的濃度， 就可以確診和判斷膀胱癌，準確率85%以上。
本發明是一種利用量子點標記免疫層析試紙，快速檢測膀胱癌患者的尿 液中所含纖維連接蛋白量，確診和判斷膀胱癌的方法。
發明內容
本發明的目的是為了提供一種檢測方法簡單，病人痛苦少，膀胱癌診斷 準確的醫學檢測方法。
本發明的目的是這樣實現的
量子點標記免疫層析試紙快速檢測膀胱癌方法，包括以下步驟\(1) 取0. 01M PBS緩沖液100 200uL與5 20uL表面連有羧基的 量子點，用l 20mg N-羥基硫代琥珀酸亞胺和 l 20mg 1_(3-二甲 基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽作為偶聯試劑，加入單克隆抗人纖維 連接蛋白150 200uL搖床反應1 4小時，層析柱過濾，離心化，1% 5%的牛血清白蛋白封閉，4。C保存；
(2) 將量子點標記單克隆抗人纖維連接蛋白均勻噴覆于玻璃纖維 膜上，室溫干燥，4。C保存；用0. 05 0. 15M包被緩沖液稀釋纖維連接 蛋白多克隆抗體、兔抗鼠二抗分別噴覆于硝酸纖維素膜上，室溫晾干， 將膜放入PBS緩沖液中，37t:封閉，干燥后4"C保存；
(3) 在塑料板上粘貼玻璃纖維膜、量子點標記單克隆抗人纖維連 接蛋白的玻璃纖維膜和分別包被纖維連接蛋白多克隆抗體、兔抗鼠二抗 的硝酸纖維素膜、吸水紙，將粘貼好的塑料板切成3 5皿的試紙條；
(4) 將量子點與單克隆抗人纖維連接蛋白混合，離心分離，得樣 品4。C保存；取50ul所制的樣品用PBS稀釋至3ml在熒光分光度計下
上述的量子點標記免疫層析試紙快速檢測膀胱癌方法中PBS緩沖 液為含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸鹽溶液，ra7.4;包被緩沖液為 0. 05 0. 15M的含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸鹽溶液。
本發明的要點在于將水溶性的量子點與特異性的抗體通過共價偶聯， 然后利用雙抗夾心原理結合量子點的熒光性質檢測樣品中是否含有目標物。 在紫外燈的照射下，通過觀察免疫層析試紙條上檢測帶和質控帶的熒光線， 判斷檢測結果。本發明將免疫反應的高特異性和量子點的熒光特性相結合， 利用量子點多波長激發、高強度熒光發射、發射峰窄、峰形對稱、發光穩定 性好的熒光特性，建立了快速、特異、簡便、靈敏的免疫層析檢測方法。通過觀察熒光信號達到了定量檢測的目的。該方法的檢測靈敏度比目前常用的
一種快速檢測方法——膠體金的檢測靈敏度高約1000倍左右。由于金標試
紙是通過肉眼觀察，存在其自身的缺陷，而量子點標記抗體復合物卻能夠彌 補這一缺陷，所以達到較高的靈敏度。半導體量子點是無機納米晶體，它的 出現，以其獨特的優點，例如具有光穩定性好、較寬的激發光譜與較窄的發 射光譜、激發與發射光譜分離、可調諧發射光譜的波長等光學特性，解決了 有機熒光基團標記物易被光漂白、發射光譜較寬、以及不同熒光基團需不同
激發光源的諸多缺陷；隨著量子點生物兼容性的發展，使其成為生物科學和 醫學研究領域中極具特色的熒光標記探針。
本發明采用免疫層析原理的雙抗夾心方法，首先是基于將己修飾了羧基 的熒光納米量子點與生物分子上的氨基通過一系列交聯劑，使量子點上的羧 基與生物體上的氨基形成共價鍵(酰胺鍵)，從而達到將量子點穩定結合在
抗體上的目的，并且除去未結合的抗體，使之成為標記特異性抗體的前提保 證。本實驗利用免疫層析法原理將一抗-量子點復合物先固定在待測樣品的 玻璃纖維膜上，當干燥后的玻璃纖維膜一端浸入樣品尿液后，由于毛細管作 用，樣品沿著玻璃纖維膜向前移動，當移動至固定有一抗-量子點復合物的 區域時，樣品中相應的抗原即與該一抗-量子點復合物發生特異性結合，形 成了一個"量子點- 一抗-抗原"復合物，該復合物繼續移動至硝酸纖維膜 上的固定有多抗的檢測線區域時，由于特異的抗原抗體免疫結合，多抗會通 過與抗原反應固定、富集"量子點- 一抗-抗原"復合物，該區域在紫外照 射下會顯示熒光，從而達到檢測目的，實現免疫診斷。
本發明用共價偶聯方法連接量子點-抗體復合物效果明顯，并且用牛血 清白蛋白封閉消除了非特異性吸附的存在，利用雙抗夾心法檢測待測液樣品 達到檢測膀胱癌的目的，檢測限低，靈敏度高，具有比同類檢測手段更大的優勢。
本發明的優點是1、檢測方法簡單、成本低；2、靈敏度高，檢測結果 準確；3、適用樣本多，適用于尿樣、也適用于血樣、唾液等樣本；4、應用 廣，可應用于激素、蛋白質、病毒、毒品、細菌、環境污染等檢測；5、使 用范圍大，除了在醫院使用，也可在海關、機場、家庭等場所使用。
圖1為樣品和游離的量子點熒光圖。
紅線為樣品熒光圖，綠線為游離的量子點熒光圖，該量子點的發射波長 為650nm。圖1說明了量子點已成功的連接到抗體上。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發明做進一步說明。
一、樣品制備和試紙條的制作
1. 量子點標記抗體
取PH 7.4的含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸鹽溶液150uL與10uL 表面連有羧基的量子點，用10mg N-羥基硫代琥珀酸亞胺和10mg 1-(3_二 甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽作為偶聯試劑，加入單克隆抗人纖維連接 蛋白150uL在搖床上反應2小時，反應產品通過s印hadex-G-100(lX35cm) 層析柱過濾，去除未參加反應的抗體，離心純化，用4%的牛血清白蛋白封閉， 4'C保存備用。
2. 玻璃纖維膜和硝酸纖維素膜處理
將量子點標記單克隆抗人纖維連接蛋白均勻噴覆于玻璃纖維膜上，室溫 干燥后封袋，4'C保存備用。用0.05 0. 15M含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷 酸鹽包被緩沖液稀釋到設定濃度0. 03 0. 05mg/ml，纖維連接蛋白多克隆抗 體、兔抗鼠二抗分別噴覆于硝酸纖維素膜上，形成T線和C線，室溫晾干，將硝酸纖維素膜放入含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸鹽緩沖液中，37。C封 閉，干燥后封袋，4'C保存。
3. 免疫層析試紙條的制備
在塑料板上依次粘貼上玻璃纖維膜、量子點標記單克隆抗人纖維連接蛋 白的玻璃纖維膜和分別包被纖維連接蛋白多克隆抗體、兔抗鼠二抗的硝酸纖 維素膜、吸水紙，將粘貼好的塑料板切成3 5mm寬的試紙條，裝袋待用。
4. 按上述樣品制備的方法，將量子點與單克隆抗人纖維連接蛋白混合反 應，最后反應產物通過離心分離，除去未反應的量子點，得樣品保存在4。C 備用。取50ul所制的樣品用PBS稀釋至3ml在熒光分光度計下觀測。結果 見圖1。
二、病例檢測
5. 將準備好的免疫試紙條插入待測樣品尿液中，全部試驗過程10分鐘， 取出試紙條在紫外燈下觀察結果。膜上的檢測線和質控線處都有紅色的熒 光，說明患者尿液樣品中含有纖維連接蛋白的量達到檢測限并得到定量的結
果。檢驗結果陽性。
6. 將準備好的免疫試紙條插入待測樣品尿液中，全部試驗過程10分鐘， 取出試紙條在紫外燈下觀察結果。膜上只有質控線上出現紅色的熒光，說明 患者尿液中所含纖維連接蛋白的量在檢測限以下并得到定量的結果。檢測結
果陰性。
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本 領域的技術人員來說，本發明可以有更改和變化。凡在本發明的精神和原則 之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包括在本發明的保護范圍之 內。
權利要求
1、一種量子點標記免疫層析試紙快速檢測膀胱癌方法，包括以下步驟(1)取0.01M PBS緩沖液100～200uL與5～20uL表面連有羧基的量子點，用1～20mgN-羥基硫代琥珀酸亞胺和1～20mg1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二胺鹽酸鹽作為偶聯試劑，加入單克隆抗人纖維連接蛋白150～200uL搖床反應1～4小時，層析柱過濾，離心純化，1％～5％的牛血清白蛋白封閉，4℃保存；(2)將量子點標記單克隆抗人纖維連接蛋白均勻噴覆于玻璃纖維膜上，室溫干燥，4℃保存；用0.05～0.15M的包被緩沖液稀釋纖維連接蛋白多克隆抗體、兔抗鼠二抗分別噴覆于硝酸纖維素膜上，室溫晾干，將膜放入PBS緩沖液中，37℃封閉，干燥后4℃保存；(3)在塑料板上粘貼玻璃纖維膜、量子點標記單克隆抗人纖維連接蛋白的玻璃纖維膜和分別包被纖維連接蛋白多克隆抗體、兔抗鼠二抗的硝酸纖維素膜、吸水紙，將粘貼好的塑料板切成3～5mm的試紙條；(4)將量子點與單克隆抗人纖維連接蛋白混合，離心分離，得樣品4℃保存；取50ul所制的樣品用PBS稀釋至3ml在熒光分光度計下觀測到定量的結果。
2、根據權利要求1所述的量子點標記免疫層析試紙快速檢測膀 胱癌方法PBS緩沖液為含有牛血清白蛋白和蔗糖的磷酸鹽溶液， PH7. 4。
全文摘要
本發明公開了一種量子點標記免疫層析試紙快速檢測膀胱癌方法。現在膀胱癌檢測的方法是膀胱鏡、超聲波、CT等，但是這些方法檢測程序煩瑣、病人痛苦。本發明利用量子點標記免疫層析試紙，快速檢測膀胱癌患者的尿液中所含纖維連接蛋白量，確診和判斷膀胱癌。本發明檢測方法成本低、方法簡單；適用于血樣、尿樣、唾液等樣本；可應用于激素、蛋白質、病毒、毒品、細菌、環境污染等檢測；可在醫院、海關、機場、家庭等場所使用。
文檔編號G01N33/577GK101339196SQ20081004113
公開日2009年1月7日 申請日期2008年7月29日 優先權日2008年7月29日
發明者菲 方, 沈鶴柏 申請人:上海師范大學