專利名稱：測定草酸濃度的簡便方法
測定草酸濃度的簡便方法
技術領域：
本發明涉及草酸的濃度測量技術領域，具體地說，是利用合成的金屬絡 合物與草酸被草酸氧化酶分解所產生的產物過氧化氫反應，生成一種能夠被 紫外吸收的物質從而測定草酸濃度的簡便方法。
背景技術：
草酸是一種在細胞代謝過程中大量產生的、對幾乎所有的生物體都有毒 性的有機物，其在人體內大量累積會導致多種疾病。測定血液、尿液、蔬菜、 植物中草酸的濃度，對高草酸尿癥、慢性腎功能衰竭以及腎結石等與草酸相 關疾病的預防、診斷和治療都有很重要的理論意義和實際應用價值。因此， 如何簡單、準確、有效地測定草酸的濃度一直是人們探索的課題。目前文獻 報道測定草酸濃度的方法可以分為以下幾種(1)直接沉淀法，(2)溶劑萃
取法，(3)同位素稀釋法，(4)色譜法(氣相和液相法)，(5)酶法(包括溶 解和固相化的酶)，(6)流動方法，(7)其它方法。
其中，直接沉淀法和溶劑萃取法靈敏度較低；同位素稀釋法因為使用放 射性同位素，所以限制了該方法在人體的應用，而且整個過程需要的樣品量 較大；色譜法在樣品量(體積)較小方面有一定的優勢，但需要較長的準備 色譜柱的時間和特定的儀器設備；酶法主要是測定草酸被分解后的產物C02 和過氧化氫，其中C02可通過檢測緩沖溶液的pH值變化來檢測，但反應時間 較長，而且需要較大量的樣品(體積)；過氧化氫在第二種酶，如過氧化物酶的催化下，可以使指示劑，如酚紅，己二酸二甲酯(DMA)和3-甲基-2-苯并噻 唑腙鹽酸鹽(MBTH)產生能夠被紫外吸收的物質，從而間接檢測草酸的濃度; 但這種方法的背景讀數較大，而且經過兩次酶促反應，誤差較大，盡管如此， 酶法因其快速靈敏仍被廣泛應用。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供誤差小，靈敏度高，成本 低，時間短的測定草酸濃度的簡便方法。
本發明是利用一種合成的金屬絡合物與草酸被草酸氧化酶分解所產生的 產物過氧化氫發生反應，生成一種能夠被紫外吸收的物質來測定草酸濃度的 簡便方法。
為實現以上發明目的，本發明測定草酸濃度的簡便方法為
(1) 在2-氯甲基吡啶與P-丙氨酸類化合物的水溶液中，在pH 8 — 10的 條件下進行反應，反應完畢后用乙酸乙酯萃取，除掉未反應完的原料，再用 氯仿進行萃取，保留有機相，除去氯仿后，得到3NO類配體；合成的配體和 高氯酸錳在甲醇中反應生成錳絡合物，其中，3NO類配體是指配體中含有三 個氮原子和一個氧原子與錳離子配位；
(2) 將制備的金屬錳絡合物溶解在pH為6.0， 20mM丁二酸鈉緩沖溶液 里，再和濃度為1 400 nM的過氧化氫標準樣品在5(TC下反應40分鐘，測 定反應產物在波長為450 nm的吸光度，做出過氧化氫的標準樣品在波長為450 nm時吸光度的標準曲線，其中，正常尿樣中草酸的濃度范圍大約為1 400 ^M， 450 nm是指金屬絡合物與過氧化氫反應生成絡合物的紫外吸收波長；
G)將未知草酸濃度的樣品與過量草酸氧化酶加入到pH為6.0， 20 mM丁二酸鈉緩沖溶液中進行反應10分鐘；
(4)再將步驟(3)的產物與步驟(1)制備的金屬絡合物進行反應，測 定反應產物在波長為450nrn的吸光度，然后與過氧化氫的標準樣品在波長為 450nrn時吸光度的標準曲線比較，就可得到樣品中草酸的濃度。
所述的錳絡合物，是指含有單個或多個錳離子的絡合物。
本發明測定草酸濃度的簡便方法的積極效果是
(1) 金屬絡合物本身在波長為450 nm的吸收很小，因此幾乎沒有受到 金屬絡合物的影響；
(2) 金屬絡合物穩定性好，適用pH范圍為3 6;
(3) 金屬絡合物與過氧化氫反應后，產物能夠被波長為450 nm紫外吸 收，而不需要加入第二種酶和指示劑進行染色，減少了測試誤差；
(4) 檢測所用的樣品(體積)較小；
(5) 該方法的靈敏度較高，最低可以檢測到草酸濃度lpM;
(6) 檢測過程中只需要紫外吸收儀等簡單的儀器，成本低，時間短，易 于推廣。
具體實施方式
以下提供本發明的測定草酸濃度的簡便方法的具體實施方式
，共提供2 個實施例，但本發明不限于所提供的實施例。
過氧化氫的標準樣品在波長為450nm時吸光度的標準曲線繪制 (1)在2-氯甲基吡啶與P-丙氨酸類化合物的水溶液中，將其pH調到8-10 進行反應，反應完成后，再用乙酸乙酯萃取除掉未反應完的原料，再用氯仿 萃取，保留有機相，除去氯仿后，得到3N0類配體；合成的配體和高氯酸錳在甲醇中反應生成錳絡合物；
(2)取上述的金屬錳絡合物lmM，溶解在pH為6.0， 20 mM 丁二酸鈉 緩沖溶液里，再與濃度為1 400 pM的過氧化氫標準樣品在5(TC下反應40 分鐘，測定反應產物在紫外吸收波長為450nm時的吸光度，做出過氧化氫的 標準樣品在波長為450 nm時吸光度的標準曲線，其中，1 mM金屬錳絡合物 是能夠檢測到lpM草酸的金屬錳絡合物的最低濃度。
實施例1測定己知草酸濃度的標準樣品
(1) 將樣品100微升和過量草酸氧化酶在.40。C， pH為3.5， 20mM丁二 酸鈉緩沖液中反應10分鐘；
(2) 將步驟(1)得生成的過氧化氫和金屬絡合物加入到pH為6.0， 50 mM 的丁二酸鈉緩沖液中在50"C下反應40分鐘；
(3) 測定步驟(2)得到的混合物在紫外吸收波長為450nm時的吸光度； 再與過氧化氫的標準樣品在波長為450nm時吸光度的標準曲線對照，可得到 樣品中草酸的濃度。
實施例2測定正常人尿樣中草酸濃度
(1) 尿樣預處理首先將尿樣用濃鹽酸酸化，用丁二酸將樣品，pH調 至3.5，稀釋3倍后，用活性碳處理樣品，過濾，濾液為預處理后的尿樣；
(2) 取預處理后的尿樣500微升與草酸氧化酶加入到30°C, pH為3.5， 20 mM 丁二酸鈉緩沖液中反應10分鐘；
(3) 將金屬錳絡合物與步驟(2)生成的過氧化氫在pH為6.0， 2ml的 50 mM的丁二酸鈉緩沖液中在50'C下反應40分鐘；(4)測定步驟(3)反應產物在紫外吸收波長450nm時的吸光度，與過 氧化氫的標準樣品在波長為450nrn時吸光度的標準曲線比較，獲得尿樣中草 酸的濃度為453 505j^M。
權利要求
1.測定草酸濃度的簡便方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將2-氯甲基吡啶與β-丙氨酸類化合物的水溶液在pH 8-10的條件下進行反應，反應完畢后用乙酸乙酯萃取，除掉未反應完的原料，再用氯仿萃取，保留有機相，除去氯仿后，得到3NO類配體；合成的配體和高氯酸錳在甲醇中反應，得到錳絡合物；(2)將制備的金屬錳絡合物溶解在pH為6.0，20mM丁二酸鈉緩沖溶液里，再和濃度為1～400μM的過氧化氫標準樣品在50℃下反應40分鐘，測定反應產物在波長為450nm的吸光度，做出過氧化氫的標準樣品在波長為450nm時吸光度的標準曲線；(3)將未知草酸濃度的樣品和過量草酸氧化酶加入到pH為6.0，20mM丁二酸鈉緩沖溶液中進行反應10分鐘，將草酸完全轉化為等量的過氧化氫；(4)再將步驟(3)的產物與步驟(1)制備的金屬絡合物進行反應，測定反應產物在波長為450nm的吸光度，然后與過氧化氫的標準樣品在波長為450nm時吸光度的標準曲線比較，就可得到樣品中草酸的濃度。
2. 根據權利要求1所述的測定草酸濃度的簡便方法，其特征在于，所述 的錳絡合物，是指含有單個或多個錳離子的絡合物。
全文摘要
本發明涉及測定草酸濃度的簡便方法，其步驟為(1)利用合成的3NO類配體和高氯酸錳進行反應，制備錳絡合物；(2)將制備的金屬錳絡合物和濃度為1～400μM的過氧化氫標準樣品進行反應，測定反應產物在波長為450nm的吸光度，做出過氧化氫的標準樣品在波長為450nm時吸光度的標準曲線；(3)將未知草酸濃度的樣品與過量草酸氧化酶進行反應，將草酸分解為等量的過氧化氫；(4)再將步驟(3)的產物與步驟(1)制備的金屬絡合物進行反應，測定反應產物在波長為450nm的吸光度，然后與過氧化氫的標準樣品在波長為450nm時吸光度的標準曲線比較，就可得到樣品中草酸的濃度。該方法的優點是簡單，靈敏度高，成本低，時間短。
文檔編號G01N21/75GK101493417SQ20081003288
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月22日 優先權日2008年1月22日
發明者姜曉軍, 左冠科, 張井巖 申請人:華東理工大學