豬n-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法及其應用的制作方法

專利名稱：豬n-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法及其應用。
技術背景長期以來人們認為豬乳能夠提供足夠量的氨基酸以滿足哺乳仔豬的生長需 要，但近年來的研究卻表明當豬乳作為仔豬唯一的日糧蛋白來源時，哺乳仔豬 并不能夠獲得最佳的生長性能，研究結果表明仔豬7-21日齡時母乳中的精氨酸 供應及仔豬內源合成的精氨酸是限制仔豬最佳生長需要主要因素之一，因此增 加哺乳仔豬的精氨酸供應有助于發揮新生仔豬的最大生長潛力。N-乙酰谷氨酸(NAG)是精氨酸的內源合成途徑第一個合成酶一氨基甲酰 磷酸合成酶(CPSI)的變構激活劑(Adadjieva et al., 2001)。 N-乙酰谷氨酸 合成酶(NAGS)存在在肝臟和腸線粒體中，它能催化谷氨酸和乙酰輔酶A合成 N-乙酰谷氨酸。在哺乳仔豬的小腸粘膜和肝臟的線粒體中由于N-乙酰谷氨酸合 成酶的不足致使N-乙酰谷氨酸的合成量不足，從而降低腸道瓜氨酸和精氨酸的 合成，導致哺乳仔豬精氨酸缺乏。雖然在哺乳仔豬的奶替代日糧中添加精氨酸 可以極大的提高其生產性能，但由于全自動人工飼喂系統成本昂貴，不適于實 際的養豬生產。因此如何檢測不同日糧水平和不同發育階段豬NAGS在體內的分 布和表達活性的變化，以闡明NAG缺乏的潛在分子機制和尋找內源性精氨酸的 營養調節的實用方法是目前亟待解決的問題。 發明內容本發明的目的在于提供一種豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法 及其應用。這種抗體能檢測不同日糧水平和不同發育階段豬NAGS在體內的分布 和表達活性的變化。本發明豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟 l)克隆豬的NAGS基因，根據該基因序列設計并合成引物TGAAGCCTCTGGTGGTTCTGGGGCTG-3';NAGSR: 5， -CTGCAGGTCGACTCATTCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCCG-3，， 其中5"aJl酶切位點5' G' TCGAC 3' ， 酶切位點5' G' AATTC 3'，CATCACCATCACCATCAC為六個組氨酸標簽，通過RT-PCR擴增豬NAGS基因的編碼 區序列，其全長為1107 bp;2) 將步驟1)獲得的表達全長豬N-乙酰谷氨酸合成酶的重組原核表達質 粒pLMl-NAGS轉化到大腸桿菌BL21中；3) 培養轉化重組質粒的BL21到OD值為0. 4;4) 在培養的大腸桿菌BL21中加入IPTG 0. 2mM，誘導；5) 將誘導后的菌體離心收集，用PBS重懸，加入溶菌酶裂解，再超聲波 破碎，把破碎后的菌液離心，收集上清；6) 使用Hitrap chealting HP鎳親和層析柱純化蛋白；7) 用純化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作為抗原免疫日本大耳白黑眼兔，得 到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗體，用不完全福氏佐劑加強；8) 測抗N-乙酰谷氨酸合成酶的血清效價，取血，得到相應的抗血清。 本發明的應用在于檢測不同發育階段NAGS在哺乳仔豬體內的分布和表達活性的變化，以闡明NAG缺乏的潛在分子機制，從而為尋找內源性精氨酸的營 養調節提供了一個新的有效途徑的應用。本發明得到的豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體，這種抗體能檢測不同日 糧水平和不同發育階段豬NAGS在體內的分布和表達活性的變化，以便人們尋找 內源性精氨酸的營養調節的實用方法。本發明為深入闡明豬NAGS基因的功能及 其表達調控規律奠定了基礎。


圖1是重組質粒pLM卜NAGS圖譜(包括NAGS基因插入區域)。 圖2是插入的NAGS基因序列(包括特異性酶切位點、組氨酸標簽、NAGS全 長c腿)。圖3是重組質粒pLMl-NAGS在大腸桿菌BL21 (DE3)中高效表達的SDS-PAGE電泳及Western blot鑒定圖。
具體實施方式
1基因克隆取新鮮健康豬肝組織，用RNA抽提試劑盒，按常規的異硫氰 酸胍法提取總RNA。根據我們首次克隆的豬NAGS的基因序列(GenBank登錄號 EF429095)設計并合成引物。正向引物5'ATGGACATGAAGCCTCTGGT GG3';反向 引物5' TCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCC 3'.以豬肝臟總RNA為模板，用上述引物通 過RT-PCR擴增豬NAGS基因的編碼區序列，其全長為1107 bp,核苷酸序列見 圖2。2重組質粒pLMl-NAGS構建根據豬NAGS的基因序列設計并合成引物TGAAGCCTCTGGTGGTTCTGGGGCTG-3，；NAGSR: 5' -CTGCAGGTCGACTCATTCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCCG-3，。其中6^71酶切位點5， G， TCGAC 3， ， AcoM酶切位點5' G' AATTC 3，，CATCACCATCACCATCAC為六個組氨酸標簽。PCR反應體系(50uL): 10XPCR緩沖液5 u L， MgCl2 (20腿ol/L) 4uL， dNTPs (1O誦ol/L) In L，引物NAGSF(10pmol/uL)和引物NAGSR(10pmol/uL) 各2.5"L ，模板DNA(約100ng/uU 1 u L， Taq DNA聚合酶(5U/uL)各 0. 5uL。 PCR程序94。C 4min ;94。C 45sec ，63°C 45sec ， 72°C 90sec ,共30個 循環；72°C 8min。使用fco7 l和雙酶切純化的PCR產物和pLMl載體，室溫連接。然后 將連接產物轉化A co7i'DH5oc感受態細胞。使用雙酶切法篩選陽性克隆子，并 將篩選到的陽性克隆進行測序驗證即得到pLMl-NAGS重組質粒。 3重組NAGS蛋白的表達、純化將pLM1-NAGS重組質粒轉化入大腸桿菌中，首先37'C震蕩培養，當菌液0D 值達到0. 4時，加入0. 2mM IPTG，誘導NAGS重組蛋白的大量表達。室溫震蕩 培養6hr后，4000rpm離心收集菌體，超聲破碎菌體，10次X3組，每次6s， 每組間隔10s，然后4'C， 8000rpm離心，含有NAGS重組蛋白的粗蛋白在上清和Western blot鑒定。 4兔抗豬NAGS血清的制備將純化蛋白以0.25mg/kg與等量弗氏完全佐劑進行多點皮下注射；首免后 每隔14-20天加強免疫一次，共加強4次(每次間隔兩周)。從耳緣靜脈采取少 量血液，經瓊脂糖雙向擴散試驗證明陽性后，頸動脈插管收集血清，加0.1%疊 氮鈉-2(TC保存。5兔抗豬NAGS多克隆抗體的鑒定 5. 1 ELISA測定抗體效價(1) 包被用pH9.6的PBS將純化蛋白稀釋至約10嗎/ml,微量反應板上每孔O.lml,置濕盒中，37。C溫育2h，轉入418h。C以上。(2) 洗滌傾去孔內液體，用洗滌緩沖液洗滌三次(每孔200pl)，每次5min。(3) 封閉；每孔加入100nl的l。/QBSA-PBS于37O(:封閉2h;(4) 洗滌同(2)(5) 加樣；待檢血清、陰性血清均用稀釋緩沖液作梯度稀釋，每孔10(V1。(6) 洗滌同(2)(7) 加HRP-SPA:按工作效價稀釋后每孔100pl，置濕盒中，37。C溫育lh。(8) 洗滌同(2)(9) 加入100^il新配制的底物緩沖夜(OPD) ， 37。C溫育10-20min;(10) 加入50pl的終止液；(11) 經ELISA測定，所制備的多克隆抗體效價為l: 25600。 5.2 Western blot分析將制備的多克隆抗體以l: 2000稀釋進行Westem blot分析，結果在NC膜上 看到40kDa處的特異性條帶。6 ELISA法檢測pNAGS在Vero細胞中的表達動力學 6.1ELISA檢測樣品的制備采用脂質體介導方法將pCI-NAGS轉染Vero細胞，轉染后，每隔12h，用胰酶 消化，0.01M/LPBS (pH7.2)洗滌一次，4°C， 2000 g離心10min，收集細胞， 沉淀重懸于100W PBS，反復凍融3次后，用0.06% Triton-lOO室溫裂解細胞15min， 4°C， 2000g離心10min，收集上清液，-40。C保存備用。 6.2ELISA檢測chlL-2的表達動力學用純化的pNAGS抗體包被96孔酶標板(2.5 (^g/ml)， 37。C溫育l h后轉入4'C 過夜，5。/。的脫脂奶封閉lh， PBST洗3次后加入100 pl待檢樣品，37。C孵育lh。 PBST洗3次后加入純化的兔抗豬NAGS (10pg/ml)， 37'C孵育1 h。 PBST洗3 次后加入5000倍稀釋的HRP-羊抗兔IgG后37"C孵育lh，PBST洗8次后加底物 37。C溫育10分鐘，最后用2MH2S04終止反應，用酶標儀讀取各孔在OD 490nm 值。檢測結果顯示，重組載體轉染Vero細胞36h之前均檢測不到蛋白的表達，48h 后即為陽性，P/N值為2.25士0.38， 72 h達到峰值，P/N值為2.78士0.25，隨后又 有所下降；而pCI對照組和正常對照組的P/N值均在1.5以下，結果均為陰性。 本發明達到的技術指標為1. 根據GeneBank上提供的豬EST序列信息，設計合成引物，采用RT-PCR的 方法，以豬肝組織總RNA反轉錄所得的cDNA為模板，擴增pNAGS全長 編碼區；然后利用基因重組技術將該PCR擴增產物構建到原核表達載體 pLMl中，獲得原核表達質粒pLMl-NAGS (見圖1)，其大小為4764bp，該 質粒中啟動子元件、多克隆位點均來源于pLMl，在其&oi l和位點之 間插入了包括起始和終止密碼子的NAGS全長編碼區，并且His標簽的開放 閱讀框與NAGS的開放閱讀框完全一致，兩編碼區之間有的間隔為3bp (如 圖2所示)。2. 該原核表達質粒pLMl-NAGS在IPTG誘導下可在BL21(DE3)中表達。對該 蛋白在大腸桿菌中的分布定位分析表明，該蛋白主要以可溶形式存在于上清 中。親和層析后得到了純化的融合蛋白(如圖3所示)。3. 用該質粒表達并經親和層析純化后的產物免疫家兔制備的抗蛋白抗體具有 較高的滴度及特異性(圖3)。Untitledl. ST25. txt 序列表<110> 印遇龍<120>豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法及其應用 <160> 3<170〉 Patentln version 3.3<210> 1〈211〉 85〈212〉 PRT<213> 豬〈400> 1Cys Gly Cys Gly Cys Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ala Gly Gly Ala Gly 15 10 15Gly Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala Thr Gly Ala Gly Ala Gly 20 25 30Gly Ala Thr Cys Gly Cys Ala Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 35 40 45Cys Cys Ala Thr Cys Ala Cys Gly Ala Cys Ala Thr Gly Ala Ala Gly 50 55 60Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly 65 70 75 80Gly Gly Cys Thr Gly 85<210> 2<211> 39〈212> PRT〈213〉 豬〈400〉 2Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Thr Cys Gly Ala Cys Thr Cys Ala Thr 15 10 15Thr Cys Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Thr Cys Ala 20 25 30Untitledl. ST25. txtGly Ala Ala Gly Cys Cys Gly 35〈210〉 3 <211> 4764 <212> DNA 〈213〉 豬〈400〉 3cttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcg3tgta^ccc360ctcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtg3gC犯120gcaaaatgccgc犯aaaaggg組卿ggcgac3cggaaatgttg犯tac180tcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcg240gatacatatttg犯tgtattggttccgcgcacatttcccc300gaB犯gtgccacctgacgtct￡L￡lga^￡LCC￡Lttattatcatgacattaacct at aaaaat a360ggcgtatcacgaggccctttcgtctcgcgcgtttcggtgatgacggtg犯aacctctgac420ac3tgcagctcccggagacggtC￡LC￡LgCttgtctgtaagcgg3tgCCgggagcagacaag480cccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcat540cagagcagattgt￡LCtg￡LgagtgcaccatatgCggtgtg6Laataccgcacagatgcgtaa600ggagaa犯taccgcatcagga犯ttgt犯gcgttaatattttgtt犯肌ttcgcgttaaa660tttttgttaaatcagctceitttttt犯ccaataggccg肌atcggcaaaatcccttataa720tagaccgagatagggttg8gtgttgttccagtttggaeicaagagtccact780attaaag^cgtggactccaacgtcaaagggcg犯a^ccgtctatcagggcgatggccc840actacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaa900tcggaaccct犯鄉gagcccccgatttag￡lgCttg￡lCgggga犯gccggcg肌cgtggc960cga犯ggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggt1020cacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtccat1080tcgccattcaggctgcgc犯ctgttggg犯gggcgatcggtgcgggcctcttcgctatta1140cgccagctgcgaaattaatacgactcactataggg卿ccacaacggtttccctctagaa1200ataattttgttgaattcagggLggaatttaa犯tg卿ggatcgcatcaccatcaccatcei1260cgacatgaagcctctggtggttctggggctgccggctcccactgcgccctcaggctgtct1320Untitledl. ST25. txtttccttctgggaggcca鄉cacagcttgccca^gstgc犯ggcgctggtgaacacgct1380gcggcsc犯tgccgccaccgctgtgcctttttttggtggtgggtcggtactgggcgctgc1440tgagccagcccctcatgccagctacagcggcatcgtctcggtggaga^cggacctactaca1500gtggtgcctgg3gtXgggt3gcattcccatcctgtgcccc3"tCgggg卿cggctgcgcg1560ccgctccgtgctcctcgactcgctggaggcgaccgcggccctggccaaggcgctgcagcc1620caccaaaat tatcttcctcaatactacaggcggcatatacgacagcagtcacaaggtcct1680gagtaacgtgaacttgcccgccgacctggaCCtggtgELCC組gcgg叫tgggtga>gc￡LC1740caaagaacggC3gC3g3tgCggctcatcgtggeicgtgctcagtcgcctgccccaccactc1800ctcggcggtcatcaccgccgccagcacgctgCtC3Cgg6Lgctcttcagcaacaaggggtc1860cgggaccctgttcaaga^cgccgaacggatgctgcgagtgcgcagcctggacagcctgga1920ccaggaccgcttagcgaacctggtcaacgccagctttggc犯g犯gctgcgggacgacta1980tctggcctcgttacgcccgcgactgcactatgtctacgtctctgeLggggtac犯cgcggc2040cgccattctgaccaLcggagcccgtactggggggcaccccgt3tctag3caBgCttgtggt2100gagttccagccgccagggcc,gctccggccagatgctgtggg￡LgCgCCtgcggcggga2160cctgcagacgcttttctggcgctcccgggtcaxx肌ccccatcaacccctggtacttcaa22203ca^gtg3tggcagcttctgtggatcttcttctggtttggcctggccga2280catccgggactcttatgagctggtcaaccatgcc犯ggggctgccggactccttctgc犯2340gccggcttctgacccaggcagctg肌tgagtcgacctgcaggCgLtgC犯gcttggctgtt2400ttggcggatgagagaagattttcagcctgatac3gatt肌atcag犯cgc卿agcggtc2460tgataa^acagaatttgcctggcggcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccga2520actcagaagtgaaacgccgtagcgccgatggtagtgtggggtctccccatgcga^gtag2580ggaactgccaggcatcaaata^訊cgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgtttt2640atctgttgtttgtcggtg犯cgctctcctga/tccgccgggsgcggatttg2700aacgttgcgaagcaacggcccggeigggtggcgggcaggacgcccgccataaactgccagg2760catcaaattaa^gC3g卿gccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactctt2820ttgtttatttttcta^atacattcaaatatgtatccgctcatgagac犯taaccctgata2880aatgcttcaataatctgcatt肌tgaatcggcc犯cgcgcgggg，ggcggtttgcgta2940ttgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggc3000Untitledl.ST25. txtgagcggtatcagctcactcatacggttatcgggg3t犯Cg3060cagga犯gaacatgtgagcaeLa3ggcc3gc肌犯ggCC8ggaaccgtaaa肌ggccgcgt3120tgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaa犯tcgacgctcaa3180gtcagaggtggcgaaacccg3C3ggEictat肌EigatEicceLggcgtttccccctggaagct3240ccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcc3300cttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtagg3360tcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgcct3420tatccggt犯ctatcgtcttgagtcca^ccCggt犯g3C3cgacttatcgccactggcag3480cagccactggtaacaggattagc，gcgaggt3tgt叫gcggtgctetcagagttcttga3540agtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctga3600agccagttaccttcgg3犯a^gctcttgatccggca^c犯￡lCC￡LCCgCtg3660gtagcggtggtttttttgtttgcaa>gca>gcagattacgcgggatctcaag3720aagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtgg肌cg肌肌ctcacgttaag3780ggattttggtcatgagatteitcttcacctagatcctttta3840gaagttttaaa^c犯tct犯3gt3ta^tg3gta犯cttggtctgacagttaccaatgct3900taatcagtg已ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgac3960tccccgtcgtgtag3t犯ctacgatacgggagggcttaccatctggcccc3gtgCtgC肌4020tgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaa/taaaccagccagccg4080gaagggccg￡Lgcgc卿agtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaatt4140gttgccgggaagctagagtaagtagttcgcC3gtt犯ta^gtttgcgc肌cgttgttgcca4200ttgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggtt4260cccaacgatc犯ggcg叫ttacatgatxccccatgttgtgc犯犯犯gcggttagctcct4320tcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactc3tggtt3tgg4380cagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtg4440agtactcaaccaagtcattcgt"gcggcgaccgagttgctcttgcccgg4500cgtcaatacgggataataccgcgccac6itagcagaactttaaaagtgctc3tcattgga^4560aacgttcttcggggcg犯a^ctctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgt4620aacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggt4680Untitledl. ST25. txtgagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 4740 gaatactcat actcttcctt tttc 476權利要求
1. 一種豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法，其特征是包括如下步驟1)克隆豬的NAGS基因，根據該基因序列設計并合成引物NAGSF5′-CGCGCGAATTCAGGAGGAATTTAAAATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGACATGAAGCCTCTGGTGGTTCTGGGGCTG-3′；NAGSR5′-CTGCAGGTCGACTCATTCAGCTGCCTGGGTCAGAAGCCG-3′，其中Sal1酶切位點5’G’TCGAC 3’，EcoR1酶切位點5’G’AATTC 3’，CATCACCATCACCATCAC為六個組氨酸標簽，通過RT-PCR擴增豬NAGS基因的編碼區序列，其全長為1107bp；2)將步驟1)獲得的表達全長豬N-乙酰谷氨酸合成酶的重組原核表達質粒pLM1-NAGS轉化到大腸桿菌BL21中；3)培養轉化重組質粒的BL21到OD值為0.4；4)在培養的大腸桿菌BL21中加入IPTG 0.2mM，誘導；5)將誘導后的菌體離心收集，用PBS重懸，加入溶菌酶裂解，再超聲波破碎，把破碎后的菌液離心，收集上清；6)使用Hitrap chealting HP鎳親和層析柱純化蛋白；7)用純化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作為抗原免疫日本大耳白黑眼兔，得到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗體，用不完全福氏佐劑加強；8)測抗N-乙酰谷氨酸合成酶的血清效價，取血，得到相應的抗血清。
2、 根據權利要求1所述豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法，其特征在于步驟4)中，所述的誘導溫度為室溫，誘導時間為4-6hr。
3、 根據權利要求1所述豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法， 其特征在于步驟5)中，所述PBS的pH值為8.0，加溶菌酶裂解的時間為60min, 超聲破碎10次x3組，每次6s,每組間隔10s;破碎后的菌液在4"C， 8000rpm離 心15min，收集上清。
4、 根據權利要求1所述的豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法， 其特征在于步驟6)中用經過親合層析獲得的NAGS免疫日本大耳白黑眼兔 得到的NAGS多克隆抗體具有較高的抗體滴度及特異性。
5、 一種對應權利要求1所述的豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的應用 為檢測不同發育階段NAGS在哺乳仔豬體內的分布和表達活性的變化，以闡 明NAG缺乏的潛在分子機制，從而為尋找內源性精氨酸的營養調節提供了一個 新的有效途徑的應用。
全文摘要
本發明公開了一種豬N-乙酰谷氨酸合成酶多克隆抗體的制備方法及其應用，其步驟是克隆豬的NAGS基因，根據該基因序列設計并合成引物，將獲得的表達全長豬N-乙酰谷氨酸合成酶的重組原核表達質粒pLM1-NAGS轉化到大腸桿菌BL21中；培養轉化重組質粒的BL21到OD值為0.4；在培養的大腸桿菌BL21中加入IPTG 0.2mM，誘導；將誘導后的菌體離心收集，用PBS重懸，加入溶菌酶裂解，再超聲波破碎，把破碎后的菌液離心，收集上清；使用Hitrap chealtingHP鎳親和層析柱純化蛋白；用純化后的N-乙酰谷氨酸合成酶作為抗原免疫日本大耳白黑眼兔，得到N-乙酰谷氨酸合成酶的多克隆抗體，用不完全福氏佐劑加強；得到相應的抗血清。本發明能檢測不同發育階段NAGS在哺乳仔豬體內的分布和表達活性的變化。
文檔編號G01N33/573GK101265475SQ200810031259
公開日2008年9月17日 申請日期2008年5月9日 優先權日2008年5月9日
發明者儲武英, 印遇龍, 黃瑞林 申請人:印遇龍