專利名稱：：葡萄球菌蛋白a定量檢測試劑盒及定量檢測方法
技術領域：
：本發明屬于醫藥生物
技術領域：
，具體地說，涉及了一種葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒及其制備方法與應用。
背景技術：
：葡萄球菌蛋白A的發現從一開始就與IgG(免疫球蛋白G)相關聯，早在1940年，Vevwey發現在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種在雙向擴散試驗中能與正常人血清形成沉淀的物質。Jensen(1959)也發現類似現象，并將其命名為A抗原。直到1963年Lo&vist等分離了該抗原，并證明它是一種蛋白質。為與糖相區別，Grov(1960)將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡稱葡萄球菌蛋白A或SPA。1978年，有研究者將加熱滅活并經福爾馬林固定的金黃色葡萄球菌用于一種癌癥的治療，顯示出一定的療效，這是世界上第一次利用葡萄球菌蛋白A的抗體吸附性治療相關疾病的報道。UWen等在1984年闡明了葡萄球菌蛋白A的全基因序列和相應的氨基酸序列。2003年，L.Yang等應用表面張力探針證明每個葡萄球菌蛋白A分子可結合兩個IgG分子。葡萄球菌蛋白A的基因編碼序列由1464個堿基組成(若加上氨基端信號肽序列則為1572個堿基)，共編碼488個氨基酸，分子量約42KD。整個葡萄球菌蛋白A分子包含六個結構域E、D、A、B、C和X(從氨基端至羧基端)，其中，E、D、A、B、C這五個結構域均具備結合IgG的能力。X結構域的作用是將葡萄球菌蛋白A嵌合入金黃色葡萄球菌的細胞壁。葡萄球菌蛋白A可與人類和哺乳動物血清中的免疫球蛋白分子Fc段結合，特別是IgG和含IgG的免疫復合物，這是一種非免疫反應性結合，具有高度的親和力。葡萄球菌蛋白A的應用主要基于其抗體結合能力。將葡萄球菌蛋白A通過化學方法交聯至各種支架結構上，如與瓊脂糖凝膠共價耦合，能耐受溫度、pH變化和變性劑的作用而不脫失。這種由葡萄球菌蛋白A和瓊脂糖凝膠合成的填料可用于抗體的分離純化。隨著免疫吸附血液凈化治療技術的快速發展，這種合成填料逐漸被應用于自身免疫疾病、惡性腫瘤、移植排斥等疾病的治療，當患者血漿通過時，基質中葡萄球菌蛋白A可與血漿中致病性抗體，特別是IgG型抗體結合，這是一種可逆性、pH敏感的結合，將pH降至2.32.5時，葡萄球菌蛋白A與所結合抗體解離，抗體被洗脫清除，將pH恢復至7.0時，葡萄球菌蛋白A又恢復吸附能力，這樣可不斷重復循環吸附致病性抗體，從而達到治療疾病的目的，這種免疫吸附的方法稱為葡萄球菌蛋白A免疫吸附(ProteinAImmunoadsorption，PAIA)。在葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的使用過程中，吸附柱內結合不牢固的葡萄球菌蛋白A可能會隨著血槳的流動從吸附柱上脫落，如果這些脫落的葡萄球菌蛋白A通過血液進入人體并積累到一定量時很可能會對人體造成傷害并引發免疫系統的相關癥狀，因此對脫落葡萄球菌蛋白A含量的檢測是葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱產品的質量保證和在臨床上使用的安全保證。本發明利用ELISA技術建立了可定量檢測微量葡萄球菌蛋白A的試劑盒，該試劑盒適用于葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱脫落的微量葡萄球菌蛋白A的檢測，具有靈敏度高、準確性和穩定性好等優點。本發明的目的是提供一種葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒，該試劑盒通過使用人工重組的葡萄球菌蛋白A(SPA)作為標準品以及用人IgG作為包被ELISA板的抗體，使試劑盒的原料來源方便，制造成本和推廣成本更低。本發明所述的一種葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒，包括包被有人IgG的ELISA板；葡萄球菌蛋白A標準品，包含人工重組的葡萄球菌蛋白A即SPA，該重組蛋白具有如序列表中SEQIDNO.l所述的氨基酸序列，分子量約27kd，純度95%以上；生物素標記的抗SPA抗體；辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(Streptavidin/HRP);常規的樣品稀釋液，例如，稀釋液的組分為lxPBS，0.1%BSA，0.05%Tween-20，pH7.2土0.2;常規的洗滌液，例如，洗滌液的組分為lxPBS，0.05%Tween-20;常規的顯色液，例如TMB顯色液；常規的終止液，例如，終止液的組分為2mol/LH2S04。本發明的另一個目的是提供上述試劑盒的使用方法。本發明所述的一種定量檢測葡萄球菌蛋白A的方法，包括以下步驟1)將葡萄球菌蛋白A標準品及待測樣品用樣品稀釋液稀釋至適合濃度，加入包被有人IgG的ELISA板，IOOpL/孔，37°C60min;所述的葡萄球菌蛋白A標準品，包含人工重組的葡萄球菌蛋白A即SPA，該重組蛋白具有如序列表中SEQIDNO.l所述的氨基酸序列，分子量約27kd，純度95%以上；2)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入稀釋好的生物素標記抗SPA抗體，100iiL/孔，37。C60min;3)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入稀釋好的辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素，100nL/孔，37°C60min;4)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入顯色液，100ixL/孔，37°C孵育15-30min;5)加入終止液終止反應，在酶標儀上測定OD450值。本發明采用類似雙抗體夾心的方法建立了一種有效的定量檢測微量葡萄球菌蛋白A的ELISA試劑盒，具有以下有益效果1、采用人工重組的葡萄球菌蛋白A(SPA)作為標準品，使試劑盒的原料來源方便，制造成本和推廣成本更低。2、采用生物素-親和素系統，使所述試劑盒的靈敏度達到pg級，可檢測微量的葡萄球菌蛋白A。3、準確性高。檢測結果便于由酶標儀來進行定量分析，檢測結果誤差在5%以內。4、穩定性好。檢測結果的批內CV小于5，批間CV510。本發明所述的葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒，可適用于葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的葡萄球菌蛋白A脫落量的檢測，以及其他有關葡萄球菌蛋白A含量的定量檢測，具有靈敏度高、準確性和穩定性好等優點。圖1是本發明的原理示意圖。圖中1.酶聯反應板2.包被人IgG3.SPA4.生物素標記的抗SPA抗體5.辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素。圖2是利用葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒檢測葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的脫落葡萄球菌蛋白A含量的標準曲線圖。難雄弒以下通過實施例結合附圖對本發明作進一步的詳細說明，這并不限制本發明的保護范圍。實施例一葡萄球菌蛋白A標準品的制備1、重組葡萄球菌蛋白A基因單體的獲取設計三條單鏈DNA引物，其核苷酸序列分別為SEQIDN0.3、SEQIDN0.4禾口SEQIDN0.5(見序列表)，交由專業公司合成，通過PCR反應進行拼接獲得重組葡萄球菌蛋白A基因單體，在該單體5'端含有BamHI酶切位點，3'端含有HindIII酶切位點，再通過酶切連接將該基因單體連接入載體pQE一TriSystemHisStrepl中，獲得含重組葡萄球菌蛋白A基因單體的重組載體pQE-spa-b。這里所采用的表達載體是pQE_TriSystemHisStrepl，該載體是德國Qiagen公司的商品化的pQE系列載體的一種，pQE系列載體屬于pDS載體家族成員(Bujard，H.，Gentz，R.，Lanzer，M.，Stiiber,D.Miiller,M.,Ibrahimi，I.H鄉tle，M.T.，andDobberstein,B.(1987)AT5promotorbasedtranscription-translationsystemfortheanalysisofproteinsinvivoandinvitro.MethodsEnzymol.155,416~433.),在載體pDS56/RBSII和pDS781/RBSII-DHFRS的基礎上構建而成(Sttiber，D.,MatUe，H.,andGarotta,G(1990)Systemforhigh-levelproductioninEscherichiacoliandrapidpurificationofrecombinantproteins:applicationtoepitopemapping,preparationofantibodies,andstructure-functionanalysis.In:ImmunologicalMethods,Lefkovits,I.andPernis,B.,eds.,vol.IV,AcademicPress,NewYork,pp.121—152.)，其載體圖譜禾口序歹ll詳見http:〃wwwl.qiagen.com/literature/vectors_pqe.aspx。本發明也可采用其他表達載體，只需相應地調整與表達載體相連的酶切位點即可。2、重組葡萄球菌蛋白A基因的獲取及含重組葡萄球菌蛋白A基因的表達載體的構建設計第一對引物CL1:5，-gggCCATGGG7Ucggataacaaattcaacaaag-3'CL2:5'-cccGTCGACttttggtgcttgCgcatc-3'設計第二對引物CL3:5，-cccGTCGACaacaaattcaacaaagaac-3，CL4:5，-gggCTCGAGttttggtgcttgCgc-3，用這兩對引物分別擴增基因單體，擴增產物CL1-2的5'端和3'端分別具有Ncol和Sail的識別位點，CL3-4的5'端和3'端分別具有Sail和Xhol的識別位點。CL1-2和CL3-4經Sail酶切后進行連接，獲得2個基因單體串聯而成的重組葡萄球菌蛋白A基因，命名為spa-b2。spa-b2經Ncol禾口Xhol酶切并與載體pQE一TriSystemffisStr印l連接，獲得包含2個基因單體串聯而成的重組葡萄球菌蛋白A基因的重組載體pQE-spa-b2。經Sail和Xhol酶切的CL3-4和經Xhol酶切的載體pQE-spa-b2連接，獲得包含3個基因單體串聯而成的重組葡萄球菌蛋白A基因的重組載體pQE-spa-b3。以此類推，可獲得含4個基因單體串聯而成的重組葡萄球菌蛋白A基因的重組載體pQE-spa-b4。上述含spa-b4的大腸桿菌表達載體由本發明制備的重組葡萄球菌蛋白A基因(spa-b4)與大腸桿菌表達載體pQE—TriSystemHisStrepl構建而成，命名為pQE-spa-b4。3、能高效表達重組葡萄球菌蛋白A的大腸桿菌重組株pQE-spa-b4-BL21(DE3)的構建將重組載體pQE-spa-b4轉化大腸桿菌BL21(DE3)，按常規方法篩選具有氨芐青霉素抗性的重組菌株pQE-spa-b4-BL21(DE3)。4、利用大腸桿菌重組株pQE-spa-b4-BL21(DE3)生產重組葡萄球菌蛋白A1)將甘油保種的工程菌株pQE-spa-b4-BL21(DE3)按體積比1:100接入3mLLB培養基(Amp，100pg/mL)，37°C振搖12h。2)上述培養液按1:100接入100mLLB培養基(Amp，100ng/mL)，37°C振搖12h以進一步擴大培養。3)上述培養液按1:25接入2L加富培養基(Amp，100pg/mL)，37°C振搖3.5h至OD600=1.5。4)加入IPTG至終濃度為O.5mmol/L，37°C繼續振搖5h。5)lOOOOg、10min離心收集細菌沉淀，細菌沉淀可放置于-20。C一-80。C冰箱保存備用。6)將上述細菌沉淀的重新混勻于100mLPBS溶液中，超聲破碎細胞(相關參數為超聲時間4s，間隔時間4s，功率200W，總時間100min)。7)10000g，15min離心，收集上清。8)在緩慢攪拌的同時將硫酸銨固體粉末緩慢加入上清溶液至飽和度為70%，4。C放置lh，10000g，15min離心收集沉淀并重新溶于PBS溶液。9)取NiNTAAgarose(Qiagen公司生產)約7.5mL填裝柱子，先后用5~10個柱床體積的雙蒸水和PBS沖洗填料并平衡，將蛋白樣品流經填料以吸附目標蛋白。10)先以含20mmol/L咪唑的PBS沖洗填料至OD280不再下降，用含100mmol/L咪唑的PBS洗脫目標蛋白并收集，最后再用含200mmol/L咪唑的PBS洗脫一遍。11)含100mmol/L咪唑的PBS洗脫液經硫酸銨沉淀后可獲得純度在95%以上的SPA-B4蛋白。經測序，該基因由732個脫氧核苷酸組成，編碼244個氨基酸。該基因序列見序列表SEQIDNa2，其編碼的氨基酸序列為SEQIDNO.l。5、重組葡萄球菌蛋白A的活性測定1)分別將本發明的重組葡萄球菌蛋白A(SPA-B4)、本元正陽基因技術有限公司生產的重組葡萄球菌蛋白A(國產SPA)和美國Sigma公司生產的天然葡萄球菌蛋白A(進口SPA)用包被液(0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，pH9.6)配成濃度依次為100ng/mL，50ng/mL，25ng/mL，12.5ng/mL，6.25ng/mL，3.125ng/mL的溶液。2)各取上述溶液100pL加入96孔板，陰性對照以包被液代替樣品，空白對照除底物外，其余反應成分均不加入，每個濃度做2個重復。置于37^1h。3)甩掉板孔中溶液，每孔加入洗滌液(含0.02%Tween-20的PBS溶液)200nL，振蕩3min，甩干，重復洗滌4次，最后一次徹底甩干液體。4)每孔加入封閉液(含1%BSA和10%蔗糖的PBS溶液)100pL，置于370Clh。5)洗滌，步驟同3)。6)每孔加入人IgG溶液(20pg/mL)100pL，置于37GClh。7)洗滌，步驟同3)。8)每孔加入羊抗人IgG-HRP溶液(稀釋20000倍)100pL，置于37GClh。9)洗滌，步驟同3)。10)每孔加入TMB顯色液(武漢博士德公司生產)100pL，置于37QC15min。11)每孔加入終止液(2mol/LH2S04)lOOpL，終止反應。12)于酶標儀中測定A45d。檢測結果表明，本發明的重組葡萄球菌蛋白A對人IgG具有強吸附能力，其活性高于本元正陽基因技術有限公司生產的重組葡萄球菌蛋白A，略低于美國Sigma公司生產的天然葡萄球菌蛋白A。實施例二葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒的制備本發明所述的一種葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒，其原理見圖l，該試劑盒包括包被有人IgG的ELISA板；葡萄球菌蛋白A標準品，包含人工重組的葡萄球菌蛋白A即SPA，該重組蛋白的制備方法見實施例一；生物素標記的抗SPA抗體；辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素；常規的樣品稀釋液；常規的洗滌液；常規的顯色液；和常規的終止液。1)制備葡萄球菌蛋白A標準品葡萄球菌蛋白A標準品的分子量約27kd，純度在95%以上。經試驗證明，定量檢測葡萄球菌蛋白A時，葡萄球菌蛋白A標準品的濃度在01000pg/mL的范圍內，OD45。與相應的濃度成正比關系。所以，進行檢測時，用樣品稀釋液將葡萄球菌蛋白A標準品配成濃度依次為1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL和31.25pg/mL的溶液，使用量為100/iL/孔。2)制備包被有人IgG的ELISA板，其制作過程是用本發明單位制備的葡萄球菌蛋白A瓊脂糖凝膠吸附填料從人血漿中分離純化人IgG，純度在90%以上。用包被緩沖液(35mmol/LNaHC03，15mmmol/LNa2C03，PH9.6)將人IgG配成濃度為5g/mL溶液，在ELISA板中每孔加入100L，4口放置過；取出，置于37口30min;甩去液體，洗滌液洗滌4次，拍干；加入封閉液(lxPBS，1%BSA)，200L/孔，37口2hr;甩去液體，洗滌液洗滌4次；干，放于4口，備用o3)制備生物素標記的抗SPA抗體，制備方法是先制備抗SPA抗體，用本發明單位研發生產的重組葡萄球菌蛋白A免疫，分離細胞并制備交瘤細胞，篩選能產生高特性和強結合力的葡萄球菌蛋白A單抗體的交瘤細胞株，再通過體外培養篩選出的交瘤細胞株，產生并純化獲得高純度的單抗體，即抗SPA抗體。葡萄球菌蛋白A不能識別來源于的抗體的Fc段。將生物素與一基二在二的作用下進行禾n，生成生物素—基二(biotiny-N-hydroxy-succinimide，BNHS)。BNHS分子中的《=0基與抗SPA抗體分子中氨酸的氨基形成肽，從而制備生物素標記的抗SPA抗體。4)制備下述溶液樣品稀釋液lxPBS，0.1%BSA，0.05%Tween-20，PH7.2±0.2洗滌液lxPBS，0.05%Tween-20終止液2mol/LH2S045)辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素和TMB顯色液分別自博生物技術有限公司和武漢博士德生物工程有限公司。葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒由上述試劑組成。實施例三利用葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒檢測葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱的脫落葡萄球菌蛋白A的含量1)將重組葡萄球菌蛋白A與瓊脂糖凝膠交聯，制成葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱。用一定量的人血漿流經吸附柱，收集從柱子中流出的血漿，水10min(葡萄球菌蛋白A不會變性)，離心后取上清溶液作為待測樣品1。然后，用洗脫液(pHl-3的酸-化溶液)洗脫吸附在柱子上的抗體，收集洗脫下來的溶液，同樣經、離心后作為待測樣品2。另外，在人血漿中加入量的葡萄球菌蛋白A，經同樣理后制成葡萄球菌蛋白A濃度的待測樣品3(2ng/mL)和待測樣品4(10ng/mL)。2)用樣品稀釋液將SPA標準品配成濃度依次為1000pg/mL、500pg/mL、250pg/mL、125pg/mL、62.5pg/mL和31.25pg/mL的溶液，用樣品稀釋液將待測樣品分別稀釋10倍、20倍和100倍。各取上述溶液以100L/孔的體積加入包被有人IgG的ELISA板，陰性對照以包被液代替樣品，空白對照除底物外，其余反應成分均不加入，每個濃度做2個重復。置于37叱lh。3)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干。4)用樣品稀釋液將生物素標記的抗SPA抗體溶解至濃度為1~3g/mL，100L/孔，37°C60min。5)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干。6)加入稀釋好的辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素，100L/L，37'C60min;7)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干。8)加入TMB顯色液，100L/孔，37。C孵育15-30min;9)加入終止液中止反應，在酶標儀上測定OD450。通過不同濃度SPA標準品的OD值制的標準曲線見圖2。各待測樣品不同稀釋度的測定值及其平均值見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>經計得出，待測樣品3和待測樣品4的SPA濃度分別是2.051ng/mL和9.867ng/mL，誤差分別為2.55%和1.33%。待測樣品1的SPA濃度為4.353ng/mL，待測樣品2的SPA濃度為54.910ng/mL，結果與相。上述實驗作與結果表明，本發明的葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒的靈敏度達到pg級，準確度高(誤差在5%以內)，所需儀(主要是酶標儀等)簡單，于作和推廣。實施例葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒檢測葡萄球菌蛋白A濃度的結果穩定性測定1)制備低、中、高三個濃度的葡萄球菌蛋白A樣品，按照上述方法分別在同一次檢測中次(n=10)測定其濃度，其測定值及差系數(批內CV)如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2)制備低、中、高三個濃度的葡萄球菌蛋白A樣品，按照上述方法分別在次(n=5)檢測中測定其濃度，其測定值及差系數(批間CV)如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>上述結果表明，用本發明的葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒檢測葡萄球菌蛋白A濃度的結果的批內CV低于5，批間CV在510間，顯示出高的穩定性。SEQUENCELISTING(序列表)〈110〉廣州康盛生物科技有限公司<120>葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒及定量檢測方法〈130〉<160〉5<170>Patentlnversion3.5〈210〉1<211>244〈212〉PRT<213〉人:l:序列<400〉1MetGlyAlaAspAsnLysPheAsnLysGluGinGinAsnAlaPheTyr151015GlulieLeuHisLeuProAsnLeuAsnGluGluGinArgAsnGlyPhe202530lieGinSerLeuLysAspAspProSerGinSerAlaAsnLeuLeuAla354045GluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGinAlaProLysValAspAsnLys505560PheAsnLysGluGinGinAsnAlaPheTyrGlulieLeuHisLeuPro65707580AsnLeuAsnGluGluGinArgAsnGlyPhelieGinSerLeuLysAsp859095AspProSerGin100SerAlaAsnLeuLeu105AlaGluAlaLysLysLeuAsn110AspAlaGinAlaProLysLeuAspAsnLysPheAsnLysGluGinGin115120125AsnAlaPheTyr130GlulieLeuHisLeu135ProAsnLeuAsnGluGluGin140ArgAsnGlyPhelieGinSerLeuLysAspAspProSerGinSerAla145150155160AsnI>euLeuAlaGluAlaLysLysLeuAsnAspAlaGinAlaProLys165170175LeuAspAsnLysPheAsnLysGluGinGinAsnAlaPheTyrGlulie180185190LeuHisLeuPro195AsnLeuAsnGluGlu200GinArgAsnGlyPhelieGin205SerLeuLysAspAspProSerGinSerAlaAsnLeuLeuAlaGluAla210215220LysLysLeuAsnAspAlaGinAlaProLysLeuGluHisHisHisHis225230235240HisHisHisHis〈210〉2〈211〉732<212〉DNA<213〉人工序列〈400〉2atgggtgcggataacaaattcaacaaagaacaacaa犯tgctttctatgaaatcttacat60ttacctaacttaaacgaagaacaacgcaatggtttcatccaaagcctgaaagatgaccca120agccaaagcgctaaccttttagcagaagctaaaaagct肌atgatgcgcaagcacc肌aa180gtcgacaacaaattcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaatcttacatttacct240aactt肌acgaagaacaacgcaatggtttcaitccaaagcctg肌agatgaccc犯gcc犯300agcgctaaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgcgcaagcaccaaaactcgac360犯caaMtcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaeiatcttacatttacctaactta420aacgaagaacaacgcaatggtttcatccaaagcctgaaagatgacccaagccaaagcgct480aaccttttagcagaagctaaaaagctaaatgatgcgcaagcaccaaaactcgacaacaaa540ttcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaatcttacatttacctaacttaaacgaa600gaacaacgcaatggtttcertccaaagcctgaaagatgacccaagccaaagcgctaacctt660ttagcagaagctaaaaagctaaatgatgcgcaagcaccaaaactcgagcaccaccatcac720catcaccatcac732<210〉3<211〉70<212>DNA<213〉人工合成<400>3g'cggataacaaattcaacaaagaacaacaaaatgctttctatgaaatcttacatttacct60aacttaaacg70<210>4<211>70<212〉DNA<213>人工合成<400>4ctttggcttgggtcatctttcaggctttggatgaaaccattgcgttgttcttcgtttaag60tt8ggtaaal70<210〉5<211>70〈212〉DNA<213>人工合成〈400>5ttttggtgcttgcgcatcatttagctttttagcttctgctaaaaggttagcgctttggct60tgggtcatct70權利要求1.一種葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒，其特征在于，包括包被有人IgG的ELISA板；葡萄球菌蛋白A標準品，包含人工重組的葡萄球菌蛋白A即SPA，該重組蛋白具有如序列表中SEQIDNO.1所述的氨基酸序列，分子量約27kd，純度95％以上；生物素標記的抗SPA抗體；辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素；常規的樣品稀釋液；常規的洗滌液；常規的顯色液；和常規的終止液。2.—種定量檢測葡萄球菌蛋白A的方法，包括以下步驟1)將葡萄球菌蛋白A標準品及待測樣品用樣品稀釋液稀釋至適合濃度，加入包被有人IgG的ELISA板，100yL/孔，37°C60min;所述的葡萄球菌蛋白A標準品，包含人工重組的葡萄球菌蛋白A即SPA，該重組蛋白具有如序列表中SEQIDNO.l所述的氨基酸序列，分子量約27kd，純度95%以上；2)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入稀釋好的生物素標記抗SPA抗體，100uL/孔，37°C60min;3)甩去液體，用洗漆液洗滌4次，拍干，加入稀釋好的辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素，100yL/孔，37°C60min;4)甩去液體，用洗滌液洗滌4次，拍干，加入顯色液，100uL/L，37r孵育15-30min;5)加入終止液終止反應，在酶標儀上測定OD45Q值。全文摘要本發明公開了一種葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒。該試劑盒采用類似雙抗體夾心的ELISA方法定量檢測微量葡萄球菌蛋白A，并通過采用生物素-親和素系統，使其靈敏度達到pg級。該葡萄球菌蛋白A定量檢測試劑盒可適用于葡萄球菌蛋白A免疫吸附柱在使用過程中脫落的微量葡萄球菌蛋白A的定量檢測，以及其他有關葡萄球菌蛋白A含量的定量檢測，具有靈敏度高、準確性和穩定性好等優點。文檔編號G01N33/543GK101339197SQ20081002989公開日2009年1月7日申請日期2008年7月30日優先權日2008年7月30日發明者余波光,張旭鋒,楊東升,苗趙,陳校園申請人:廣州康盛生物科技有限公司