喹諾酮類抗生素多殘留酶聯免疫檢測方法

專利名稱：：喹諾酮類抗生素多殘留酶聯免疫檢測方法
技術領域：
：喹諾酮類抗生素多殘留酶聯免疫檢測方法，具體的說是用酶聯免疫吸附方法(ELISA)檢測動物性食品中喹諾酮類抗生素的殘留。屬于抗生素殘留檢測方法
技術領域：
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背景技術：
：喹諾酮是一類合成抗生素類藥物，在化學上與萘啶酮酸相關，其作用機理是直接作用于細菌的核、抑制細菌的DNA旋轉酶，使酶不能在DNA雙鏈上引入切口，破壞細菌的代謝和繁殖，迅速殺滅細菌。最初這類藥物用于治療尿道感染，現在已發展到治療系統感染疾病，并且在動物飼養中作為預防和治療藥物普遍使用。近年來，這些藥物在動物組織中的殘留己引起廣泛的注意。聯合國糧農組織、世界衛生組織食品添加劑專家聯席委員會、歐盟都已制定了多種喹諾酮類藥物在動物組織中的最高殘留限量。喹諾酮類藥物各種殘留分析方法，主要包括高效液相法(HPLC)以及與此相關的HPLC—UV、HPLC—FD、HPLC—DVD、LC—MS/MS，LC一ESI-MS/MS，另外還有熒光光譜法、毛細管電泳法等。LesleyJohnston等用HPLC-MS(Massspectrometer)法檢測魚類和海產品中的喹諾酮類和氟喹諾酮類藥物的殘留，所有被分析物均獲得很好的回收率，檢測極限達到l3mg/kg。GeryvanVyncht等用LC-ESI-MS-MS法檢測豬腎中的11種喹諾酮類藥物。盡管這些方法靈敏度較高，但樣品的前處理步驟較多，相對費時且檢測費用較高，特別是不適用于大量樣品的篩選。酶聯免疫吸附測定法(ELISA)提供了一種痕量氯菊酯的快速、靈敏、選擇性檢測方法。王戰輝選擇四種喹諾酮類藥物做為半抗原，采用混合酸酐法直接和BSA相偶聯合成免疫原，活化酯法合成包被原，通過篩選，以CIP為半抗原的單克隆抗體識別多種QNs，其中對DIF和SAR的交叉反應率低于3。/。，對其他12中藥物QNs均高于29y。。但是上述方法要求使用單克隆抗體，單克隆抗體制備過程復雜，價格昂貴，不宣普及。目前還缺少切實可行的動物性食品中喹諾酮類抗生素多殘留的檢測方法。
發明內容本發明的目的是建立了動物性食品中的喹諾酮類抗生素的多殘留ELISA檢測方法，為喹諾酮類抗生素在動物性食品中的殘留檢測提供了快速高效的檢測手段，由于采用的是多克隆抗體，費用較低并且穩定性和重復性較好。檢測限(IC9o)為0.0126ng/mL、半數抑制量(ICso)為0.54ng/mL和檢測范圍(;10:2()1(^8())為0.0446714ng/mL。此外，還從方法的特異性、準確性、靈敏度來評估了本ELISA方法。回收率分別是63%95%，變異系數小于20%。除與5種喹諾酮類藥物(QNs)的交叉反應低于5%外，其余13種QNs分別在16%和112%之間。符合多殘留ELISA方法檢測的要求。本發明的技術方案一種喹諾酮類抗生素多殘留酶聯免疫檢測方法，利用合成的喹諾酮類抗生素多簇抗原免疫得到多克隆抗體(李雅麗，胥傳來，王燦輝中國專利200710134500.4)，以喹諾酮類抗生素半抗原與卵清蛋白OVA的偶聯物作為包被抗原，以喹諾酮類抗生素為標準品，建立動物性食品中的喹諾酮類抗生素的間接競爭酶聯免疫檢測方法；步驟如下(1)以9%的生理鹽水稀釋包被抗原1:1001:200作為包被液，加入酶標板中，每孔加入100pL，4'C孵育過夜，按照常規ELISA方法洗滌封閉；(2)將多克隆抗體以抗體稀釋液按1:1001:200比例稀釋后，加入酶標板中，每孔加35pL;同時每孔分別加入用標準品稀釋液稀釋的0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL—系列濃度之一的喹諾酮類抗生素標準品或者添加待測樣品，每孔加65pL，37°C孵育lh后以PBST洗滌液洗滌3~5次；(3)加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP，以抗體稀釋液按1:廳01:3000比例稀釋，每孔加腳L，37。C孵育lh后以PBST洗滌液洗滌35次；(4)配制顯色液A液配方為每100mL水中加入0.933g檸檬酸，3.68gNa2HP04'12H20，18|iL30%H2O2;B液配方為60mg四甲基聯苯胺溶于100mL乙二醇；使用前將A液與B液以4:1體積混合；(5)每孔加入顯色液lOO(iL，37。C顯色15min;每孔加入終止液2M硫酸溶液100(iL，酶標儀450nm測吸光值0D。待測樣品為動物性食品的提取方法為(1)以1ng/g樣品和5ng/g樣品的水平的喹諾酮類抗生素加入陰性樣品，在室溫下至少靜置15min;(2)取2g已經攪碎的樣品，加于2550mL離心管中，再加入10mL乙酸乙酯-PBS體積比1:1的混合液，然后用勻漿器勻漿，渦旋混合后超聲提取30min，3500rpm/min離心10mm;(3)移取上層有機層到另一新的帶帽試管中，在6070。C的熱水浴中，一邊用氮氣吹干(注意在下層呈堿性的水相中含有高濃度的鹽將會對檢測反應造成嚴重污染。故而在移取上層有機層時，不要吸取到下層水相)。(4)加入lmLPBS溶液溶解后待用(注意對有些樣品來說，也許會出現沉淀或混濁液體。在加樣前，可將其離心35分鐘。或加熱)。更詳細的步驟為1)配制磷酸鹽(PBS)緩沖液Na2HP04.12H203.12g，NaH2P04.2H201.76g，加水100mL。2)配置PBST溶液含0.05%Tween-20的PBS溶液。3)配制OVA/生理鹽水封閉液稱取O.lgOVA溶解于lOOmL生理鹽水配制成0.1%的OVA/生理鹽水封閉液。4)配置抗體稀釋液含0.iy。OVA的PBST溶液。5)合成包被抗原(諾氟沙星半抗原與卵清蛋白OVA偶聯物)。6)以9°/。生理鹽水稀釋包被抗原l:100l:200，加入酶標板中，每孔100&。4°C孵育過夜。7)甩去包被抗原液后，以PBST、洗滌2遍，加入OVA/生理鹽水封閉液，每孔腳L，37。C溫育2h。8)甩去酶標板中的封閉液，用PBST洗滌兩遍，每次23分鐘。9)將抗血清用抗體稀釋液稀釋1:1001:200后，每孔35pL加入酶標板中，同時加入一系列濃度的喹諾酮類抗生素標準品，每孔65pL。37t:孵育lh后以PBST洗滌35次。10)加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(GAR—HRP)，以抗體稀釋液稀釋為1:10001:3000。每孔100|aL。37。C作用lh后以PBST洗滌35次。11)配置顯色液A液配方為每100mL水中加入0.933g檸檬酸，3.68gNa2HP04'12H20，18|aL30%H2O2;B液配方為60mg四甲基聯苯胺溶于100mL乙二醇；使用前將A與B以4:1體積混合。12)加入顯色液每孔1C%iL，37'C顯色15min。13)加入終止液2MH2SO;，酶標儀450nm測吸光值(OD)。本發明的有益效果以諾氟沙星半抗原與OVA的偶聯物作為包被抗原，建立了動物性食品中喹諾酮類抗生素的間接ELISA方法，為喹諾酮類抗生素在動物性食品中的殘留檢測提供了快速高效的檢測手段，由于采用的是多克隆抗體，費用較低并且穩定性和重復性較好。檢測限(IC9。)為0.0126ng/mL、半數抑制量(IC5。)為0.54ng/mL和檢測范圍(IC2oIC8o)為0.0446714ng/mL。此外，還從方法的特異性、準確性、靈敏度來評估了本ELISA方法。回收率分別是63%95%，變異系數小于20%。除與5種QNs的交叉反應低于5%外，其余13種QNs分別在16%和112%之間。符合多殘留ELISA方法檢測的要求。圖l諾氟沙星的標準抑制曲線。具體實施方案以下通過實施例進一步說明本發明。一、儀器TGL—40B臺式低速離心機上海安亭科學儀器廠；KFLO純水機凱佛隆公司；ZD-9556水平搖床太倉科教器材廠；Costar96孔8x12可拆酶標板上海吉泰生物科技有限公司；MuLtiskaMks酶標儀ThermoLabsystems公司；可調試移液器ThermoLabsystems公司，勻質器Fluka公司；渦旋混合器上海滬西儀器分析。二、試劑辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(HRP-IgG)康成生物工程公司；四甲基聯苯胺(TMB)華美生物工程公司；其他試劑均為分析純試劑。三、步驟1.免疫原和包被原的合成合成免疫原(諾氟沙星半抗原與牛血清白蛋白BSA偶聯物)和包被原(諾氟沙星半抗原與卵清蛋白OVA偶聯物)，用戊二醛法偶聯，具體步驟如下1)取0.1mmol的諾氟沙星半抗原溶于2mL的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌下緩慢滴加戊二醛溶液(終濃度為1.25。/。)成A液。2)取0.002mmol的牛血清蛋白或卵清蛋白(BSA或者OVA)溶于10mL的pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中成B液。3)攪拌條件下將A液緩慢滴加到B液中。攪拌過夜，純水透析5天。分裝凍干保存于一2(TC冰箱中。2.免疫制備多克隆抗體3.ELISA反應過程1)將包被原用包被緩沖液作系列稀釋包被96孔酶標板，100pL/孔，于4'C冰箱過夜。次日取出酶標板回至室溫，每孔注入200pLPBST溶液，搖床上振蕩3min，用力甩掉洗滌液，在吸水紙上拍千，繼續洗滌2次。以下洗滌方法相同。2)充分洗滌后，用封閉緩沖液封閉酶標板，200pL/孔，于37'C溫育箱內溫育2h后取出烘干待用。3)將陽性血清系列稀釋對應加入到酶標板的前7行列，第8行加入陰性血清，100(iL/孔，37'C孵育lh后洗滌、拍干。4)每孔加入100(iL，l:3000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，37r孵育lh后洗滌、拍干。5)每孔加入IOOiiL顯色液，暗處37。C反應15min，取出后每孔加入100終止液(2mol/L的硫酸)，用酶標儀測定吸光值A450。4、回收率及樣品提取方法的確定1)以1ng/g和5ng/g的水平加入QNs樣品，在室溫下至少靜置15min。2)取2g已經攪碎的樣品，于50mL離心管中。再加入10mL乙酸乙酯-PBS(1:1)，然后用勻漿器勻漿。渦旋混合后超聲提取30分鐘，3500卬m/min的轉速，離心IO分鐘。3)移取上層有機層到另一新的帶帽試管中，在6070'C的熱水浴中，一邊用氮氣吹干(注意在下層呈堿性的水相中含有高濃度的鹽將會對檢測反應造成嚴重污染。故而在移取上層有機層時，不要吸取到下層水相)。4)加入1mLPBS溶液溶解(注意對有些樣品來說，也許會出現沉淀或混濁液體。在加樣前，可將其離心35分鐘；或加熱)。5)移取50pL樣品溶液，直接加樣于微孔中，進行ELISA測定。6)回收率的計算根據不同添加濃度的樣品OD值計算相應的抑制率，再根據相應的抑制率從標準曲線上查到各自的濃度。檢測濃度與真實濃度之比為對應濃度的回收率。試驗結果如下1、標準曲線:本發明所獲得的抗原檢測的線性范圍是為0.0446714ng/mL，具體請見說明書附圖。2、靈敏度靈敏度是所得卯％最大吸光值所對應的標準品的濃度，即ICw為0.0126ng/mL。3、交叉反應率(CR。/。)利用喹諾酮類抗生素進行交叉反應研究。cr=(半抗原)xl。Q%。由下表可知，除與5種QNs的交叉反應低于5%外，IC50(喹諾酮類抗生素)其余13種QNs分別在16%和112%之間。符合多殘留ELISA方法檢測的要求。表1交叉反應率的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>回收率測定加標樣品回收后進行ELISA檢測表2加5，回收率分別是63%95%，變異系數小于20°/^際回收率的測定(n=5)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求1、一種喹諾酮類抗生素多殘留酶聯免疫檢測方法，其特征在于利用合成的喹諾酮類抗生素多簇抗原免疫得到多克隆抗體，以喹諾酮類抗生素半抗原與卵清蛋白OVA的偶聯物作為包被抗原，以喹諾酮類抗生素為標準品，建立動物性食品中的喹諾酮類抗生素的間接競爭酶聯免疫檢測方法；步驟如下(1)以9％的生理鹽水稀釋包被抗原1∶100～1∶200作為包被液，加入酶標板中，每孔加入100μL，4℃孵育過夜，按照常規ELISA方法洗滌封閉；(2)將多克隆抗體以抗體稀釋液按1∶100～1∶200比例稀釋后，加入酶標板中，每孔加35μL；同時每孔分別加入用標準品稀釋液稀釋的0.001ng/mL、0.01ng/mL、0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL一系列濃度之一的喹諾酮類抗生素標準品或者添加待測樣品，每孔加65μL，37℃孵育1h后以PBST洗滌液洗滌3～5次；(3)加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔GAR-HRP，以抗體稀釋液按1∶1000～1∶3000比例稀釋，每孔加100μL，37℃孵育1h后以PBST洗滌液洗滌3～5次；(4)配制顯色液A液配方為每100mL水中加入0.933g檸檬酸，3.68gNa2HPO4·12H2O，18μL30％H2O2；B液配方為60mg四甲基聯苯胺溶于100mL乙二醇；使用前將A液與B液以4∶1體積混合；(5)每孔加入顯色液100μL，37℃顯色15min；每孔加入終止液2M硫酸溶液100μL，酶標儀450nm測吸光值OD。2、根據權利要求1所述的喹諾酮類抗生素多殘留酶聯免疫檢測方法，其特征在于待測樣品為動物性食品的提取方法為(1)以lng/g樣品和5ng/g樣品的水平的喹諾酮類抗生素加入陰性樣品，在室溫下至少靜置15min;(2)取2g已經攪碎的樣品，加于2550mL離心管中，再加入10mL乙酸乙酯-PBS體積比1:1的混合液，然后用勻漿器勻漿，渦旋混合后超聲提取30min，3500rpm/min離心10min;(3)移取上層有機層到另一新的帶帽試管中，在6070'C的熱水浴中，一邊用氮氣吹干(注意在下層呈堿性的水相中含有高濃度的鹽將會對檢測反應造成嚴重污染。故而在移取上層有機層時，不要吸取到下層水相:)。(4)加入lmLPBS溶液溶解后待用。全文摘要喹諾酮類抗生素多殘留酶聯免疫檢測方法，屬于抗生素殘留檢測方法
技術領域：
。本發明利用合成的喹諾酮類抗生素多簇抗原免疫得到多克隆抗體，以喹諾酮類抗生素半抗原與卵清蛋白OVA的偶聯物作為包被抗原，以喹諾酮類抗生素為標準品，建立動物性食品中的喹諾酮類抗生素的間接競爭酶聯免疫檢測方法；為喹諾酮類抗生素在動物性食品中的殘留檢測提供了快速高效的檢測手段，由于采用的是多克隆抗體，費用較低并且穩定性和重復性較好，檢測限(IC₉₀)為0.0126ng/ml、半數抑制量(IC₅₀)為0.54ng/ml和檢測范圍(IC₂₀～IC₈₀)為0.04467～14ng/ml。此外，還從方法的特異性、準確性、靈敏度來評估了本ELISA方法，符合多殘留ELISA方法檢測的要求。文檔編號G01N21/25GK101315376SQ200810022358公開日2008年12月3日申請日期2008年6月26日優先權日2008年6月26日發明者李雅麗,胥傳來申請人:江南大學