專利名稱：：一種適用于硝西泮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種適用于硝西泮(NZP)殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，屬于酶聯免疫吸附分析(ELISA)試劑盒
技術領域：
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背景技術：
：硝西泮(Clonazepam)為苯二氮卓類鎮靜安眠藥，化學名稱為1，3-二氫-7-硝基-5-苯基-2H-l，4-苯并二氮卓-2-酮。曾用作動物飼料添加劑，作為生長促進劑,具有使動物嗜睡少動，生長快且有改變肉質的作用。也用在屠宰和動物檢疫之前,或將動物轉移屠宰之前，起鎮靜作用，以減輕動物緊張狀態，降低動物傷害和死亡率。此類藥物常見嗜睡，可見無力、頭痛、暈眩、惡心、便秘，偶見皮疹、肝損害、骨髓抑制等不良反應。若隨意在飼料中添加此類藥物，蓄積的藥物通過食物鏈進入人體，將造成巨大的危害。為此許多國家將此類藥物列入禁用藥物名單。目前，國內外有關硝西泮的檢測主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、薄層色譜法(TLC)、氣-質聯用法(GC-MS)、液-質聯用法(LC-MS)等，但這些方法不僅需要昂貴的儀器設備，對檢材的要求也比較高，需要進一步的提純處理才能進行，這已經不能達到現代檢測對快速、方便、準確的要求。近年來，國外已經開展了對苯二氮卓類免疫分析方法的研究，但國內在這方面的研究起步較晚，大部分的檢測產品還需要依賴國外進口。為了加強對國內肉制品的監督力度和保障人民的身體健康，有必要展開對苯二氮卓類免疫分析方法的研究，有必要建立一種快速有效的硝西泮的酶聯免疫吸附檢測方法。
發明內容(一)要解決的技術問題本發明的目的在于提供一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、高精確度、操作方法簡單的酶聯免疫吸附檢測試劑盒，用于硝西泮殘留的批量、快速(二)技術方案為實現上述目的，本發明提供了一種硝西泮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，該試劑盒包括包被了硝西泮包被抗原的酶標板、海綿支架、硝西泮標準品、硝西泮多克隆抗體、濃縮洗滌液、酶標二抗、顯色液、反應終止液。其中，包被了硝西泮包被抗原的酶標板的制備過程中，所用的包被原是硝西泮的半抗原7-氨基硝西泮與卵清蛋白(OVA)的偶聯復合物，所用包被液是0.05MpH9.6碳酸鈉緩沖液，所用封閉液是含2XOVA的上述包被液。其中，硝西泮多克隆抗體是用7-氨基硝西泮與牛血清白蛋白(BSA)的偶聯復合物常規方法免疫制備。其中，酶標二抗是辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體。其中，濃縮洗滌液(PBST)的配方為20mL蒸餾水中加入8g氯化鈉，0.2g磷酸二氫鉀，3g磷酸氫二鈉，0.4g氯化鉀，0.5mL吐溫-20，濃縮洗滌液的濃度是正常使用時的50倍。其中，顯色液包括A液和B液，A液配方為每100mL水中加入0.933g檸檬酸，3.68gNa2HP04.12H20和18pL30%H2O2;B液配方為60mg四甲基聯苯胺溶于lOOmL乙二醇，使用時按A:B=5:1的比例使用。本發明試劑盒的檢測分析原理是酶標板上的每個孔均包被有相同量的硝西泮抗原，加入待測硝西泮樣品和硝西泮多克隆抗體后，固相包被抗原和待測硝西泮相互競爭與多克隆抗體反應，由于每個孔中的固相抗原和加入的多克隆抗體含量均一致，所以當待測樣品的硝西泮濃度高時，則被結合在固相抗原上的多克隆抗體少，加入的酶標二抗與被固定抗體結合量少，用洗滌液洗滌后加入底物液(即顯色液A液)和顯色液(即B液)，顯色反應淺，用酶標儀檢測的吸光值低，表明抑制率高；反之，當待測樣品的硝西泮濃度低時，則所測的吸光值高，抑制率低。根據用已知的硝西泮濃度檢測所作的標準曲線，可以推算出待測樣品的硝西泮的濃度。(三)有益效果本發明提供的硝西泮殘留檢測試劑盒采用了硝西泮多克隆抗體，能準確靈敏地檢測尿液或組織中硝西泮及其他結構相似的苯二氮卓類殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠低于傳統的儀器檢測方法，而且本發明試劑保存時間長，無放射性污染。本發明對解決大批量樣品的硝西泮殘留現場監控技術具有重要的現實意義。圖l為硝西泮的標準抑制曲線。具體實施例方式以下是實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明所要保護的范圍。實施例1試劑盒操作及結果計算待測樣品經前處理后，用PBST定容備用。拆開真空包裝袋并取出酶標板，在室溫下平衡5分鐘備用。配制Ong/mL，0.15ng/mL,0.5ng/mL，1.5ng/mL，5ng/mL，15ng/mL，50ng/mL，100ng/mL的硝西泮標準液，加入50(iL標樣或處理好的待測樣品到各孔中，標樣和樣品做4個重復，加入50pL稀釋的抗體，37"C孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗5次，將酶標板倒置4:1000稀釋好的酶標羊抗兔二抗100pL，37。C孵育30分鐘；倒出孔中的液體，用稀釋好的PBST洗板5次，拍干；取A液和B液按5:1混勻，每孔加100piL，在暗處顯色10~15分鐘，每孔加入50pL的終止液終止反應，酶標儀上測定各孔在波長為450nm處的吸光值。將含Ong/mL標準品孔的吸光值定為B。，其余孔的吸光值定為B;以B/B0值為縱坐標，相應標準品濃度的LOG值為橫坐標，繪制硝西泮標準抑制曲線。根據曲線的回歸方程可以求出對應待測樣品中硝西泮的濃度，也可以求出硝西泮IC5o(B/B(^50X)及最小檢測限LOD(90%抑制率對應的濃度)。IC5Q為2.547ng/mL，LOD為0.118ng/mL，線性范圍為0.15-15ng/mL，線性方程y=-29.936x+62.164，R2=0.9928。實施例2硝西泮殘留分析酶聯免疫吸附檢測試劑盒的組建本例中，試劑盒包含如下部分(1)包被了硝西泮抗原的酶標；(2)海綿支架；(3)1mg/mL硝西泮標準品(Sigma公司)；(4)硝西泮多克隆抗體；(5)辣根過氧化酶標記羊抗兔抗體(康成生物工程公司)；(6)濃縮洗滌液配方為8g氯化鈉，0.2g磷酸二氫鉀，3g磷酸氫二鈉，0.4g氯化鉀，0.5mL吐溫-20和20mL蒸餾水；(7)顯色液A液配方0.933g擰檬酸，3,68gNa2HP04'12H20，18^30%11202和100mL超純水(8)顯色液B液配方60mg四甲基聯苯胺溶于100mL乙二醇實施例3保存期實驗將試劑盒放置于4。C保存，分別取0、10、20、30、60、90、120、150和180d的試劑盒，以2.05pg/mL抗原工作濃度和0.3pg/mL抗體工作濃度為工作濃度，進行標準樣品檢測以測定其檢測效果。保存期測定結果見表l，表明IQo變化不大，試劑盒在4'C下可保存6個月以上。表1試劑盒保存實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>實施例4試劑盒特異性實驗:選擇硝西泮的結構類似物作為待測物，測得各種物質的抑制中濃度(IC^，再用下式計算抗體對這些物質的交叉反應性；交叉反應率愈小，則抗體對硝西泮的特異性愈強，反之則抗體的特異性差。交叉反應(CR^)=1<:5。(硝西泮yiC5o(供試物)xioo%。實驗測定結果見表2，采用間接ELISA法，硝西泮多克隆抗體對分子結構相似的硝西泮，地西泮和2種代謝物7-氨基硝西泮、7-氨基硝西泮都具有交叉反應。但對其他類鎮靜劑如鹽酸異丙嗪則具有較好的特異性，交叉反應率均在0.1%以下。總的來說，對苯二氮卓類藥物具有一定的群選性。表2交叉反應<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實施例5添加回收實驗:(1)樣品的提取凈化取lmL尿樣于離心管中，加入4mL、0.1MNaOH溶液振蕩2-5min，加入5mL的正己烷，漩渦5min后，15°C3000rpm離心5min，取上層有機相，氮氣吹干，加入1mL的標準品稀釋液，作為試樣供分析。(2)在空白的人尿中添加標準品儲液，使其濃度為1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL。各濃度分別制備樣品五份，測定其含量，將實測濃度與添加濃度進行比較。在空白尿樣中添加不同濃度的硝西泮，按上述的前處理方法進行提取，濃縮后分析。結果見表3。可以看出，尿樣中的回收率在65.8%~84.7%之間。該分析方法重復性良好，相對標準偏差低于4.78%。表3添加回收率的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>權利要求1.一種適用于硝西泮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于包含包被了硝西泮包被抗原的酶標板、海綿支架、硝西泮標準品、硝西泮多克隆抗體、酶標二抗、濃縮洗滌液、顯色液和反應終止液；所述硝西泮包被抗原為7-氨基硝西泮與卵清蛋白的偶聯復合物；所述酶標二抗是辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體。2.根據權利要求1所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于濃縮洗滌液的配方為20mL蒸餾水中加入8g氯化鈉，0.2g磷酸二氫鉀，3g磷酸氫二鈉，0.4g氯化鉀和0.5mL吐溫-20。3.根據權利要求1所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于顯色液包括A液和B液，A液配方為每100mL水中加入0.933g檸檬酸，3.68gNa2HPCV12H20和18pL30%H202;B液配方為60mg四甲基聯苯胺溶于100mL乙二醇。4.根據權利要求1所述的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于反應終止液為2mol/L的硫酸液。全文摘要一種適用于硝西泮殘留分析的酶聯免疫檢測試劑盒，屬于酶聯免疫吸附分析試劑盒
技術領域：
。本發明試劑盒，包含包被了硝西泮包被抗原的酶標板、海綿支架、硝西泮標準品、硝西泮多克隆抗體、酶標二抗、濃縮洗滌液、顯色液和反應終止液；硝西泮包被抗原為7-氨基硝西泮與卵清蛋白的偶聯復合物；酶標二抗是辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體。本發明試劑盒采用了硝西泮多克隆抗體，能準確靈敏地檢測尿液或組織中硝西泮及其他結構相似的苯二氮類殘留，樣品的前處理過程簡單，耗時少，能同時檢測大量的樣品，樣品檢測成本遠低于傳統的儀器檢測方法，而且本發明試劑盒保存時間長，無放射性污染，對解決大批量樣品的硝西泮殘留現場監控具有重要的現實意義。文檔編號G01N33/543GK101315375SQ200810022160公開日2008年12月3日申請日期2008年6月30日優先權日2008年6月30日發明者劉麗強,彭池方,李秋生,胡擁明,胥傳來,緩袁申請人:江南大學