專利名稱：快速檢測呋喃西林代謝物的膠體金層析試紙條的制備方法
快速檢測呋喃西林代謝物的膠體金層析試紙條的制備方法技術領域快速檢測呋喃西林代謝物的膠體金層析試紙條的制備方法，屬于檢測技術 領域。
技術背景硝基呋喃類抗生素(Nitrofiiran antibiotics)主要是指呋喃唑酮(Furazolidone)， 呋喃西林(Nitrofiirazone)，呋喃妥因(Furantoin)和呋喃它酮(Furaltadone)，為一類 廣譜抗生素，對革蘭陽性及陰性菌均有一定抗菌作用。呋喃西林(Furantoin)，是 一種人工合成的硝基呋喃類廣譜抗菌藥物，對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性 菌及某些原蟲和真菌具有抑制或殺滅效果，而且藥效穩定，在畜禽和水產養殖 中得到了廣泛的應用。硝基呋喃類藥物及其對應的代謝產物有呋喃唑酮(AOZ)、 呋喃它酮(AMOZ)、呋喃西林(SEM)和呋喃妥因(AHD)。硝基呋喃類藥物在動物 體內代謝很快，在組織中結合的代謝產物滯留時間長。動物服用呋喃類藥物后， 原藥分子在動物體內迅速代謝，其在體內的穩定性不超過幾小時；代謝的部分 化合物分子與細胞膜蛋白結合成為結合態，結合態可長期保持穩定，從而延緩 原藥在體內的清除速度。而普通的食品加工方法(如燒烤、微波加工、烹調等) 難以使蛋白結合態呋喃唑酮殘留物大量降解，食用含有該殘留物的肉制品會對 人體產生一定的毒副作用。硝基呋喃類藥物對畜禽有一定毒性，同時硝基呋喃類藥物也是一類具有潛 在致癌和誘導有機體產生突變的物質。由于硝基呋喃類抗生素在體內代謝迅速， 而代謝產物與蛋白結合形成穩定化合物，但這些代謝物可以在弱酸性條件下(如 人類胃液的酸性條件)從蛋白質中釋放出來，因此當人類吃了含有硝基呋喃類 抗生素殘留的食品，這些代謝物就可以在人類的胃液的酸性條件下從蛋白質中 釋放出來而被人體吸收，從而對人類健康造成嚴重的危害。1990年7月歐盟頒布2377/90/EEC條例，將硝基呋喃類藥物及其代謝產物 列為A類禁用藥物。自1995年起歐盟全面規定禁止使用呋喃類抗菌物質，在動 物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。歐盟(EU)從1997年開始將 所有的硝基呋喃類抗生素全部列為違禁藥物。2004年美國FDA公布了禁止在進 口動物源性食品中使用的ll種藥物名單，其中包括呋喃西林和呋喃唑酮。我國 農業部文件農牧發[2002] 1號也規定動物源性食品中呋喃唑酮的檢出限為不得 檢出。目前國內外都對呋喃類物質的控制相當嚴格，各國對于測定的標準都有 明確的規定。盡管如此，但是由于其藥效確切，價格低廉，目前在畜牧和水產3養殖中違禁使用現象仍較嚴重。由于呋喃類藥物在動物體內快速代謝，代謝物與組織蛋白結合物在體內滯 留時間長，因此檢測呋喃類藥物殘留的最佳方法是檢測其代謝物而非檢測原藥。目前，檢測呋喃西林代謝物(SEM)的方法主要有儀器分析法和酶聯免疫分 析法(ELISA)。儀器分析法主要是有高效液相色譜(HPLC)、液相色譜一質譜法 (LC-MS)、液相色譜一串聯質譜法(LC-MS/MS)。儀器分析法靈敏度高，結果準 確，但是樣品需經一系列復雜的處理凈化，繁瑣費時，所需儀器設備價格昂貴， 而且只有特定的專業技術人員才能操作，不能進行現場檢測，時效性差，難以 推廣。ELISA法以競爭性酶聯免疫反應為檢測原理，縮短了檢測時間，可以定 性定量檢測。但ELISA方法需要配套的酶標儀和配套試劑，操作過程仍較復雜， 而且國內現處在研發階段，進口國外產品價格昂貴，因而ELISA方法的應用受 到了較大限制。 發明內容本發明的目的針對現有檢測呋喃西林代謝物SEM的技術的不足和缺限，提供一種快速檢測呋喃西林代謝物的金標層析試紙條的制備方法，使其能更加 快速、靈敏、簡便地檢測呋喃西林代謝物殘留。本發明的技術方案 一種呋喃西林代謝物膠體金層析檢測試紙條的制備方 法，含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊，金標結合墊為吸附呋喃西林代謝物SEM衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被 膜上有用SEM衍生物偶聯載體蛋白的溶液印制的直線式隱形檢測線T線，用羊 抗兔IgG溶液印制的直線式隱形控制線C線，兩條線平行排列。所述的襯板為不吸水的韌性材料，選用硬質塑膠條，或不吸水硬紙條；所 述的樣品墊選用玻璃纖維棉，或尼龍膜，或聚偏二氟乙烯膜，或聚酯膜；所述 的吸水墊選用吸水能力較強的吸水濾紙或濾油紙；所述的包被膜選用硝酸纖維 素膜或醋酸纖維素膜。所述的SEM衍生物金標抗體為膠體金標記的SEM衍生物多克隆抗體；所 述的偶聯SEM衍生物的載體蛋白選用牛血清白蛋白BSA，或卵清蛋白OVA。本發明的有益效果本檢測試紙條具有下列優點① 特異性強，敏感性高。該膠體金層析檢測試紙條以膠體金標記高親和力 的多克隆抗體為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形 成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金標記對抗體的特異性和親 和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，試紙條具有較強的特異性和較高的敏感性，檢出最低限量可達到5ppb。② 簡便、快速、時效性強。使用膠體金層析檢測試紙條和試紙卡，無需任何其它試劑和儀器，可現場操作，試紙條加入被檢樣品液后，在15分鐘內即可判定檢測結果。
③ 結果顯示形象、直觀、準確。檢測試紙條均以顯示紅色線T線和C線作
為檢測結果陽性和陰性標記，即在包被膜上顯示一條紅色線c線時，表示在被
檢樣品中含有被檢物，顯示兩條紅色線T線和C線時，表示在被檢樣品中不含 被檢物。結果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陽性和假陰性等 人為誤判。
④ 節省費用，適用范圍廣，便于推廣。使用檢測試紙條，比用儀器分析和 ELISA試劑盒的費用大幅下降。另外，試紙條的適用范圍廣，可滿足不同層次 人員需要，包括專業檢驗，海關檢疫，衛生檢疫，質量監測，加工企業和養殖 場戶等，便于推廣應用，具有廣闊的市場前景和明顯的經濟、社會效益。
圖1、呋喃西林代謝物膠體金層析檢測試紙條剖面結構示意圖。 圖2、呋喃西林代謝物膠體金層析檢測試紙條俯視結構示意圖。
具體實施例方式
實施例l:制備呋喃西林代謝物檢測試紙條。
首先需要制備偶聯呋喃西林代謝物衍生物載體蛋白，用于制備相應的檢測 線(T線)和抗體；而且需要制備呋喃西林代謝物衍生物金標抗體，用于制備相
應的金標抗體纖維棉；另外需要制備羊抗兔IgG抗體，用于制備控制線(C線)。 1、 SEM衍生物與載體蛋白偶聯
活性酯法將SEM對醛基苯甲酸衍生物(CPSEM)與載體蛋白BSA進行偶 聯制備人工結合抗原CPSEM-BSA。具體制備方法如下
(1) 取CPSEM 20.7mg (O.lmmol)， N-羥基琥珀酰亞胺NHS 17.25mg (0.15mmo1)， 二環己基碳二亞胺DCC 30.9mg (0.15mmo1)溶解于2mL的DMF
中，室溫下攪拌18小時，4500 r/min離心后棄沉淀，清液為活性酯中間體，為 A液；
(2) 將134mg的BSA (2pmo1)溶解于10mL的PBS(0.1M， pH8.0)中，
為B液；
(3) 將A液逐滴滴入B液中，溶液維持在4'C，所有的A液加入后，繼續 攪拌4小時；
(4) 透析透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再 用6(TC的去離子水沖洗3min，保存在4"C去離子水中備用；
將(3)反應液轉移到透析袋中，用PBS(0.01M， pH7.4)透析3天，每天換 水兩次；
(5) 透析完后，離心取上清液，4"冷藏待用；
混合酸酐法Cl)17.24mg的CPSEM(0.083mmol)攪拌溶解于1800^iL的DMF中，4°C 下加入20pL的三正丁胺，繼續攪拌30min后加入11.2^iL的氯甲酸異丁酯，繼 續攪拌反應lh，為A液；
(2) 將53.7mg的OVA攪拌溶解于6mL的硼酸鹽緩沖液(0.2M， pH9.0) 中，放入4"C的冰箱預冷30min，為B液；
(3) 4。C下，將A液逐滴滴入B液中，并在4"C下攪拌過夜；
(4) 透析透析袋前處理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸10min，再 用6(TC的去離子水沖洗3min，保存在4"C去離子水中備用；
將(3)反應液轉移到透析袋中，用超純水透析3天，每天換水兩次；
(5) 透析完后離心取上清液，4。C冷藏待用；
2、 抗SEM衍生物多克隆抗體的制備
用SEM衍生物載體蛋白結合抗原免疫白兔，制得抗SEM衍生物多克隆抗 體，-2(TC凍存備用。
3、 SEM衍生物金標抗體和金標物結合墊的制備
檸檬酸三鈉還原法制備膠體金由于氯化金極易吸濕，因此使用小劑量封 裝的氯化金時，必須一次配完。將lg的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水 溶液。放在4'C冰箱內保存，保存時間長達幾個月至l年左右。再取1%的氯金 酸溶液10mL,配制成濃度為O.lg/L的氯金酸溶液。取O.lg/L氯金酸溶液50 mL 放入錐形瓶，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰并持續2min，在100r/min磁力攪拌 下，加入l。/。檸檬酸三鈉水溶液2mL，保持溫度和攪拌速度不變，繼續攪拌加熱 6min，直至溶液呈透亮的酒紅色。室溫冷卻，4'C保存備用。獲得直徑為20nm 的膠體金溶液。
用0.1 mol/L K2C03或0.1 mol/L HC1調節膠體金溶液為pH 9.0，將10 mL膠 體金溶液加入50mL燒杯中，用電磁攪拌器250rpm攪拌，逐滴加入150 ^iL多 克隆抗體溶液，平衡過夜。逐滴加入5。/。BSA，使BSA的終濃度為1%，持續攪 拌5 min，以BSA和游離的膠體金結合。再將金標抗體溶液常溫低速(3000 rpm) 離心15min，棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀。取紅色上清溶液于4。C以11000 rpm離心40min。溶液分為二層透明上清，管底可流動的暗紅色沉淀。輕吸并 棄去上清液，將可流動的暗紅色沉淀用重懸液(0.002 mol/LpH9.0硼酸緩沖液含 5%蔗糖)混懸，恢復至棄上清前原體積后再離心。如此重復2 4次。以徹底除 去未結合的蛋白質。最后用重懸液將沉淀混懸為原體積的1/10， 4'C保存備用， 獲得SEM衍生物膠體金標記抗體。
將1:100 500稀釋的膠體金標記抗體吸附于精制玻璃纖維棉中，37'C干燥， 制備SEM衍生物金標物結合墊。
4、 膠體金層析試紙條檢測反應原理氨基脲(SEM)，呋喃西林代謝物，因為分子量僅為75，屬于小分子物質。 與硝基呋喃類其余代謝物檢測一樣，抗體對游離SEM不能捕獲，需要檢測其苯 甲醛衍生物PSEM。本發明采用競爭法，即樣品中的PSEM和固定在包被膜上 的包被抗原CPSEM-OVA競爭膠體金標記的抗CPSEM多克隆抗體。
當試紙條以樣品墊末端浸入樣本溶液后，樣品溶液沿著試紙條通過毛細作 用從下往上泳動，溶解金標墊上干燥的金標抗體，若待測樣品中不存在待測藥 物PSEM，則金標抗體會直接泳動到檢測線和硝酸纖維膜上的CPSEM-OVA發 生免疫反應，從而膠體金顆粒發生聚集，形成紅色的線條，然后其他未結合的 金標抗體繼續通過毛細管作用向前泳動，與控制線上的羊抗兔二抗發生第二次 免疫反應，同樣形成紅色線條，這樣包被膜上就會有兩條紅色線條，表示樣品 為陰性。若待測樣品中存在待測藥品PSEM，則金標抗體首先會和樣品中的檢測 物發生免疫反應，當未發生反應的金標抗體有剩余時，才會在檢測線上與 CPSEM-OVA發生免疫反應，形成紅色線條，其顏色強度弱于陰性時的線條強度； 而當金標抗體全部和樣品中的PSEM發生免疫結合時，就不會再有抗體與控制 線包被原結合，從而檢測線就不會有紅色線條出現。控制線是為檢驗金標免疫 層析方法本身是否有效而設定的，所以無論樣品中是否存在待測藥物PSEM，控 制線都應該顯現。如果控制線不顯色，則說明試紙條失效。
實施例2、制備檢測試紙條。把濃度lmg/mL的包被抗原及羊抗兔IgG噴在 包被膜上，分別作為檢測線(T)和控制線(C)，在37。C烘箱干燥10 min。以 同樣方法，將濃度0.2mg/mL的金標抗體包被在結合墊上。試紙條組成為一個襯 板，在其上按順序粘上樣品墊、膠體金結合墊、包被膜和吸水墊。將貼好的板 切割成3mm寬的條，然后將試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內密封保存。
實施例3、試紙條的檢測方法。
檢測樣品前處理:取lg豬肉組織均質物，加入5mL蒸餾水，1M的HC1 0.5mL 和0.01M的苯甲醛(乙醇溶液)IOOjiL，充分振蕩，置于60。C過夜。然后加入 1M的K2HP04 5mL， 1M的NaOH 0.4 mL以及5mL的乙酸乙酯，劇烈振蕩30 秒。室溫下4000 rpm離心10分鐘，然后取2.5mL乙酸乙酯上清液轉移到新容 器中。在45'C下用氮氣將其吹干，然后用正己垸重新溶解后與lmL的0.01M PBST (pH7.4，0.05%Tween-20)混勻。室溫下4000rpm離心10分鐘，最后取底 部水相測定。
檢測操作方法將SEM膠體金層析檢測試紙條樣品端插入待測樣品液中， 插入深度不超過標記線，約10 20秒鐘取出檢測試紙條，水平放置，15分鐘左 右觀察判定檢測結果。
結果判定如果在包被膜上僅有C線一條紅線顯現，表示檢測結果為陽性， 說明在待測樣品中含有PSEM;如果在包被膜上C線和T線兩條紅線都顯現， 表示檢測結果為陰性，說明在待測樣品中不含PSEM或含量低于檢測限；如果 在包被膜上C線紅線不顯現，則表明試紙條已失效。
權利要求
1.一種呋喃西林代謝物膠體金層析檢測試紙條的制備方法，其特征是含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊，金標結合墊為吸附呋喃西林代謝物SEM衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用SEM衍生物偶聯載體蛋白的溶液印制的直線式隱形檢測線T線，用羊抗兔IgG溶液印制的直線式隱形控制線C線，兩條線平行排列。
2. 根據權利要求1中所述的試紙條的制備方法，其特征是所述的襯板為 不吸水的韌性材料，選用硬質塑膠條，或不吸水硬紙條；所述的樣品墊選用玻 璃纖維棉，或尼龍膜，或聚偏二氟乙烯膜，或聚酯膜；所述的吸水墊選用吸水 能力較強的吸水濾紙或濾油紙；所述的包被膜選用硝酸纖維素膜或醋酸纖維素 膜。
3. 根據權利要求l中所述的試紙條的制備方法，其特征是所述的SEM衍 生物金標抗體為膠體金標記的SEM衍生物多克隆抗體；所述的偶聯SEM衍生 物的載體蛋白選用牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白OVA。
全文摘要
快速檢測呋喃西林代謝物的膠體金層析試紙條的制備方法，屬于檢測技術領域。本發明是含有襯板和在襯板上依次銜接的樣品墊、金標結合墊、包被膜、吸水墊組成，金標結合墊為吸附呋喃西林代謝物SEM衍生物金標抗體的玻璃纖維棉，在包被膜上有用SEM衍生物偶聯載體蛋白的溶液印制的檢測線(T)，用羊抗兔IgG溶液印制的控制線(C)，兩條線平行排列。該膠體金層析檢測試紙條以膠體金標記高親和力的多克隆抗體為基礎制備而成，本試紙條特異性強，敏感性高，檢出最低限量可達到5ppb；簡便、快速、時效性強，無需任何其它試劑和儀器，可現場操作，試紙條加入被檢樣品液后，在15分鐘內即可判定檢測結果；結果顯示形象、直觀、準確；節省費用，適用范圍廣，便于推廣。
文檔編號G01N33/52GK101320037SQ200810022138
公開日2008年12月10日 申請日期2008年6月25日 優先權日2008年6月25日
發明者劉麗強, 徐一平, 胥傳來 申請人:江南大學