專利名稱：：用于檢測可溶性pd-1蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
：本發明涉及醫學及生物學檢測領域，具體涉及一種用于檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒，以及應用該試劑盒檢測可溶性蛋白的方法。
背景技術：
：PD-1是一個5055kD的免疫球蛋白超家族I型跨膜糖蛋白，主要表達在激活的T、B細胞和骨髓內發育的特定階段(參見IshidaY等人，TheEMBOJournal,11:3887-3895(1992);AgataY等人，Int.Immunol,8:765-772(1996))，最初的研究表明，PD-1胞漿區的兩個酪氨酸殘基與下游的信號分子作用，可發揮免疫負性調控功能(參見LatchmanY等人，NatImmunol,2(3):261-268(2001);RavetchJV等人，Science,290(5489》84-89(2000)。PD-1還能促進T細胞的增殖，此作用依賴于CD28共刺激信號(參見RioML等人，EurJImmunol,35:3545-3560(2005))。另有動物實驗顯示，在PD-1基因敲除小鼠的動物模型中，PD-1的缺乏可導致一系列免疫性疾病的發生。PD-1缺陷小鼠可導致自主免疫的擴大性心肌病(參見HiroyukiN等人，Science,291:319-321(2001))。研究也表明阻斷PD-1信號可加速IFN-Y依賴的移植物抗宿主反應(參見BlazarBR等人，JImmunol,171:1272-1277(2003))。PD-1/PD-L信號途徑與實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)有關(參見SalamaAD等人，JExpMed，198:71-78(2003))。AIDS等臨床疾病的研究表明，PD-1的表達與體內T細胞的免疫調節作用有關，HIV感染可選擇性下調被感染細胞的PD-1的表達，防止細胞的早期凋亡(參見VenkatachaHNJ等人，Virology.;376:140-153(2008))。PD-1基因由5個外顯子和4個內含子組成，不同的PD-1mRNA的剪輯將造成PD-1分子胞內段、跨膜段以及胞外段的缺失，實驗證實PD-lAex3(第3號外顯子缺失)將形成可溶性PD-1(solublePD-l,sPD-l)，并且在細胞增殖試驗中用westernblot的方法證實，T細胞受CD3CD28刺激后，培養上清中sPD-l表達水平不增髙(參見NislsenC等人，CellImmunol,235:109-116(2005));BingW等在RA患者外周血和關節腔中證實了sPD-l的存在，并用RT-PCR的方法驗證了此可溶性PD-1的mRNA是第3號外顯子缺失(Aex3)的產物(參見WanB，NieH,ZhangJW等人，JImmunol,177:8844-8850(2006"。馮作化等人應用PD-1/PD-L這條通路的特點，以編碼PD-1胞外段的cDNA構建真核表達載體，表達了可溶性PD-l,并證明sPD-l能以高親和力結合PD-Ls,阻斷PD-Ls/PD-1的相互作用，從而增強T細胞殺腫瘤效應(參見邱惠，張慧，馮作化，耿輝，張桂梅，中華肝臟雜志，14(7):505-509(2006);賀蘭湘，張桂梅，賀宇飛，張慧，項錦毅，朱漢鋼，馮作化，中華微生物學和免疫學雜志，26(5):463-467(2006"因此，血清中sPD-l的表達水平的檢測對多種自身免疫性疾病及血液病等疾病的發生發展的監測具有重大意義，然而現今國內還沒有sPD-l酶聯免疫試劑盒。發明人明志君的博士論文《鼠抗人PD-l單克隆抗體的研制及其生物學功能研究》公開了制備兩株識別位點不同的鼠抗人PD-l分子單克隆抗體的技術方案，自主研發了兩株鼠抗人PD-l雜交瘤及其分泌的單克隆抗體，命名為1F2和5F10。目前仍沒有關于利用這兩種單克隆抗體檢測sPD-l的酶聯免疫試劑盒被報道。
發明內容本發明目的是利用單克隆抗體1F2和5F10制備檢測sPD-l蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒，并提供檢測方法，從而實現對sPD-l蛋白進行準確而又靈敏的檢測。為達到上述目的，本發明具體技術方案是，一種用于檢測sPD-l蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒，包括PD-l融合蛋白標準品，PD-l單克隆抗體1F2包被板，生物素標記的PD-l單克隆抗體5F10,辣根過氧化酶以及輔助試劑。上述PD-l單克隆抗體1F2和5F10的制備方法在發明人明志君的博士論文《鼠抗人PD-l單克隆抗體的研制及其生物學功能研究》已經公開，該論文已經收錄在萬方數據庫中，并且申請人蘇州大學保證自申請日起的20年內提供這兩種單克隆抗體PD-1單克隆抗體1F2和5F10。所述PD-1融合蛋白標準品的制備過程包括以下步驟PCR法克隆人PD-1基因的胞外段序列，RT-PCR從人脾臟細胞中擴增出人IgGlFc恒定區基因，兩者拼接后插入逆轉錄病毒載體pEGZ-Term中，重組載體與兩個輔助病毒載體脂質體法共轉染293T包裝細胞，用含病毒顆粒的培養上清感染L929細胞，Zeocin篩選獲得能穩定分泌表達PD-lIg蛋白的基因轉染細胞，經無血清培養基培養，收集的上清用dotblot檢測、ELISA定量后，濃縮并上ProteinG柱純化，進一步westernblot鑒定。所述單克隆抗體1F2包被板用PD-1單克隆抗體1F2包被酶標板而得，酶標板可選用12X8孔的可拆條板，其制作步驟如下(1)制備單克隆抗體1F2:克隆鼠抗人PD-1基因，制備穩定分泌抗人PD-1抗體的雜交瘤細胞株1F2,置于含胎牛血清及DMEM培養基中常規培養；收集生長良好的雜交瘤細胞1F2，注入經姥鮫垸(Pristane)致敏2周的Balb/c小鼠腹腔，710天后收集腹水，ProteinG免疫親和層析純化單抗；其詳細制備方法參見明志君的博士論文《鼠抗人PD-1單克隆抗體的研制及其生物學功能研究》；(2)包被將上述單克隆抗體1F2用包被液稀釋成2jig/ml，加入ELISA酶標板的各孔中，每孔lOOpl,于4'C下過夜；第二天，用封閉液封閉，200p1/孔，于4'C過夜；第三天，用清洗液洗滌；即獲得單克隆抗體1F2包被酶標板。所述包被液由1體積份的Tirs-HCL與9體積份的水組成；所述封閉液為質量分數為1%的BSA的PBS溶液；所述清洗液為含有溶液總質量1%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)，其配置方法為現有技術。本發明所述試劑盒中的生物素標記的PD-1單克隆抗體5F10為生物素N—羥基丁二酰亞胺酯標記的PD-1單克隆抗體5F10,其制備步驟如下(l)制備單克隆抗體5F10:克隆鼠抗人PD-1基因制備穩定分泌抗人PD-1抗體的雜交瘤細胞株5F10,置于含15%胎牛血清及DMEM培養基中常規培養；收集生長良好的雜交瘤細胞5F10，注入經姥鮫烷(Pristane)致敏2周的BALB/c小鼠腹腔，710天后收集腹水，經ProteinG免疫親和層析純化單抗5F10;(2)準備lmg單抗5F10,加入碳酸緩沖液(pH99.5)至lml，自來水沖洗透析袋，然后用CoatingBuffer沖洗透析袋；4'C下，在0.01mol/LpH=9.5的碳酸緩沖液中透析過濾；加入濃度為lmg/ml的BNHS-DMSO溶液40jd，用搖床，避光、室溫震蕩4h;用PBS透析7次，每天換兩次液；用PD-1/L929基因轉染細胞，用流式細胞法檢測PD-1在PD-1/L929上的表達率，以鑒定標記效果，本生物素標記的5F10單抗檢測PD-1在PD-1/L929上的表達率達到99%。所述辣根過氧化酶由1體積份的Avidin-HRP與16667體積份的BSA組成。所述輔助試劑包括清洗液，顯色液和終止液，它們的組成為清洗液含有質量分數1%的吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(pH=7.4);顯色液四甲基聯苯胺(TMB)的水溶液，其中四甲基聯苯胺與水的體積比為1:2;終止液2M硫酸。本發明試劑盒的測試方法，包括以下步驟-(1)抗原-抗體反應在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中，分別加入標準品PD-1融合蛋白的梯度稀釋液或者待測血清樣品的梯度稀釋液，37'C保溫1.5h;然后用清洗液洗板3次；所述標準品PD-lIg蛋白的梯度稀釋液是最高濃度為50ng/ml,按0.4倍稀釋為7個濃度的梯度稀釋液50ng/ml，20ng/ml，8ng/ml，3.2ng/ml，1.28ng/ml，0.512ng/ml，0.2048ng/ml;所述待測樣品的梯度稀釋液同樣按0.4倍稀釋為7個濃度；(2)再加入濃度為2fig/ml生物素標記的PD-1單抗5F10，100pl/孑L，37'C保溫lh;用清洗液洗板4次后，每孔加Avdin-HRPlOOjil，0'C保溫20min;然后用清洗液洗板6次；(3)每孔加入顯色劑TMB100p1,37'C保溫15min;最后每孔加50^il終止液終止反應；(4)以空白對照孔的吸光值為零，用酶標儀于450nm測得OD值；(5)結果計算A.制作標準工作曲線以標準品sPD-l的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制sPD-l的標準工作曲線。計算標準曲線回歸系數R，當W大于0.98本次測定有效；B.根據待測樣品的OD值從標準曲線計算出待測血清樣品的sPD-l的含量。由于上述技術方案運用，本發明與現有技術相比具有下列優點1.由于PD-1單克隆抗體1F2和5F10的應用，這兩種抗體的結合位點不同，而且具有特異性，因此利用這兩種抗體可以實現檢測可溶性PD-1蛋白的目的；2.在制作標準工作曲線的過程中，一般的方法采用對倍稀釋，本發明加入的標準品梯度稀釋液采用了0.4倍稀釋，獲得的工作曲線線性優良，回歸系數達到了0.9997;3.本發明提供應用在檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒具有穩定性，檢測準確，靈敏的優點。圖l實施例一中制作試劑盒與獲得標準工作曲線的流程圖；圖2實施例二中應用試劑盒檢測sPD-l蛋白的流程圖；圖3實施例一和二中獲得的標準工作曲線圖；圖4實施例二中各組測試對象血清中sPD-l含量分布圖。具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述，除非特別指出，實施例中涉及的百分數皆為質量百分數實施例一，制作檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯檢測試劑盒為方便說明，首先列出實施例中使用的主要試劑和儀器生物素N—羥基丁二酰亞胺酯((BNHS)Sigma公司)包被液體積比Tirs-HCL:H20=1:9清洗液PB配制(pH=7.4)的含質量分數1%吐溫20的溶液封閉液質量分數1%BSA(Sigma公司)的PBS溶液辣根過氧化酶體積比Avidin-HRP(Sigma公司)BSA=1:16667顯色液體積比四甲基聯苯胺(TMB)(Sigma公司)H20=1:2終止液2M硫酸酶標測定版(12X8孔，Nunc公司)；酶標測定儀(Bio-Rad公司)一種檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯檢測試劑盒，包括PD-lIg融合蛋白標準品1瓶，50ng/ml;PD-1單抗1F2包被的ELISA酶標板(96孔)1塊；生物素N—羥基丁二酰亞胺酯標記的PD-1單克隆抗體5F10，2ng/ml;辣根過氧化酶，Avidin-HRP(Sigma公司)BSA=1:16667;顯色液(TMB)1瓶；清洗液l瓶PB配制(pH=7.4)的含1%吐溫20的溶液；終止液1瓶2mol/L的硫酸；制備上述檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯檢測試劑盒的具體操作步驟如下，流程可參見圖1:1.制備PD-lIg融合蛋白標準品的制備過程包括以下步驟PCR法克隆人PD-1基因的胞外段序列，RT-PCR從人脾臟細胞中擴增出人IgGlFc恒定區基因，兩者拼接后插入逆轉錄病毒載體pEGZ-Term中，重組載體與兩個輔助病毒載體脂質體法共轉染293T包裝細胞，用含病毒顆粒的培養上清感染L929細胞，Zeocin篩選獲得能穩定分泌表達PD-lIg蛋白的基因轉染細胞，經無血清培養基培養，收集的上清用dotblot檢測、ELISA定量后，濃縮并上ProteinG柱純化，進一步westernblot鑒定，獲得標準品PD-lIg融合蛋白。2.制作PD-1單克隆抗體1F2和5F10:2.1細胞株的培養采用含10%FCS的RPMI1640培養基，基因轉染細胞株定期用抗性篩選藥物Zeocin(50(^g/ml)培養，以保持目的基因產物的穩定表達，通常以50pg/ml的Zeocin加以維持培養。PD-1/L929細胞和空逆轉錄病毒轉L929細胞株均為貼壁性生長，傳代時用0.25%的胰酶消化，間隔3~4d傳代培養。SP2/0用含10%FCS的DMEM培養基常規培養，間隔2~3d換液傳代。2.2動物的免疫收集生長良好的PD-1/L929細胞，用無菌PBS洗滌離心(1200rpmx5min)兩遍后，加入絲裂霉素溶液(50^ig/lxl(T個細胞)，混勻，置于37'C反應45min,PBS洗滌、離心(1200rpmx5min)三遍后，再用0.3~0.4ml的NS重新懸浮，采用腹腔注射("107個細胞/只)68周齡Balb/c小鼠。于初次免疫后的第21天和第35天分別進行再次免疫，細胞數量約為8><106細胞/只(第21天)和5><106細胞/只(第35天)，細胞的預處理及注射的部位同第一次。于融合前45d，再次腹腔注射3xl(^'細胞/只，進行加強免疫。2.3骨髓瘤細胞的準備融合前10~14d，復蘇小鼠骨髓瘤細胞SP2/0，用含10%FCS的DMEM培養基傳代培養，待細胞生長旺盛、形態良好(圓渾，透亮，大小均一)，且細胞活力大于95%(苔盼藍染色)方可用以融合。融合前2436h用新鮮含10%FCS的DMEM培養基將細胞濃度調整為3xl05/ml。2.4滋養細胞及免疫小鼠脾臟細胞的制備Balb/c小鼠l只，于融合前ld摘除眼球放血，斷頸處死，置于75%酒精中10min，固定于無菌超凈臺的解剖板上，沿胸骨打開小鼠胸腔并取出胸腺，同法打開小鼠胸腔并取出脾臟，將兩者置于120目的鋼絲網中，將篩網移入盛有20ml基礎培養基的平皿中，研磨胸腺和脾臟，使其成為單個細胞懸于培養基中，離心(1000rpmx5min)，重懸浮細胞并計數；用完全培養基或HAT培養基調整滋養細胞濃度為3~4xlOs/ml，將上述細胞點板于96孔培養板中(共10塊96孔培養板)，每孔加入O.lml細胞懸液即(34)xl()"孔，C02培養箱中培養備用。取加強免疫后的Balb/c小鼠，按上述方法處理小鼠，并在左后腹部取出脾臟，經研磨獲取單個脾臟細胞。用苔盼藍液作活細胞有核計數，離心(1000rpmx5min),DMEM洗滌兩遍后，將沉淀細胞懸于10mlDMEM基礎培養基中，置于培養箱中備用。2.5細胞的融合及選擇性培養將DMEM基礎培養基、PEG溶液置于37'C水浴中預溫。收集2><107個生長良好的SP2/0細胞，與lxl()S個脾臟細胞混合于50ml透明塑料離心管中，用無血清RPMI1640洗滌兩遍，1000rpm離心5min后，棄上清，用手指輕彈管底，使兩種免疫沉淀細胞充分混勻成糊狀。將塑料管置于37'C保溫杯中，吸取0.7ml經37'C預溫的50%的PEG溶液，將吸管輕輕插入細胞底部，在lmin內勻速加完，且邊加邊輕輕攪拌，然后在水浴中靜置90s,再加入40ml37'C預溫的DMEM基礎培養基，室溫靜止5min后離心(1000rpmxlOmin),棄去上清。將沉淀細胞輕輕用100ml含1%HAT、15°/。FCS的DMEM培養懸浮。混勾后滴加在上述含有滋養細胞的96孔培養板中，100pl/孔，置于37'C、5V。C02培養箱中培養，3-4d后半量換液，1012d后改用HT培養基培養，2周后轉用含15%FCS的DMEM培養基培養。2.6分泌PD-1單抗的陽性雜交瘤細胞株的篩選待細胞克隆生長至1/3~1/4培養孔時(培養基顏色呈黃色)，吸取上清，用間接免疫熒光標記法進行篩選。將生長良好的PD-1/L929細胞消化后，用PBS洗滌并調整其濃度，分于流式管中(5><105細胞/管)，加入雜交瘤細胞的培養上清(60pl/管)，同時以PE-PD-1mAb為陽性對照。于4'C反應45min,用含5%小牛血清的PBS洗滌兩遍，加入羊抗鼠PE標記抗體；再于4'C反應45min,洗滌后用FCM分析，同時以空逆轉錄病毒轉L929細胞作為陰性對照細胞株進行篩選。2.7陽性雜交瘤細胞的克隆化培養采用有限稀釋法對陽性克隆進行亞克隆。吸取PD-1抗體反應陽性孔的雜交瘤細胞，計數后用HAT選擇性培養基梯度稀釋至細胞為50個/ml和10個/m1/青霉素瓶，加人100^1至含有滋養細胞的96孔培養板中，使每孔平均含有5個和1個細胞，37'C、5V。C02培養，觀察細胞生長狀況。待克隆細胞長至孔底的l/5孔時，按已建立的陽性克隆的篩選方法進行復篩。選擇抗體效價髙、呈單個克隆生長且形態良好的細胞繼續亞克隆，直至抗體分泌陽性率大于95%;擴大培養并及時液氮凍存。2.8雜交瘤細胞染色體的核型分析取生長良好的細胞，加入秋水仙素，使其終濃度為0.04~0.08pl/ml。培養2h后，收集細胞，離心1000rpm,10min，逐滴加入于37'C預溫的0.075mol/LKC1溶液0.5ml,隨即再補加5~10ml，用吸管輕輕吹打均勻，37'C孵育20min。加入新鮮配制的3份甲醇+1份冰醋酸的固定液1ml(臨用時配制)，離心lOOOrpmXIOmiii,棄上清。再加入8~10ml固定液，用吸管吹打均勻，固定1520min，離心，棄上清。再加入5ml固定液，固定30min。離心棄上清。再加入1.5ml固定液，吹打均勻。取-10'C冰凍的載玻片，滴加12滴細胞懸液，用新鮮Giemsa溶液(1份Giemsa原液加9份0.075mol/L、PH6.8磷酸鹽緩沖液)染色1020min,流水沖洗后晾干。二甲苯透明三次，中性樹脂封片。在顯微鏡下選擇染色體分散良好、不重疊、無失散的標本，油鏡下觀察，記錄并進行顯微攝影。2.9單克隆抗體腹水的制備取810周齡的Balb/c小鼠(15只左右)，腹腔注入pristane(稱作P)0.5ml/只，1周后直接腹腔注入雜交瘤細胞5xl()5細胞/只，輕輕按摩小鼠腹部，使雜交瘤細胞充分混勻，并擴散至整個腹腔。7~12d左右收集腹水，離心，取上清，一80'C備用。2.10單克隆抗體的純化(ProteinG免疫親和層析法)將腹水離心除凝塊，每10ml腹水加入lmllmol/LCaCl2、0.1ml5%Sulfatedextran溶液，室溫攪拌15min,4'C離心(12000rpm，20min)去除纖維蛋白。取上清液按50V。飽和度加入等體積飽和(NH4)2SO4溶液，混勻后置4'C46小時，離心棄上清。取沉淀加0.01mol/L、PH7.4的PBS溶解。透析去除(1\114)2804,按照Pharmacia公司提供的單抗純化方案，樣品經FPLC系統上ProteinG親和層析柱，PH2.8甘氨酸洗脫。收集蛋白峰流出液，及時用PH9.0的Tris溶液調整PH至7.0。經PBS透析后用751紫外分光光度計測定抗體蛋白的含量，其濃度的計算公式為抗體蛋白含量(mg/ml)=OD28()xl.55—OD26()x0.76。抗體過濾除菌后，分裝于-8ox:保存。3.制作PD-1單克隆抗體1F2包被板酶標板可選用國產板或進口板，規格為96孔板或12X8、6X8孔的可拆條板。本發明采用一種進口酶標板(Nunc公司產品)。將上述1F2單克隆抗體用包被液稀釋為2網/ml后加入酶標板，每孔lOOjal，包被液由1體積份的Tirs-HCL和9體積份的H20組成，于4'C下過夜；第二天，用Sigma公司生產的封閉液1。/。BSA封閉，200^1/孔，于4'C過夜；第三天，用清洗液洗滌，即獲得單克隆抗體1F2包被酶標板。4.制備生物素N—羥基丁二酰亞胺酯標記的PD-1單克隆抗體5F10:準備lmg單抗5F10,加入pH99.5的碳酸緩沖液至lml,自來水沖洗透析袋，然后用CoatingBuffer沖洗透析袋；在0.01mol/LpH9.5的碳酸緩沖液中透析過濾(4'C);加入濃度為lmg/ml的BNHS-DMSO40fd,用搖床，避光、室溫震蕩4h;用PBS透析7次，每天換兩次液；用PD-1/L929基因轉染細胞，用流式細胞法檢測PD-1在PD-1/L929上的表達率，以鑒定標記效果，本生物素標記的5F10單抗在PD-1/L929上的表達率達到99°/0。5.配制清洗液PB配制(pH=7.4)的含1°/。吐溫20的溶液；6.配制辣根過氧化酶溶液Avidin-HRP(Sigma公司)BSA=1:16667;7.配制顯色液四甲基聯苯胺(TMB)(Sigma公司)H20=1:2;8.配制終止液2M硫酸。應用本發明技術制備的可溶性PD-1蛋白的酶聯檢測試劑盒的質量檢測(l)穩定性試驗包被好的酶標板置4'C保存0、10、20、30天后，分別分析標準曲線中部分測定點數值的變異系數CV<5.17%。具體結果參見表1:表1sPD-lELISA試劑盒的穩定性分析(y±s，CV%)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(2)準確性試驗采用加入法，在5份已知sPD-l濃度的血清標本稀釋液中，分別加入sPD-l的標準品5.00ng。測定回收率，平均約為100%。具體結果參見表格2:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>(3)精密度實驗隨機用15盒不同批次試劑盒，用同一樣本進行重復測定，計算每次測定結果，求出均值、SD和變異系數，CV<12%。(4)線性范圍加入標準品(PD-1Ig)，最髙濃度為50ng/ml，按0.4倍稀釋為7個濃度50ng/ml，20ng/ml，8ng/ml，3.2ng/ml，1.28ng/ml，0.512ng/ml，0.2048ng/ml的梯度稀釋液，按照說明書的步驟進行操作測定。以sPD-l的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制曲線，試劑盒的線性范圍為0.2-50ng/ml。(5)檢測靈敏度根據上述線性范圍測定結果，本試劑盒的檢測靈敏度為0.2ng/ml。實施例二應用可溶性PD-1蛋白的酶聯檢測試劑盒的使用實例，其流程圖可參見圖2(1)收集正常人，再生障礙性貧血(AA)患者，急性淋巴白血病(ALL)患者，急性髓性白血病(AML)患者，非柯氏淋巴瘤(NHL)患者，肝移植病人，甲亢患者的血清，零下20'C凍存；(2)將標準品PD-1Ig(濃度50ng/ml),用二次蒸餾水按0.4倍稀釋7個梯度濃度，試劑盒中的標準曲線由7個不同濃度的標準品組成，標準曲線各點的濃度分另'J為50ng/ml，20ng/ml，8ng/ml，3.2ng/ml，1.28ng/ml,0.512ng/ml，0.2048ng/ml;同樣將待測樣本血清按0.4倍稀釋7個梯度濃度；(3)抗原-抗體反應在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中，分別加入標準品和待測樣本血清的梯度稀釋液，37'C保溫1.5h,然后用清洗液洗板三次；(4)酶聯反應每孔加入100pl濃度為2jag/ml的生物素標記的PD-1單抗Bio-5F10，37'C保溫lh;清洗液洗板四次后，每孔加lOOjil的Avdin-HRP,0'C保溫20min;(5)最后用清洗液洗板6次，每孔加入顯色劑TMB100jul，37'C保溫15min;然后加每孔2M的H2S04溶液50^1終止反應；(6)比色以空白對照孔的吸光值為零，用酶標儀于450nm測得OD值；(7)結果計算以sPD-l的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制sPD-l的標準工作曲線，參見圖3，應用軟件曲線專家1.3，求得樣本sPD-l含量。檢測結果見圖4，統計學分析結果見表3:表3各組人外周血上清sPD-l含量的統計學分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>人外周血上清中sPD-l含量的測定結果如圖4和表3所示，正常人(28例)的含量在0.7751.825之間，平均值為1.103，中位數為1.033;AA患者(29例)含量在1.06214.000之間，平均值為3.542，中位數為2.002;ALL(10例)患者的含量在1.2425.604之間，平均值為2.736，中位數為2.187;AML(5例)患者含量在0.9110.127，平均為3.864，中位數為1.74;NHL(3例)患者含量在2.0563.946之間，平均值為3.145，中位數為2.325;甲亢和器官移植患者各8例，與正常人比較都沒有顯著差異。AA患者血清中sPD-l含量明顯高于正常人(P^.01，表3),其他類型的血液病患者也有少數髙于正常值，甲亢和器官移植病人的sPD-l含量于正常人比較沒有顯著差異。該方法可供科研、臨床自身免疫性疾病及血液病等疾病的檢測，對臨床相關疾病的診斷、監測及預后提供評估。權利要求1.一種用于檢測sPD-1蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于包括PD-1Ig融合蛋白標準品，PD-1單克隆抗體1F2包被板，生物素標記的PD-1單克隆抗體5F10，辣根過氧化酶以及輔助試劑。2.根據權利要求1所述的用于檢測sPD-l蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述單克隆抗體1F2包被板用PD-1單克隆抗體1F2包被酶標板而得，酶標板的孔中單克隆抗體1F2的濃度為2pg/ml。3.根據權利要求1所述的用于檢測sPD-l蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述生物素標記的PD-1單克隆抗體5F10為生物素N—羥基丁二酰亞胺酯標記的PD-1單克隆抗體5F10。4.根據權利要求1所述的用于檢測sPD-l蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述辣根過氧化酶由1體積份的Avidin-HRP與16667體積份的BSA組成。5.根據權利要求1所述的用于檢測sPD-l蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述輔助試劑包括清洗液，顯色液和終止液。6.—種測試sPD-l蛋白的方法，包括抗原-抗體反應、酶聯反應、顯色反應、終止反應步驟，其特征在于釆用權利要求1所述的試劑盒，包括以下具體步驟，(1)抗原-抗體反應在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中，分別加入標準品PD-1Ig融合蛋白的梯度稀釋液或者待測血清樣品的梯度稀釋液，37'C保溫1.5h;然后用清洗液洗板3次；所述標準品PD-lIg的梯度稀釋液是最髙濃度為50ng/ml，用質量分數1%BSA的磷酸鹽緩沖溶液按0.4倍稀釋為7個濃度的梯度稀釋液50ng/ml，20ng/ml，8ng/ml，3.2ng/ml，1.28ng/ml，0.512ng/ml，0.2048ng/ml;所述待測樣品的梯度稀釋液同樣按0.4倍稀釋為7個濃度；(2)再加入濃度為2pg/ml生物素標記的PD-1單抗5F10，100]nl/孔，37'C保溫lh;用清洗液洗板4次后，每孔加Avdin-HRP100^1，0'C保溫20min;然后用清洗液洗板6次；(3)每孔加入顯色劑TMBlOOjil,37'C保溫15min:最后每孔加終止液終止反應；(4)以空白對照孔的吸光值為零，用酶標儀于450nm測得OD值；(5)結果計算A.制作標準工作曲線以標準品sPD-l的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制sPD-l的標準工作曲線。計算標準曲線回歸系數R，當W大于0.98本次測定有效；B.根據待測樣品的OD值從標準曲線計算出待測血清樣品的sPD-l的含量。全文摘要本發明提供了一種檢測可溶性PD-1蛋白的酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法。本發明試劑盒由PD-1融合蛋白標準品、單克隆抗體包被板、酶標單克隆抗體及輔助試劑組成。該試劑盒應用發明人自主研發的兩株鼠抗人PD-1雜交瘤及其分泌的單克隆抗體，命名為1F2和5F10，并根據兩株單抗的識別位點不同的特點，建立了可溶性PD-1(sPD-1)的酶聯免疫檢測試劑盒及其檢測方法；利用該試劑盒可以準確而又靈敏地檢測出sPD-1蛋白。該方法可供科研、臨床自身免疫性疾病及血液病等疾病的檢測，對臨床相關疾病的診斷、監測及預后提供評估。文檔編號G01N33/577GK101339195SQ200810021580公開日2009年1月7日申請日期2008年8月6日優先權日2008年8月6日發明者吳海競,張學光,明志君,陳永井申請人:蘇州大學