專利名稱：：痕量真菌毒素分子印跡柱制備方法及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及真菌毒素檢測
技術領域：
，更具體地說是一種痕量真菌毒素分子印跡柱制備方法,本發明還涉及采用所述的分子印跡柱檢測樣本中痕量真菌毒素的方法。技術背景真菌毒素(Mycotoxin)是一些真菌(主要為曲霉屬、青霉屬及鐮孢屬)在生長過程中產生的易引起人和動物病理變化和生理變態的次級代謝產物，毒性很高。按化學結構計算，估計有400種真菌代謝產物對人類和動物是有毒的。代表性的真菌毒索有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、展青霉素、單端孢霉烯族毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、雜色曲霉菌素、串株鐮刀菌素、桔霉素等。人或動物攝入被真菌毒素污染的食物，或通過吸入及皮膚接觸真菌毒素可引發多種中毒癥狀，對機體甚至造成永久性損害。因此，隨著檢測方法和分析技術的發展，人們發現真菌毒素幾乎廣泛存在于所有的食品和飼料中。所以，對真菌毒素的檢測分析尤其重視。真菌毒素是小分子物質，極耐熱，毒性不因通常的加熱而被破壞，可引起多器官的損害，而且具有遠期致病作用。更重要的是，被真菌毒素污染的糧食在外觀上是正常的，不易被人們注意。隨著真菌毒素檢測手段的進步，21世紀真菌毒素的研究必將是熱門課題之一。真菌毒素的存在會威脅人類健康，造成社會經濟損失，因此，真菌毒素的預防、去毒、解毒，尤其是快速高靈敏度的檢測方法的建立顯得十分重要。真菌毒素的檢測分析方法一般有薄層色譜法(TCL)、高效液相色譜法(HPLC)、免疫分析法等，現代真菌毒素的快速分析方法主要有酶聯免疫吸附法(ELISA)和免疫親和層析-熒光法。國外，已有較多的真菌毒素檢測的報道。Yu等(2005)建立了赭曲霉素AA(0TA)多克隆抗體直接競爭ELISA方法。Schneider等(2000)利用雞卵黃抗體建立了谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的間接競爭ELISA方法。BirdCB等(2002)在樣品中添加1.0、3.0、5.0mg/kg伏馬菌素(FM)時，平均回收率分別為120%、100%、90%。Xu等(1988)利用直接ELISA方法測定了谷物D0N，樣品添加濃度為10-1000ng/ml時回收率為100%-102.1°/。。Liu等(1985)建立了檢測谷物、小麥、豬飼料中玉米赤霉烯酮(ZEN)的多克隆抗體間接競爭ELISA方法。日本協和梅迪克斯株式會社發明了用于單端孢菌毒素真菌毒素檢測的方法和試劑，并于2000年申請了專利。歐美各國紛紛開發研制基于單克隆或多克隆抗體的真菌毒素ELISA檢測試劑盒，并已商業化，廣泛用于農產品和食品安全檢測，但進口價格偏高。國內，褚慶華等(2005)利用免疫親和柱層析凈化熒光光度法和免疫親和柱層析凈化高效液相色譜法建立了對油料(大豆、油菜籽)以及食用植物油中黃曲霉素、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的快速檢測方法。黃彪等(2006)采用時間分辨熒光技術建立了高靈敏的黃曲霉毒素B1(AFB1)間接競爭免疫分析法(AFB-TRFIA)。陽傳和等(1990)采用免疫技術建立了檢測真菌毒素的國家標準(GB/T14933-94)。這些檢測方法大多都有周期長，過程復雜，費時費力等缺點。由于大多數真菌毒素的類似物較多、新發現的真菌毒素不斷增加、真菌毒素污染的普遍性和危害性被逐步認識等原因，對真菌毒素的快速高靈敏度分析方法也提出了更迫切和更高的要求。目前，限制真菌毒素檢測研究的難點主要是結構相似物較多，交叉反應普遍；毒素檢測時較易受提取液中其它難于去除的干擾物質的影響等。針對當前真菌毒素危害性大、檢測困難、不易預防等特點，尤其對商檢和衛生防疫部門來說，更需要有一個簡便、快速、靈敏的方法對真菌毒素進行檢測，對其潛在危害作出判斷，以促進經濟發展，保障人類健康。
發明內容本發明要解決的技術問題是提供了一種檢測速度快、靈敏度高的痕量真菌毒素分子印跡柱制備方法及應用。本發明是通過以下措施來實現的一種痕量真菌毒素分子印跡柱制備方法，其特征是包括以下步驟(1)選擇能與真菌毒素合成分子印跡聚合物的功能單體；(2)按一定摩爾比將真菌毒素模板分子、功能單體、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶劑混合均勻制成分子印跡聚合物溶液；(3)利用納米材料，按照現有方法制備出納米溶液；(4)利用表面修飾技術，將納米材料和分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面上。本發明所述真菌毒素模板分子、功能單體、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶劑的摩爾比為o.ii:i:o.36:2565:o.oio.15:i.o25。本發明所述納米材料和分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面包括以下步驟(l)選用長度為5-10cm，直徑為2-10腿的玻璃管柱，分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干；(2)將制備的納米溶液超聲處理20-60min，得到分散的納米溶液；(3)將分散的納米溶液注入玻璃管柱內，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，浸泡5-10min，排出管內的納米溶液，將玻璃管柱在室溫下晾干；(4)將步驟(3)中晾干的玻璃管柱中再注入分子印跡聚合物溶液，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，浸泡5-lOmin，然后將玻璃管柱中的分子印跡聚合物溶液排出，用洗脫劑洗脫20-30min，在室溫下干燥5-10min;(5)重復步驟(3)和步驟(4)過程4-7次，制得所述分子印跡柱。本發明所述納米材料和分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面還包括以下步驟將分子印跡柱浸入pH6.8-7.2緩沖液中，保存在4'C冰箱中，24h后使用。本發明所述納米溶液為碳納米管溶液、納米金溶液或納米鉑溶液。本發明所述洗脫劑為乙腈、水、甲醇和乙酸混合液或乙腈和乙酸混合液。本發明所述緩沖液為檸檬酸-磷酸。本發明所述所述功能單體為丙烯酸、甲基丙烯酸或4-乙烯基吡啶；所述交聯劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、N、N-亞甲基二丙烯酰胺、3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或季戊四醇三丙烯酸酯；所述引發劑為偶氮二異丁腈；所述致孔劑采用二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、異丙醇、四氯化碳、N，N-二甲基酰胺或二甲基亞砜；所述有機溶劑為二氯甲垸或四氯化碳。一種檢測痕量真菌毒素的方法，包括如下步驟將按上述任意一種方法制得的分子印跡柱連接到化學發光分析儀，將化學發光體系溶液與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，對樣品中的真菌毒素進行檢測。本發明所述化學發光體系溶液為魯米諾溶液，光澤精溶液，N-溴代丁二酰亞胺溶液，CeOV)-SO^溶液，魯米諾-KMn04溶液，魯米諾-11202溶液，異煙肼-NaC10溶液，NaKVH202溶液。本發明的有益效果1、將納米材料的納米增效作用引入到分子印跡柱的制備當中，使得所制備的真菌毒素分子印跡柱具有更高的靈敏性和檢測范圍。2、將表面修飾技術應用到分子印跡柱的制備當中，使得納米增效的真菌毒素分子印跡柱的制備具有可控性，提高了柱子的檢測靈敏度和準確性。3、本發明所得到的納米增效的痕量真菌毒素分子印跡柱連接到化學發光分析儀用于檢測真菌毒素，可以實現樣本中真菌毒素的高特異性、高靈敏度、快速檢測。4、本發明的分子印跡柱的特異性強，樣品中其它非特異性分子對檢測結果無影響；靈敏度高，可以達到amol級；檢測速度快，完成一個基本檢測過程僅需lmin左右的時間，可在短時間內實現大量樣本的高通量篩選；成本低，檢測l個樣品僅需幾分錢。5、分子印跡柱檢測真菌毒素的方法，操作快速簡單，反應及結果均由儀器自動完成和記錄，避免了主觀因素的影響，并保證有很好的重復性，便于現場檢測。6、將化學發光體系溶液與分子印跡技術相結合用于真菌毒素檢測，既有生物傳感的專一識別性，又有化學傳感的機械穩定性、熱穩定性。下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步詳細描述。圖1為納米材料和分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面的過程示意圖。具體實施方式實施例l一種痕量赭曲霉素A檢測的分子印跡柱制備方法，包括以下步驟(1)選擇能與赭曲霉素A合成分子印跡聚合物的功能單體甲基丙烯酸(MAA);(2)碳納米管溶液制備:在超聲攪拌的條件下，將2mg多壁碳納米管(Multi-walledcarbonnanotubes，MWCNTs)加入到1ml二甲基亞砜溶液中，從而獲得黑色懸濁液即MWCNTs溶液；(3)取制備好的MWCNTs溶液20^d，超聲30min，得到均勻分散的MWCNTs溶液；(4)模板分子赭曲霉素A，功能單體甲基丙烯酸(MAA)，交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，致孔劑氯仿，引發劑偶氮二異丁腈，有機溶劑二氯甲垸按摩爾比為o.i:i:0.5:35:0.05:2.0混合均勻，得到赭曲霉素a分子印跡聚合物溶液；(5)選用長度為5cm，直徑為3mm的玻璃管柱，分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干，保證玻璃管柱內表面光亮無雜質；(6)如圖1所示將MWCNTs溶液注入玻璃管柱中，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將MWCNTs溶液排出，在室溫下干燥10min，再將赭曲霉素AA分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將赭曲霉素AA分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min，直至把這一層中的模版分子赭曲霉素A完全洗掉，在室溫下干燥IOmin，再將MWCNTs溶液注入玻璃管柱中，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將MWCNTs溶液排出，室溫下干燥10min，再將赭曲霉素AA分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將赭曲霉素AA分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min,直至把這一層中的模版分子赭曲霉素A完全洗掉，在室溫下干燥10min。如此循環，重復上述過程5次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液中，保存在4'C的冰箱中24小時，以便除去玻璃管柱內表面過量的赭曲霉素A分子印跡聚合物，當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后，制備成功納米增效赭曲霉素A分子印跡柱。將制備成功的赭曲霉素A分子印跡柱連接到化學發光分析儀，將濃度2.0xl(T4mol/L魯米諾溶液與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，對樣品中的赭曲霉素A進行檢測，結果見表l。利用上述同樣方法，但玻璃管柱內表面未修飾MWCNTs，制備赭曲霉素A分子印跡柱，連接到化學發光分析儀，對樣品中的赭曲霉素AA進行檢測，結果見表l。表l本發明赭曲霉素A分子印跡柱與普通赭曲霉素A分子印跡柱檢測效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>從表1中結果可以看出MWCNTs修飾的赭曲霉素A分子印跡柱比普通赭曲霉素A分子印跡柱(未加MWCNTs修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例2一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子印跡柱制備方法，包括以下步驟(1)選擇能與脫氧雪腐鐮刀菌烯醇合成分子印跡聚合物的功能單體丙烯酸；(2)納米金溶液的制備取50mL0.01%HAuC14加熱至沸騰，迅速加入1mL1%檸檬酸鈉溶液還原，所制備亮玫紅色即納米金溶液，放入4t:冰箱保存備用；(3)取制備好的納米金溶液2(V1，超聲20min，得到均勻分散的納米金溶液；(4)模板分子脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，功能單體丙烯酸，交聯劑三羥甲基丙垸三甲基丙烯酸酯，致孔劑二氯甲烷，引發劑偶氮二異丁腈，有機溶劑二氯甲垸按摩爾比0.5:l:3:45:o.i:2.2，混合均勻，得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子印跡聚合物溶液；(5)選用長度為8cm，直徑為2mm的玻璃管柱，分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干，保證玻璃管柱內表面光亮無雜質；(6)如圖1所示將納米金溶液注入玻璃管柱中，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將納米金溶液排出，在室溫下干燥10min，再將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇MIPs溶液注入玻璃管柱中，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇MIPs溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min，直至把這一層中的模版分子脫氧雪腐鐮刀菌烯醇完全洗掉，在室溫下干燥10min，再將納米金溶液注入玻璃管柱中，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將納米金溶液排出，室溫下干燥10min，再將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇MIPs溶液注入玻璃管柱中，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將脫氧雪腐鐮刀菌烯醇MIPs溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min，直至把這一層中的模版分子脫氧雪腐鐮刀菌烯醇完全洗掉，在室溫下干燥10min。如此循環，重復上述過程7次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液中，保存在4'C的冰箱中24小時，以便除去玻璃管柱內表面過量的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子印跡聚合物，當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后，制備成功納米增效脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子印跡柱。將制備成功的納米增效脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子印跡柱連接到化學發光分析儀，采用光澤精化學發光體系，將光澤精溶液與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，對樣品中的赭曲霉素A進行檢測，結果見表2。利用上述同樣方法，但玻璃管柱內表面未修飾納米金，制備脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子印跡柱，連接到化學發光分析儀，對樣品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行檢測，結果見表2。表2本發明脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子印跡柱與普通脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子印跡柱檢測效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表2中結果可以看出納米金修飾的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子印跡柱比普通脫氧雪腐鐮刀菌烯醇分子印跡柱(未加納米金修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例3一種伏馬菌素分子印跡柱制備方法，包括以下步驟(1)選擇能與伏馬菌素合成分子印跡聚合物的功能單體4-乙烯基吡啶；(2)納米鉑溶液的制備取4ml5%的H2PtCl66H20溶液被加入到340ml的雙蒸水中，然后在8(TC下邊攪拌邊加熱，加入60mlP/。的檸檬酸鈉溶液以后，得到的溶液即納米鉑溶液在80±0.5°C，保溫大約4小時，該過程通過吸附光譜記錄，當PtCls2—的吸附帶消失的時候表明反應結束，即得到納米鉑溶液；(3)取制備好的納米鉑溶液2(^1，超聲40min，得到均勻分散的納米鉑溶液；(4)模板分子伏馬菌素，功能單體4-乙烯基吡啶，交聯劑N、N-亞甲基二丙烯酰胺，致孔劑甲醇，引發劑偶氮二異丁腈，有機溶劑二氯甲垸按摩爾比i:i:6:65:0.15:25，混合均勻，得到伏馬菌素分子印跡聚合物溶液；(5)選用長度為10cm,直徑為5mm的玻璃管柱，分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干，保證玻璃管柱內表面光亮無雜質；(6)如圖1所示將納米鉑溶液注入玻璃管柱中，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將納米鉑溶液排出，在室溫下干燥10min，再將伏馬菌素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將伏馬菌素分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min，直至把這一層中的模版分子伏馬菌素完全洗掉，在室溫下干燥10min，再將納米鉑溶液注入玻璃管柱中，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將納米鉑溶液排出，室溫下干燥IOmin，再將伏馬菌素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將伏馬菌素分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min，直至把這一層中的模版分子伏馬菌素完全洗掉，在室溫下干燥10min。如此循環，重復上述過程7次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH7.2的檸檬酸-磷酸緩沖液中，保存在4'C的冰箱中24小時，以便除去玻璃管柱內表面過量的伏馬菌素分子印跡聚合物，當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后，制備成功伏馬菌素分子印跡柱。將制備成功的伏馬菌素分子印跡柱連接到化學發光分析儀，采用亞胺類化學發光體系，將N-溴代丁二酰亞胺(NBS)溶液(5.0xl0'2mol/L)與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，對樣品中的伏馬菌素進行檢測，結果見表3。利用上述同樣方法，但玻璃管柱內表面未修飾納米鉑，制備伏馬菌素分子印跡柱，連接到化學發光分析儀，對樣品中的伏馬菌素進行檢測，結果見表3。表3本發明伏馬菌素分子印跡柱與普通伏馬菌素分子印跡柱檢測效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>從表3中結果可以看出納米鉑修飾的伏馬菌素分子印跡柱比普通伏馬菌素分子印跡柱(未加納米鉑修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例4一種玉米赤霉烯酮檢測的分子印跡柱制備方法，包括以下步驟(1)選擇能與玉米赤霉烯酮合成分子印跡聚合物的功能單體4-乙烯基吡啶；(2)納米鉑溶液的制備取4ml5%的H2PtCl66H20溶液被加入到340ml的雙蒸水中,然后在8(TC下邊攪拌邊加熱，加入60mlP/。的檸檬酸鈉溶液以后，得到的溶液即納米鉑溶液在80±0.5°C，保溫大約4小時，該過程通過吸附光譜記錄，當PtCl62—的吸附帶消失的時候表明反應結束，即得到納米鉑溶液；(3)取制備好的納米鉑溶液20ial，超聲40min，得到均勻分散的納米鉑溶液；(4)模板分子玉米赤霉烯酮，功能單體4-乙烯基吡啶，交聯劑3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸，致孔劑異丙醇，引發劑偶氮二異丁腈，有機溶劑二氯甲烷按摩爾比0.8:i:i:50:0.08:io，混合均勻，得到玉米赤霉烯酮分子印跡聚合物溶液；(5)選用長度為10cm，直徑為10mm的玻璃管柱，分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干，保證玻璃管柱內表面光亮無雜質；(6)如圖l所示將納米鉑溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，8min后將納米鉑溶液排出，在室溫下干燥8min,再將玉米赤霉烯酮分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將玉米赤霉烯酮分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min，直至把這一層中的模版分子玉米赤霉烯酮完全洗掉，在室溫下干燥10min,再將納米鉑溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將納米鉑溶液排出，室溫下干燥8min，再將玉米赤霉烯酮分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將玉米赤霉烯酮分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min,直至把這一層中的模版分子玉米赤霉烯酮完全洗掉，在室溫下干燥10min。如此循環，重復上述過程5次。(7)將上述玻璃管柱浸入到？!17.2的檸檬酸-磷酸緩沖液中，保存在4。C的冰箱中24小時，以便除去玻璃管柱內表面過量的玉米赤霉烯酮分子印跡聚合物，當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后，制備成功納米增效玉米赤霉烯酮分子印跡柱。將制備成功的玉米赤霉烯酮分子印跡柱連接到化學發光分析儀，采用Ce(IV)作氧化劑的化學發光體系，將Ce(IV)-SO,溶液與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，溶液中Ce(IV)濃度為1.0xl(r3niol/L，SO,濃度為3.0xl(r4mol/L，對樣品中的玉米赤霉烯酮進行檢測，結果見表4。利用上述同樣方法，但玻璃管柱內表面未修飾納米鉑，制備玉米赤霉烯酮分子印跡柱，連接到化學發光分析儀，對樣品中的玉米赤霉烯酮進行檢測，結果見表4。表4本發明納米鉑增效玉米赤霉烯酮分子印跡柱與普通玉米赤霉烯酮分子印跡柱檢測效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>從表4中結果可以看出納米鉑修飾的玉米赤霉烯酮分子印跡柱比普通玉米赤霉烯酮分子印跡柱(未加納米鉑修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例5一種單端孢菌毒素檢測的分子印跡柱制備方法，包括以下步驟(1)選擇能與單端孢菌毒素合成分子印跡聚合物的功能單體4-乙烯基吡啶(4-VP);(2)納米金溶液的制備取50mL0.01%HAuC14加熱至沸騰，迅速加入1mL1%檸檬酸鈉溶液還原，所制備亮玫紅色即納米金溶液，放入4'C冰箱保存備用；G)取制備好的納米金溶液20nl，超聲50min，得到均勻分散的納米金溶液；(4)按摩爾比0.5:i:3:45:o.i:2.2稱取模板分子單端孢菌毒素，功能單體4-乙烯基吡啶(4-VP)，交聯劑季戊四醇三丙烯酸酯，致孔劑二甲基亞砜，引發劑偶氮二異丁腈，有機溶劑二氯甲烷，混合均勻，得到單端孢菌毒素分子印跡聚合物溶液；(5)選用長度為10cm，直徑為8mm的玻璃管柱，分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干，保證玻璃管柱內表面光亮無雜質；(6)如圖1所示將納米金溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將納米金溶液排出，在室溫下干燥10min，再將單端孢菌毒素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將單端孢菌毒素分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min，直至把這一層中的模版分子單端孢菌毒素完全洗掉，在室溫下干燥10min，再將納米金溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將納米金溶液排出，室溫下干燥10min，再將單端孢菌毒素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將單端孢菌毒素分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min，直至把這一層中的模版分子單端孢菌毒素完全洗掉，在室溫下干燥10min。如此循環，重復上述過程6次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液中，保存在4'C的冰箱中24小時，以便除去玻璃管柱內表面過量的單端孢菌毒素分子印跡聚合物，當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后，制備成功納米增效單端孢菌毒素分子印跡柱。將制備成功的單端孢菌毒素分子印跡柱連接到化學發光分析儀，采用高錳酸鉀(KMn04)作氧化劑的化學發光體系，將魯米諾-KMn04溶液(與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，魯米諾-KMn04溶液中魯米諾的濃度為1.0xl(T3moI/L，KMn04的濃度為1.0xl(^mol/L，對樣品中的單端孢菌毒素分子進行檢測，結果見表5。利用上述同樣方法，但玻璃管柱內表面未修飾納米金，制備單端孢菌毒素分子印跡柱，連接到化學發光分析儀，對樣品中的單端孢菌毒素進行檢測，結果見表5。表5本發明單端孢菌毒素分子印跡柱與普通單端孢菌毒素分子印跡柱檢測效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>從表5中結果可以看出納米金修飾的單端孢菌毒素分子印跡柱比普通單端孢菌毒素分子印跡柱(未加納米金修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例6一種黃曲霉毒素檢測的分子印跡柱制備方法，包括以下步驟(1)選擇能與黃曲霉毒素分子合成分子印跡聚合物的功能單體甲基丙烯酸；(2)碳納米管溶液的制備在超聲攪拌的條件下，將2mgMWCNTs加入到lml二甲基亞砜溶液中，從而獲得黑色懸濁液即MWCNTs溶液；(3)取制備好的MWCNTs溶液2(Hd，超聲60min，得到均勻分散的MWCNTs溶液；(4)按摩爾比為i:l:4:60:0.12:15稱取模板分子黃曲霉毒素，功能單體甲基丙烯酸(MAA)，交聯劑二乙烯基苯(DVB)，致孔劑二氯甲烷，引發劑偶氮二異丁腈，有機溶劑二氯甲烷，混合均勻，得到黃曲霉毒素分子印跡聚合物溶液；(5)選用長度為5cm，直徑為3mm的玻璃管柱，分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干，保證玻璃管柱內表面光亮無雜質；(6)如圖1所示將MWCNTs溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將MWCNTs溶液排出，在室溫下干燥10min，再將黃曲霉毒素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將黃曲霉毒素分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min，直至把這一層中的模版分子黃曲霉毒素完全洗掉，在室溫下干燥10min,再將MWCNTs溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將MWCNTs溶液排出，室溫下干燥10min，再將黃曲霉毒素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將黃曲霉毒素分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min，直至把這一層中的模版分子黃曲霉毒素完全洗掉，在室溫下干燥10min。如此循環，重復上述過程5次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液中，保存在4。C的冰箱中24小時，以便除去玻璃管柱內表面過量的黃曲霉毒素分子印跡聚合物，當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后，制備成功納米增效黃曲霉毒素分子印跡柱。將制備成功的納米增效黃曲霉毒素分子印跡柱連接到化學發光分析儀，采用過氧化氫(H202)作氧化劑的化學發光體系，將魯米諾-11202溶液(魯米諾2.5x10—2mol/L，H202:5.0xl(T5mol/L)與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，對樣品中的黃曲霉毒素進行檢測，結果見表6。利用上述同樣方法，但玻璃管柱內表面未修飾MWCNTs，制備黃曲霉毒素分子印跡柱，連接到化學發光分析儀，對樣品中的黃曲霉毒素進行檢測，結果見表6。表6本發明黃曲霉毒素分子印跡柱與普通黃曲霉毒素分子印跡柱檢測效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>從表6中結果可以看出MWCNTs修飾的黃曲霉毒素分子印跡柱比普通黃曲霉毒素分子印跡柱(未加MWCNTs修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例7一種去氧瓜萎鐮菌醇檢測的分子印跡柱制備方法，包括以下步驟(1)選擇能與去氧瓜萎鐮菌醇合成分子印跡聚合物的功能單體4-乙烯基吡啶(4-VP);(2)納米金溶液的制備取50mL0.0P/。HAuCl4加熱至沸騰，迅速加入1mL1%擰檬酸鈉溶液還原，所制備亮玫紅色即納米金溶液，放入4"C冰箱保存備用；(3)取制備好的納米金溶液2(^1，超聲50min，得到均勻分散的納米金溶液；(4)按摩爾比0.2:i:2:50:0.12:18稱取模板分子去氧瓜萎鐮菌醇，功能單體4-乙烯基吡啶(4-VP)，交聯劑季戊四醇三丙烯酸酯，致孔劑N，N-二甲基酰胺，引發劑偶氮二異丁腈，有機溶劑二氯甲烷，混合均勻，得到去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡聚合物溶液；(5)選用長度為5cm，直徑為3mm的玻璃管柱，分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干，保證玻璃管柱內表面光亮無雜質；(6)如圖1所示將納米金溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將納米金溶液排出，在室溫下干燥10min，再將去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min，直至把這一層中的模版分子去氧瓜萎鐮菌醇完全洗掉，在室溫下干燥10min，再將納米金溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將納米金溶液排出，室溫下干燥10min，再將去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，10min后將去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面25min，直至把這一層中的模版分子去氧瓜萎鐮菌醇完全洗掉，在室溫下干燥10min。如此循環，重復上述過程7次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH6.8的擰檬酸-磷酸緩沖液中，保存在4'C的冰箱中過夜，以便除去玻璃管柱內表面過量的去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡聚合物，當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后，制備成功納米增效去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡柱。將制備成功的納米增效去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡柱連接到化學發光分析儀，采用碘酸鈉(Nal04)作氧化劑的化學發光體系，將NaI04-H202溶液與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，對樣品中的赭曲霉素A進行檢測，結果見表7。利用上述同樣方法，但玻璃管柱內表面未修飾納米金，制備去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡柱，連接到化學發光分析儀，對樣品中的去氧瓜萎鐮菌醇進行檢測，結果見表7。表7本發明去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡柱與普通去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡柱檢測效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>從表7中結果可以看出納米金修飾的去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡柱比普通去氧瓜萎鐮菌醇分子印跡柱(未加納米金修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。實施例8一種毛菌素檢測的分子印跡柱制備方法.包括以下步驟(1)選擇能與毛菌素合成分子印跡聚合物的功能單體丙烯酸；(2)碳納米管溶液的制備在超聲攪拌的條件下，將2mgMWCNTs加入到lml二甲基亞砜溶液中，從而獲得黑色懸濁液即MWCNTs溶液；(3)取制備好的MWCNTs溶液2(Hi1,超聲60min，得到均勻分散的MWCNTs溶液；(4)按摩爾比0.5:i:3:45:o.i:2.2稱取模板分子毛菌素，功能單體丙烯酸，交聯劑乙二醇二甲基丙烯酸酯，致孔劑四氯化碳，引發劑偶氮二異丁腈，有機溶劑二氯甲烷，混合均勻，得到毛菌素分子印跡聚合物溶液；(5)選用長度為5cm,直徑為3mm的玻璃管柱，分別用1mol/LHN03和1mol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干，保證玻璃管柱內表面光亮無雜質；(6)如圖1所示將MWCNTs溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將MWCNTs溶液排出，在室溫下干燥10min，再將毛菌素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將毛菌素分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min，直至把這一層中的模版分子毛菌素完全洗掉，在室溫下干燥10min,再將MWCNTs溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將MWCNTs溶液排出，室溫下干燥10min，再將毛菌素分子印跡聚合物溶液注入玻璃管柱中填滿，將玻璃管柱兩端封閉，5min后將毛菌素分子印跡聚合物溶液排出，用甲醇和乙酸混合液洗脫玻璃管柱內表面20min,直至把這一層中的模版分子毛菌素完全洗掉，在室溫下干燥10min。如此循環，重復上述過程5次。(7)將上述玻璃管柱浸入到pH6.8的檸檬酸-磷酸緩沖液中，保存在4"C的冰箱中過夜，以便除去玻璃管柱內表面過量的毛菌素分子印跡聚合物，當玻璃管柱內表面用去離子水徹底清洗以后，制備成功納米增效毛菌素分子印跡柱。將制備成功的納米增效毛菌素分子印跡柱連接到化學發光分析儀，采用次氯酸鈉(NaClO)化學發光體系，將異煙肼-NaClO溶液與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，對樣品中的赭曲霉素A進行檢測，結果見表8。利用上述同樣方法，但玻璃管柱內表面未修飾MWCNTs,制備毛菌素分子印跡柱，連接到化學發光分析儀，對樣品中的毛菌素進行檢測，結果見表8。表8本發明MWCNTs增效毛菌素分子印跡柱與普通毛菌素分子印跡柱檢測效果對比<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>從表8中結果可以看出MWCNTs修飾的毛菌素分子印跡柱比普通毛菌素分子印跡柱(未加MWCNTs修飾)具有更快的響應時間、更寬的線性范圍、更高的靈敏度和更低的檢測限。權利要求1.一種痕量真菌毒素分子印跡柱制備方法，其特征是包括以下步驟(1)選擇能與真菌毒素合成分子印跡聚合物的功能單體；(2)按一定摩爾比將真菌毒素模板分子、功能單體、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶劑混合均勻制成分子印跡聚合物溶液；(3)利用納米材料，按照現有方法制備出納米溶液；(4)利用表面修飾技術，將納米材料和分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面上。2.根據權利要求1所述制備方法，其特征是所述真菌毒素模板分子、功能單體、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶劑的摩爾比為o.ii:i:0.36:2565:o.oi0.15:1.025。3.根據權利要求1所述制備方法，其特征是所述納米材料和分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面包括以下步驟(1)選用長度為5-10cm，直徑為2-10ram的玻璃管柱，分別用1mol/LHN03和lmol/LNaOH清洗，然后用雙蒸水徹底清洗數次，吹干；(2)將制備的納米溶液超聲處理20-60min，得到分散的納米溶液；(3)將分散的納米溶液注入玻璃管柱內，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，浸泡5-10min，排出管內的納米溶液，將玻璃管柱在室溫下晾干；(4)將步驟(3)中晾干的玻璃管柱中再注入分子印跡聚合物溶液，填滿，將玻璃管柱兩端封閉，浸泡5-10min，然后將玻璃管柱中的分子印跡聚合物溶液排出，用洗脫劑洗脫20-30min，在室溫下干燥5-10min;(5)重復步驟(3)和步驟(4)過程4-7次，制得所述分子印跡柱。4.根據權利要求3所述制備方法，其特征是還包括以下步驟將分子印跡柱浸入pH6.8-7.2緩沖液中，保存在4'C冰箱中，24h后使用。5.根據權利要求l所述制備方法，其特征是所述納米溶液為碳納米管溶液、納米金溶液或納米鉑溶液。6.根據權利要求3所述制備方法，其特征是所述洗脫劑為乙腈、水、甲醇和乙酸混合液或乙腈和乙酸混合液。7.根據權利要求4所述制備方法，其特征是所述緩沖液為檸檬酸-磷酸。8.根據權利要求1或2所述制備方法，其特征是所述功能單體為丙烯酸、甲基丙烯酸或4-乙烯基吡啶；所述交聯劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、N、N-亞甲基二丙烯酰胺、3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或季戊四醇三丙烯酸酯；所述引發劑為偶氮二異丁腈；所述致孔劑采用二氯甲烷、氯仿、乙腈、甲醇、異丙醇、四氯化碳、N,N-二甲基酰胺或二甲基亞砜；所述有機溶劑為二氯甲垸或四氯化碳。9.一種檢測痕量真菌毒素的方法，其特征是包括如下步驟將按上述任意一種方法制得的分子印跡柱連接到化學發光分析儀，將化學發光體系溶液與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，對樣品中的真菌毒素進行檢測。10.根據權利要求9所述檢測痕量真菌毒素的方法，其特征是所述化學發光體系溶液為魯米諾溶液，光澤精溶液，N-溴代丁二酰亞胺溶液，Ce(IV)-SO-溶液，魯米諾-KMn04溶液，魯米諾-H202溶液，異煙肼-NaC10溶液，Nal04-H202溶液。全文摘要本發明公開了一種痕量真菌毒素分子印跡柱制備方法，包括以下步驟選擇功能單體；按一定摩爾比將真菌毒素模板分子、功能單體、交聯劑、致孔劑、引發劑和有機溶劑混合均勻制成分子印跡聚合物溶液；制備出納米溶液；將納米材料和分子印跡聚合物修飾到玻璃管柱內表面上。一種檢測痕量真菌毒素的方法，將化學發光體系溶液與樣品溶液分別泵入化學發光分析儀，對樣品中的真菌毒素進行檢測。本發明分子印跡柱的檢測靈敏度高和準確性高。本發明所得到的納米增效的痕量真菌毒素分子印跡柱連接到化學發光分析儀用于檢測真菌毒素，可以實現樣本中真菌毒素的高特異性、高靈敏度、快速檢測。文檔編號G01N30/50GK101308066SQ200810016699公開日2008年11月19日申請日期2008年6月12日優先權日2008年6月12日發明者于京華,何文興,劉月輝,葉春江,孫納新,宋曉妍,席志芳,瑾張,張麗娜,張桂香,朱元娜,強李,李殿香,李紅梅,楊新超,汪世華,軍王,王元秀,強矯,秦余香,葛慎光,裴梅山,黃加棟申請人:濟南大學