專利名稱：：一種檢測還原糖濃度的電化學方法一種檢測還原糖濃度的電化學方法所屬領域本發明涉及一種測定還原性單糖濃度的分析方法。技術背景還原糖是發酵、食品領域最基本的工業原料，還原糖快速、準確的測定對生產過程控制和食品質量檢驗具有重要的意義。還原糖的測定方法很多，目前工業生產中普遍采用的是費林試劑滴定法[2]。該方法要求在測定液沸騰狀態下滴定，操作不便，干擾因素多，人為誤差較大，給生產過程控制和產品質量檢驗帶來不便。儀器分析方法有液相色譜法、放射測定、氣質聯用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振等，由于操作條件要求高，樣品需經衍生或其它處理后才能測定，測定時間長，測定和維護成本較高等原因，不適于大批量杼品的糖類化合物含量檢測，在我國實際生產和科研領域一般不被采用。分光光度法可用于檢測蜂蜜中的還原糖，但對于渾濁和有不同顏色的樣品實用性則較差。國家知識產權局1997年2月12日公開了一項發明專利申請"電化學測量方法和儀器"(公開號CN1142867A)該申請釆用薄層電化學測量裝置，優選毛細填充裝置，進行電化學測定溶液中的還原糖含量，該發明專利方法所測定的還原糖含量在25mmo1約合0.45%以下并需要制作專用的分析裝置，難以推廣應用；2004年5月11日公開的一項發明專利申請"一種測定還原糖濃度的方法"，該申請方法是將樣品溶液與過量氯化四氮唑藍在pH為7.5—8.5條件下反應，反應液經脫水、振蕩下加入乙酸乙酯至沉淀物溶解，取上清液測定吸光度得出還原糖含量，該法測定還原糖最高為2.5pig/mL，此方法分析少驟繁多、費時長，尤其不適用于大量樣品分析。
發明內容本發明的目的是提供一種快速、準確、操作簡便的測定還原糖濃度的方法。本發明所提供的測定還原糖濃度的方法，包括如下步驟l)將樣品溶液與過量鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)和氫氧化鈉(NaOH)混勻80'C保溫1.0min，2)反應液冷卻至室溫后用Ag/AgCl參比電極、玻碳工作電極和Pt片輔助電極構成三電極系統，測定還原糖與K3Fe(CN)6反應生成的還原產物亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6)的氧化電流，據此測得還原糖含量。技術方案1實驗原理還原糖在堿性溶液中能將鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)還原為亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6)，以葡萄糖為例，其反應式為C6H1206-6K3Fe(CN)6十6KOH=(CHOH)4.(COOH)2+6K4Fe(CN)6+4H20在反應中K3Fe(CN)6過量，還原糖含量與生成的K4Fe(CN)6的濃度呈等摩爾關系，而K4Fe(CN)6是一種電化學氧化還原活性物質，當工作電極上加一定正電位，K4Fe(CN)6能夠被氧化牛.成K3Fe(CN)6。由于K4Fe(CN)6的氧化電流與還原糖濃度呈一定摩爾關系，因此可以根據測得的K4Fe(CN)6的氧化電流信號計算還原糖的含量。2測定電位的選擇移取lmL5.00mg/mL葡萄糖標準溶液于20mL具塞刻度試管中，加入K3Fe(CN)6和NaOH溶液，稀釋至20mL。水浴加熱反應1.0min，取出冷卻至室溫。將反應液置于100mL燒杯中，將Ag/AgCl參比電極、玻碳工作電極和Pt片輔助電極構成三電極系統，使用電化學分析儀的循環伏安分析程序記錄工作電極在0+0.45V間的循環伏安曲線，如圖1所示。由于K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6是一對可逆的氧化還原物質，所以此圖為溶液中過量的K3Fe(CN)6與反應生成的K4Fc(CN)fi共同在玻碳工作電極上反應產斗:的循環伏安圖。從圖上看出K4Fe(CN)6從十0.1VUv.Ag/AgCl)開始被氧化為K3Fe(CN)6，電位為+0.26V時氧化電流達到峰值。當用安培法測定K4Fe(CN)6的氧化電流時，工作電極的檢測電位必須設定為高于+0.26V的正電位，綜合考慮各項影響因素本研究選擇+0.4V為工作電極的檢測電位。3水浴加熱溫度和反應時間選擇目前國家標準中"鐵氰化鉀滴定法"檢測還原糖要求溶液在微沸狀態下進行滴定，而"鐵氰化鉀分光光度法"也需要還原糖與鐵氰化鉀在沸水浴中反應20min，對反應溫度和時間都有較高的要求。本實驗只需保證還原糖含量與K4Fe(CN)6的氧化電流有良好的線性關系，不必使反應完全進行，可以適當降低反應溫度、縮短反應時間。圖2是葡萄糖標準溶液與K3Fe(CN)6在IO(TC水浴中反應不同時間后測得的K4Fe(CN)6的氧化電流Z，可見0.5l.Omin電流大幅增加，l.Omin后電流增大幅度變小。圖3是葡萄糖溶液在不問溫度下反應l.Omin所測得的電流，由圖可見6080'C電流增加迅速，在8010(TC電流增加趨緩。通過實驗發現在不同反應溫度和時間條件下，葡萄糖濃度(1.008.00mg/20mL)與K4Fe(CN、的氧化電流均有很好的線性關系。綜上所述，本專利選擇還原糖與K3Fe(CN)6反應的水浴溫度為80°C,時間控制在l.Omin。有益效果l)本發明較目前與還原糖測定相關的專利中的測定溫度有較大幅度下降(從100'C沸騰降為8(TC保溫)，使得反應更加溫和、易于控制，為采用本專利技術后續開發還原糖分析儀器打下了堅實的基礎；2)提高了還原糖的分析速度，電極實際測定時間30秒，加上前處理也不超過4mm尤其適用于大量樣品的分機；3)本發明的方法學研究采用了三種以上的回收率測定樣品，均符合化學分析要求(上述專利中均只采用了一種回收率測定樣品)，表明本專利方法的抗T擾性能優于上述專利；4)本分析方法的線性范圍寬，還原糖濃度40.(Vg/20mL20.0mg/20mL范圍內有良好的線性關系，線性相關系數為0.9999;5)方法最低檢出限為2.0(^g/mL，分析靈敏度較高。圖1示玻碳工作電極在待測溶液中的循環伏安曲線；圖2示K4Fe(CN)6的氧化電流與不同反應吋間的關系，其中葡萄糖溶液濃度3.00mg/20mL;反應溫度IOO'C;反應時間0.5、1.0、1.5、2.0min;圖3示K4h'e(CN)fi的氧化電流與不同反應溫度的關系，其中葡萄糖溶液濃度3.00mg/20mL;反應時間l.Omin;反應溫度60、70、80、卯、100。C;圖4示K4Fe(CN)6氧化反應的W曲線；圖5示葡萄糖標準溶液工作曲線。具體實施方式實施例1電化學安培法測定橙汁、馬鈴薯粉、味精發酵液、糖化液中還原糖含量1儀器與試劑CHI614c電化學分析儀(上海辰華儀器公司)，HH-S恒溫水浴鍋(江蘇國勝實驗儀器廠)，電化學三電極體系由Ag/AgCl參比電極(lmol/LKCl)、玻碳工作電極(直徑4mm)和Pt片輔助電極組成。5.00mg/mL葡萄糖標準溶液，4.00%K3Fe(CN)6溶液，10.0。/。NaOH溶液，所用試劑均為分析純。2樣品溶液的配制橙汁樣液取10.0mL橙汁飲料(市售某品牌)至50mL容量瓶，加蒸餾水定容。配制成稀釋5倍的橙汁待測液。馬鈴薯粉待測樣液稱取某廠家的馬鈴薯全粉2.00g于10mL水中，攪拌溶解30min，離心后取上清液。發酵液取5.00mL山東濟寧市菱花集團味精發酵液上清液至10mL容量瓶，加蒸餾水定容。配制成稀釋2倍的發酵液待測液。糖化液將山東魯洲集團提供的7份糖化液(1#7#)離心后取上清液，分別按照1:15、1:15、1:20、1:20、1:20、1:30、l:40的比例稀釋，配制成待測液。3葡萄糖標準溶液工作曲線的繪制分別取O、0.2、0.5、1、2、3、4mL5.00mg/mL葡萄糖標準溶液于20mL具塞刻度試管中，加入8mL4.00%K3Fe(CN)6和2.5mL10.0%NaOH溶液，用蒸餾水稀釋至20mL，混勻。將試管置于80'C水浴中反應1.0min，取出冷卻至室溫。將反應液分別倒入100mL燒杯中，進行電化學安培法檢測。將Ag/AgCl參比電極、玻碳工作電極和Pt片輔助電極置于盛有待測液的燒杯中，分別與CHI614c電化學分析儀對應的電極夾相連。選擇儀器軟件中的安培技術進行檢測，恒定工作電極電位0.4V，記錄K4Fe(CN)6被氧化的電流-時間曲線，如圖4所示。取30s時的穩定電流/，繪制電流-葡萄糖濃度(!'-C)工作曲線。4樣品的測定分別取lmL配制好的橙汁、發酵液、糖化液和馬鈴薯粉待測樣液于20mL具塞刻度試管中，以下操作同標準工作曲線的繪制。將W曲線中30s時的穩定電流/數值代入工作曲線，從而計算出待測樣液中還原糖的百分含量(以葡萄糖計)。5線性范圍及最低檢出限圖5是由020.0mg/20mL葡萄糖標準溶液繪制的標準工作曲線，線性回歸方程為,=1.1641+4.388C。！'為K4Fe(CN)6的穩定氧化電流(pA)，C為還原糖濃度(mg/20mL)，相關系數r=0.9999。可見此體系還原糖濃度在40.0ng/20mL20.0mg/20mL范圍內，與IQFe(CN)6的氧化電流之間有良好的線性關系。該方法的最低檢出限為2.00pg/mL。6精密度試驗取5.00mg/mL葡萄糖標準溶液LOmL連續測定7次，方法同"樣品的測定"，由所測得的K4Fe(CN)6氧化電流Z計算出對應的葡萄糖濃度，結果見表1表1精密度試驗(n=9)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上表計算得相對標準偏差(RSD)為0.841%,可見此方法的精密度良好。7樣品的測定及加樣回收試驗按照"樣品的測定"方法檢測四種待測杼，并在被測樣品中加入己知含量的葡萄糖溶液，進行不同樣品的回收試驗，結果見表2。表2加樣回收試驗(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>*:三次測定結果的均值結果表明，該檢測方法測定不同類型樣品的回收率在98.0102.0%之間，說明此種分析方法抗干擾性能良好，能滿足測定不同類型樣品的需要。8對比測定試驗對按照"樣品溶液的配制"方法配制的山東魯洲集團提供的1#7#糖化液的稀釋待測液進行電化學安培法測定，同時用常規斐林氏法進行對比，結果見表3。表3對比試驗測定結果mg/20mL(n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>t檢驗，P>0.05表明兩種分析方法無顯著差異。權利要求1.一種測定還原糖濃度的方法，包括如下步驟1)將樣品溶液與過量鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)與氫氧化鉀(KOH)溶液混勻后在80℃水浴中反應1min；2)反應液經冷卻后置燒杯中，用Ag/AgCL參比電極、玻碳工作電極和Pt片輔助電極構成的三電極系統進行測定。2.根據權利要求l所述方法，其特征在于步驟l)所述是將反應液加熱至80。C反應1.Omin:。3.根據權利要求l所述方法，其特征在于步驟2)所述反應液應冷卻至室溫再進行測定。4.根據權利要求13所述方法，其特征在于步驟2)所述三電極測定系統中工作電極的檢測電位設定為+O.45V。全文摘要本發明涉及一種測定還原糖濃度的電化學分析方法，屬生物電化學領域，具體方法是將樣品溶液與鐵氰化鉀與氫氧化鉀溶液在80℃水浴中反應1min，反應液經冷卻后用電化學安培法檢測。本發明方法操作簡便、反應條件溫和易于控制、分析靈敏度高、分析速度快、抗干擾能力強，可廣泛應用于各種樣品中還原糖的測定。文檔編號G01N27/416GK101231261SQ20081001417公開日2008年7月30日申請日期2008年2月20日優先權日2008年2月20日發明者史建國,孫士青,孟慶軍,張利群,李雪梅,艷楊,楊俊慧,王丙蓮,趙曉華,馬耀宏申請人:山東省科學院生物研究所