專利名稱：：一種檢測土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法
技術領域：
：本發明涉及土壤中芳基硫酸酯酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法。
背景技術：
：土壤中的芳基硫酸酯酶能將在土壤硫代謝過程中形成的有機硫酸酯酯水解成硫酸鹽，參與有機硫的釋硫過程，成為可被微生物和作物利用的有效態。在pH4—9的土壤中均有芳基硫酸酯酶，多以積累態存在。芳基硫酸酯酶可水解對硝基苯磷酸鹽，通過比色法測定反應后釋放的對硝基苯酚的含量，來估算芳基硫酸酯酶的活性。R-P-S03-+H20芳基硫酸酯酉lR—OH+H++SO,土壤中芳基硫酸酯酶活性的強弱影響到土壤硫代謝過程中硫素營養的大小，間接影響硫肥的利用效率。土壤芳基硫酸酯酶對土壤硫素的有效性具有重要作用，可以表征土壤有機硫酸酯的轉化方向和強度。土壤中芳基硫酸酯酶的活性受土壤條件如水分、溫度、土壤質地等的強烈影響，同時也受農田耕作制度、管理措施以及不同作物的影響。因此，對土壤中芳基硫酸酯酶活性的檢驗具有重要的意義。目前有關芳基硫酸酯酶活性的測定雖然已經形成一個相對可靠的方法，但仍然具有一定的缺陷，造成不同土壤類型測定的差異性，以及不同培養批次的差異性和不確定性，難以定性比較和定量研究土壤中芳基硫酸酯酶活性，降低了實驗效率。
發明內容本發明的目的在于提供一種土壤中芳基硫酸酯酶活性的檢測方法。在借鑒其它酶測定方法原理的基礎上，本發明方法根據芳基硫酸酯酶的特性，對其測定歩驟和顯色方法進行改進。該方法減少了試驗步驟的不穩定性，使分析結果更加精確可靠，分析重現性更好。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為一種檢測土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法，1)分別稱取lg-2g鮮土樣品2n份分別置于2n個三角瓶中，論3，一分成二組，每組n個，向2n個三角瓶中加入4-8mLpH=5.75-5.85乙酸緩沖溶液，向第一組n個三角瓶中加入1-2mL25-50mmoL.L"的底物對硝基苯硫酸鉀工作液，第二組n個三角瓶作底物試劑對照，混勻，蓋好瓶塞，放在36.5"C-37.5。C恒溫培養中恒溫培養1-2h;2)培養結束后，加入4-8mL0.49-0.51moL.L-'堿性三THAM(羥基氨基甲烷)溶液和1-2mL0.49-0.51moL.L"氯化鈣溶液，并向第二組三角瓶中加入1-2mL25-50mmoLL"的底物對硝基苯硫酸鉀工作液，混勻，過濾；所述的堿性THAM溶液是用來終止酶促反應并加以顯色，抑制對硝基苯硫酸酯到對硝基苯酚和硫酸根的反應，且不會產生強堿對土壤有機質的分解作用而對產物測定產生顏色干擾，同時避免測定過程中產生碳酸鈣沉、)*而具；M向、)則*i芻壬n〉你7T傷，A1_IIIJ'JiX"|%|i;/、'J/4_UJ'l;。、A(^。HIpnH乂IJo3)用分光光度法于410nm處分別測定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A;以對硝基苯酚溶液標準溶液，以對硝基苯酚溶液的系列濃度和其分別用分光光度法在410nm測定的吸光值A，制作工作標準曲線，得到斜率b;根據吸光值A和斜率b，計算所測定濾液中對硝基苯酚的濃度S，S=A*b;計算樣品中對硝基苯酚含量mn4)計算磷酸單酯酶酶活性計算公式為:w二m"(m2xK)=S嗎C6H5N03.g-1干土.h"式中W:單位土壤單位時間內對硝基苯船的產生量；m1:測試溶液中對硝基苯酚的質量，樣品測定吸光值折換的產物質量值；m2:鮮土樣品質量；k:水分系數，烘干土的重量/鮮土重。用分光光度計于410nm處測定吸光度A時，先觀察待測液顏色，當步驟3)中所述的待測液顏色明顯超過制作標準曲線最高濃度時的顏色，表明其中對硝基苯酚含量過高，則用原緩沖溶液稀釋5-10倍后再進行比色，若顏色還是過深，則重復上述稀釋過程；最終再用分光光度法于410nm處測定溶液的吸光度A。所述制作工作標準曲線過程為，稱取IOOOmg對硝基苯酚溶解于lL蒸餾水中，制備1mgmL—1標準貯備液；吸取標準貯備液1mL，定容到100mL，此為0.01mg.mL"對硝基苯酚的溶液；再分別吸取該液0、1、2、3、4、5mL于試管中，用蒸餾水分別補足到相同體積5mL，加入4mL0.1moL'L"堿性三羥基氨基甲烷溶液和lmL0.5moL.L"氯化鈣溶液，顯色、混勻，過濾到比色試管中，與樣品一起在410nm測定吸光度A，；此標準系列含對硝基苯酚的濃度分別為0、1、2，3、4禾Q5|ig'mL"(量為0，10，20，30、40和50嗎)。以對硝基苯酚溶液的系列濃度和測定的吸光值A'制作工作標準曲線，得到斜率b。本發明方法改進的依據土壤中的芳基硫酸酯酶是參與土壤中有機硫酸酯脫硫到生成硫酸根過程的一切酶的總稱，在測定過程中分解底物對硝基苯硫酸鉀生成對硝基苯酚，需要加入氫氧化鈉和氯化鈣終止反應并顯色。一定濃度的氫氧化鈉加入土壤溶液中會造成土壤有機質分解，生成產物呈褐色，在一定程度上影響比色結果。本試驗中添加堿性三羥基氨基甲垸溶液即可避免土壤有機質分解，減少顏色干擾；同時避免碳酸鈣沉淀的生成影響測定的準確與穩定。本發明所使用的測定原理為土壤中的芳基硫酸酯酶與對硝基苯硫酸酯反應，釋放對硝基苯酚，通過測定單位時間內生成產物的含量，來估計土壤芳基硫酸酯酶的活性。因此，本試驗擬通過反應后對硝基苯酚C6H5N03的生成量來表征土壤芳基硫酸酯酶活性。與其它酶的分析方法相比較，本發明的優點主要有1)所需設備簡單、降低了試驗成本。本發明中的培養試驗是在50mL的三角瓶中進行。2)所使用的方法顯色簡單，提高了樣品測定的準確度。3)操作簡單，減少操作過程的復雜性；分析結果穩定可靠，重現性好。該酶的其它測定方法中需要設置滅菌土壤作為對照，本方法只需要不加底物的樣品對照。同時，由于本發明所涉及到的顯色步驟減少了土壤有機質堿解形成的顏色對測定結果的影響而導致不確定性，故分析結果重現性非常良好。具體實施例方式試劑配制1)對硝基苯硫酸鉀溶液(0.05mol'L—1):稱取0.9303g六水對硝基苯硫酸鉀兩份分別溶于40mL乙酸緩沖溶液，然后用同一種緩沖溶液稀釋至50mL，低溫!亡存備用。2)乙酸緩沖溶液(pH5.8):稱取68g三水乙酸鈉溶于700mL水中，然后加入1.70mL的冰乙酸(99%)，用水稀釋到1L，備用。3)0.5molL—"CaCl2溶液稱取73.5gCaCl2.2H20溶解于700mL水中，用水定容到1L。4)THAM堿性溶液(0.1mol丄人pH12):溶解12.2g三羥甲基氨基甲烷(THAM)于800mL蒸餾水中，用0.5molL—1的NaOH調節pH至12.0，用蒸餾水定容到lOOOmL。5)對硝基苯酚標準溶液溶解1.000g對硝基苯酚于700mL水中，稀釋至1L，放于4^冰箱低溫保存，保存時間不宜過長，以不超過數周為操作步驟1)分別稱取1.2g鮮土樣品12份分別置入12個50mL三角瓶中，向12個三角瓶中加入4ml緩沖溶液作試劑，向第一組6個三角瓶中加入1mL50mmoL.I/1的底物對硝基苯硫酸鉀工作液，第二組6個三角瓶作底物試劑對照，混勻，蓋好瓶塞，放在37'C恒溫培養中恒溫培養lh;2)培養結束后，加入4mL0.1moL'L"堿性THAM(三羥基氨基甲烷)溶液和1mL0.5moL.L"氯化鈣溶液，并向對照組三角瓶中加入1mL50mmoL，L—'的底物對硝基苯硫酸鉀工作液，混勻，過濾；3)用分光光度法于410nm處測定吸光度A，如待測液顏色明顯超過標準曲線最高濃度顏色，表明其中對硝基苯酚含量過高，則用原緩沖液稀釋5倍后再進行比色；4)制作工作標準曲線稱取1000mg對硝基苯酚溶解于1L蒸餾水中，制備標準貯備液。吸取標準貯備液1mL，定容到100mL，此為0.01mgmL—1對硝基苯酚的溶液。再分別吸取該液0、1、2、3、4、5mL于試管中，用^fer々切-D丄口sn士H&1乂士$門c,t+n"X/it;;eI"W^::y:乂—Nit:每lit:m丄々、、,*、、,*■/ac沾々H5/J、一[TAC;t'J'rHIWK十、1SJlllL，乂JH/、4，凡l工_^一工巫突、巫「廠WUtH"Y'DC、wjmoL-L")禾卩l-5mL氯化轉(0.5moL-I/1)溶液，顯色、混勻，過濾到比色試管中，與樣品一起在410nm處測定吸光度A'。此標準系列含對硝基苯酚的量分別為0、1、2，3、4和5昭.mL"(量為0，10，20，30、40和50嗎)，以對硝基苯酚溶液的系列濃度和測定的吸光值A'制作工作標準曲線，得到斜率b。5)根據吸光值A和斜率b，計算所測定濾液中對硝基苯酚的濃度S(S=A*b);計算樣品中對硝基苯酚含量m,;計算芳基硫酸酯酶酶活性計算公式為w二m"(m2xK)=嗎C6H5N03'g—'干土'h"實施例1木實施例所使用的黑土采自中國科學院海倫生態試驗站，設三個不同的處理l號為對照，即不經過任何添加劑的處理的土壤在25"C培養48h以上的普通土壤；2號為添加土壤調理劑還原型谷胱甘肽且在25'C培養48h以上的土壤；3號為添加土壤調理劑腐殖酸且在25t:培養48h以上的土壤。土壤含水量均為20%(烘干土重)。2號和3號土壤中，調理劑的添加量是土壤重量的0.4%，用上述方法檢測三種處理的芳基硫酸酯酶活性。每種土壤的具體分析歩驟如下1)分別稱取1.2g鮮土樣品12份分別置入12個50mL三角瓶，向二組6個三角瓶中加入緩沖溶液，向第一組6個三角瓶中加入1mL50mmoL'L—'的底物對硝基苯硫酸鉀工作液，第二組6個三角瓶作底物試劑對照，混勻，蓋好瓶塞，放在37'C恒溫培養中恒溫培養lh;2)培養結束后，向所有三角瓶中加入4mL0.1moL'L-1堿性三羥基氨基甲烷溶液和1mL0.5moL.L"氯化鈣溶液，并向第二組三角瓶中加入1mL50mmoL'L"的底物對硝基苯硫酸鉀工作液，混勻，過濾；3)用分光光度法于410nm處測定吸光度A，如待測液中對硝基苯酚含量過高，則用原緩沖液稀釋后再進行比色；4)制作工作標準曲線稱取1000mg對硝基苯酚溶解于蒸餾水中，制備標準貯備液。吸取標準貯備液1mL，定容到100mL，此為0.01mgmL—1對硝基苯酚的溶液。再分別吸取該液O、1、2、3、4、5mL于試管中，用蒸餾水補足到相同體積5mL，加入4mL堿性三羥基氨基甲烷溶液(0.1moL.L")禾n1mL氯化轉(0.5moL.L-')溶液，顯色，混勻，過濾到比色試管中，與樣品一起在410nm處測定吸光度A'。此標準系列含對硝基苯酚的量分別為0、1、2，3、4禾卩5pg'm!/1(量為0，10，20，30、40和50|ig)，以對硝基苯酚溶液的系列濃度和測定的吸光值A，制作工作標準曲線，得到斜率b。5)根據吸光值A和斜率b，計算所測定濾液中對硝基苯酚的濃度S(S=A*b);計算樣品中對硝基苯酚含量m1;r^丄L/^rsfiti3Sfe、、,=C,kUu乂w^r-夕7巫別L股曰日日g:日g^tvi:土試驗結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表中數據可以看出，各處理之間結果差異達到顯著水平，較小的標準差值表明該分析方法結果之間的偏差較小，精確度較高，重現性好。且待測定液體放置l一3小時沒有沉淀產生，保證了測定的穩定性。實施例2本實施例所使用的三種不同種植作物的潮棕壤均采自中國科學院沈陽生態實驗站其中4號土壤前茬作物為水稻，5號土壤前茬作物為玉米，6號土壤前茬作物為大豆。三種不同耕作制度的土壤均在含水量為20%(烘干土重)，在溫度25。C條件下培養24h以上，測定其芳基硫酸酯酶活性，具體步驟同實例1。試驗結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表屮數據同樣顯示了分析結果的穩定性及較高的精密度。且待測定液體放置l一3小吋沒有沉淀產生，保證了測定的穩定性。木發明優點為l)簡化了操作歩驟，減少了實驗過程中的不確定性；2)減少對設備要求的依賴性；3)方法準確度高，易操作；4)結果穩定可靠，重現性好。權利要求1.一種檢測土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法，其特征在于1)分別稱取1g-2g鮮土樣品2n份分別置于2n個三角瓶中，n≥3，分成二組，每組n個，向2n個三角瓶中加入4-8mLpH＝5.75-5.85乙酸緩沖溶液，向第一組n個三角瓶中加入1-2mL25-50mmoL·L-1的底物對硝基苯硫酸鉀工作液，第二組n個三角瓶作底物試劑對照，混勻，蓋好瓶塞，放在36.5-37.5℃恒溫培養中恒溫培養1-2h；2)培養結束后，加入4-8mL0.49-0.51moL·L-1堿性THAM(三羥基氨基甲烷)溶液和1-2mL0.49-0.51moL·L-1氯化鈣溶液，并向第二組三角瓶中加入1-2mL25-50mmoL·L-1的底物對硝基苯硫酸鉀工作液，混勻，過濾；3)用分光光度法于410nm處分別測定上述所得三角瓶中溶液的吸光度A；以對硝基苯酚溶液標準溶液，以對硝基苯酚溶液的系列濃度和其分別用分光光度法在410nm測定的吸光值A’制作工作標準曲線，得到斜率b；根據吸光值A和斜率b，計算所測定濾液中對硝基苯酚的濃度S，S＝A*b；計算樣品中對硝基苯酚含量m1；4)計算磷酸單酯酶酶活性計算公式為w＝m1/(m2×K)＝SμgC6H5NO3·g-1干土·h-1式中w單位土壤單位時間內對硝基苯酚的產生量；m1測試溶液中對硝基苯酚的質量，樣品測定吸光值折換的產物質量值；m2鮮土樣品質量；k水分系數，單位重量的烘干土重/鮮土重。2.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于用分光光度計于410nm處測定吸光度A時，先觀察待測液顏色，當步驟3)中所述的待測液顏色明顯超過制作標準曲線最高濃度時的顏色，表明其中對硝基苯酚含量過高，則用原緩沖溶液稀釋5-10倍后進行比色；若稀釋后顏色還是過深，則重復上述稀釋過程；最終再用分光光度法于410nm處測定溶液的吸光度A。3.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于所述制作工作標準曲線過程為，稱取1000mg對硝基苯酚溶解于1L蒸餾水中，制備1mgmL—1標準貯備液；吸取標準貯備液1mL，定容到100mL，此為0.01mg.mL—'對硝基苯酚的溶液；再分別吸取該液0、1、2、3、4、5mL于試管中，用蒸餾水分別補足到相同體積5mL，加入4mL0.1moL.L"堿性THAM(三羥基氨基甲垸)溶液和lmL0.5moL'L—'氯化鈣溶液，顯色、混勻，過濾到比色試管中，與樣品一起在410nm測定吸光度A，；此標準系列含對硝基苯酚的濃度分別為0、1、2，3、4和5嗎toL—'。以對硝基苯酚溶液的系列含量和測定的吸光值A'制作工作標準曲線，得到斜率b。4.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于所述反應終止液為7>-:1':1"-TT1ATV/TA邁、/■+!、、,？t——"■￥義廿fe"甘P口，ki."T-TZ^lftl畫,lzl+lH/i義.i土丄n/\ivi么友門？廿？i義，亇小axi厶zg二大i巫安、巫T'wriJouuiiil-紫k甶/j、卜r'，用0.5mol.L"的NaOH調節pH至12.0，用蒸餾水定容到1000mL。全文摘要本發明涉及一種檢測土壤中芳基硫酸酯酶活性的分析方法1)分別稱取土樣置于2n個三角瓶中，向三角瓶中加入4ml緩沖溶液，向第一組n個三角瓶中加入1ml底物對硝基苯硫酸鉀溶液，第二組n個三角瓶作為對照組，搖勻，蓋好瓶塞后恒溫培養；2)培養結束后，向三角瓶中加入4ml堿性三羥基氨基甲烷溶液和1ml氯化鈣溶液終止反應并顯色，并向第二組對照組加入1ml底物溶液，混勻，過濾；3)在410nm處比色測定濾液的吸光度值A；4)根據標準曲線計算對硝基苯酚含量，進而計算芳基硫酸酯酶酶活性。本發明簡化了操作步驟，減少了實驗過程中的不確定性；減少對設備要求的依賴性；方法準確度高，易操作；結果穩定可靠，重現性好。文檔編號G01N21/31GK101625310SQ20081001224公開日2010年1月13日申請日期2008年7月9日優先權日2008年7月9日發明者張玉蘭,武志杰,陳利軍,陳振華申請人:中國科學院沈陽應用生態研究所