專利名稱：：一種檢測土壤纖維素酶活性的分析方法
技術領域：
：本發明涉及土壤中纖維素酶活性的測定，具體地說是一種檢測土壤中纖維素酶活性的分析方法。
背景技術：
：進入和累積在土壤中的碳水化合物是在土壤糖酶的作用下參與碳素循環的，纖維素和半纖維素是構成碳水化合物的主要種類，纖維素至其單體-葡萄糖的水解，是在纖維素酶復合體的多酶系統的不同酶的作用下，經若干階段進行的。土壤中的纖維素酶復合體由四種糖酶所組成1，4-P-葡聚糖內切酶、1，4-P-葡聚糖外切酶、1，4-卩-葡糖苷外切酶和纖維二糖酶。它們分別參與纖維素分解的不同階段。通常測得的土壤纖維素酶活性，是該種酶復合體的作用的總和。纖維素酶活性常常被用作指示土壤肥力的指標，因為它參與土壤有機質的分解，另外，纖維素酶的活性與腐殖質的含量間存在著相關性，在土壤纖維素的分解與腐殖質的形成間存在著一定的聯系。總的說來，土壤纖維素酶的活性反映了土壤形成的生物氣候及生態學條件、土壤生物化學過程的強度及土壤肥力水平。土壤纖維素酶活性受土壤條件、農田耕作制度、管理措施以及不同作物的影響，在進行土壤肥力評價時，常常需要測定在不同條件下的纖維素活性進行說明，因此，建立一種相對快速準確的纖維素酶活性的檢測方法具有很重要的意義。有關土壤纖維素酶活性的測定基本都是參照周禮愷在1984年所著《土壤酶學》一書中的方法(該方法譯自Pancholy和Rice在1973年發表于SoilScienceSocietyofAmericanProceedings中的方法)。該種方法步驟繁瑣，且顯色物質不穩定，測定重現性較差，而后Schinner和vanMersi在1996年所著的專著MethodsinSoilBiology中對測定方法進行了改進，顯色物質較穩定，重現性較好，但同樣地，其測定過程比較復雜，所耗時間較長，且在顯色過程中所需試劑氰化鉀為劇毒試劑，難以獲得，并增加了在測定過程中的對操作人員的危險性。
發明內容本發明的目的在于提供一種檢驗土壤中纖維素酶活性的分析方法。該方法是在借鑒前人測定方法的原理基礎上，對纖維素酶活性的測定步驟和終產物的檢測方法進行了改進，從而減少樣品處理和試驗步驟的復雜性，使分析結果更加精確可靠，分析重現性更好。其原理為使用熒光共軛物質作為測定底物，通過酶解產生熒光物質，通過多功能酶標儀對此產物進行熒光檢測，進而計算出參與此反應的纖維素酶活性。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為1)以已知系列濃度的MUB溶液為標準物，采用酶標儀進行熒光檢測，發射光波長365nm，測定光波長470nm;作為測定的標準曲線；以MUB標準溶液的系列濃度和測定的吸光值A、制作工作標準曲線，得到斜率b;2)分別稱取n份3-5g過l-2mm篩的土壤風干樣品于n支粗試管中，n^3，向各試管中加入30-50ml0.45-0.55mol.I/1pH5.0-6.0的醋酸緩沖溶液，使用微量進液槍在旋渦振蕩條件下從粗試管中取lOOpl土壤懸液加入微孔板中，占有n個微孔，向其中n-l個孔中加入10mM的底物溶液(4-MUB-7-(3-D-纖維二糖苷，MUB為熒光物質4-羥甲基-7-香豆素)100|il，另一孔中加入IOOW水作為無底物對照；向第n+l個孔中加入100^1底物溶液和lOOpl水作為無土壤對照；25。C-3(TC條件下振蕩培養2.5-3.5h;分別向孔內加入lOOpl2-2.5mol丄"NaOH終止反應；3)將微孔板置入多功能酶標儀進行熒光檢測，發射光波長365nm，測定光波長470nm;在多功能酶標儀上測定熒光度為A;4)根據吸光值A和斜率b，計算所測濾液中MUB的濃度S,S=A*b;5)根據MUB的量計算出酶活性；計算公式為x=(S*40)/(V*b*T)式中x為纖維素酶活性(單位pmolMUB，g"，h"),S為步驟4所獲得的熒光物質的濃度，V為反應體系內的溶液總體積(單位ml)，b為稱取的土壤重量(單位g)，T為培養時間(單位h)。所述標準曲線的制作及測定過程如下，①配制0.5moH/1pH5.5醋酸緩沖液；②應用0.5mol'L"pH5.5醋酸緩沖液配制濃度為0，0.01，0.05，0.1，0.25，和1.0mol.L"MUB標準液，配制方法稱取MUBO，0.176，0.881，1.762，4.404和1.762g定容至100ml,搖勻即可，此液需當日配制；③向微孔中加入lOOpl此系列溶液和100^1水，lOO^il2-2.5mol丄"NaOH后進行熒光測定；此系列溶液中含有MUBO，0.1，0.5，1.0，2.5，lO,ol;④標準曲線每個點3-5次重復；⑤根據已知濃度的MUB量及通過熒光檢測數據得到工作標準曲線。本發明使用熒光共軛物質4-MUB-7-(3-D-纖維二糖苷作為測定底物，此物質被酶水解后產生熒光物質MUB，MUB在365nm處激發，在470nm處會檢測到熒光，此種底物的使用是此測試方法改進的關鍵。所述微孔板通常為96微孔板，使用96微孔板作為反應體系承載物，其應用使得大量土壤樣品的同時測定成為可能，提高檢測效率。本發明方法改進的依據土壤中的纖維素酶的測定結果是l，4-P-葡聚糖內切酶、1，4-P-葡聚糖外切酶、1，4-P-葡糖苷外切酶和纖維二糖酶的總稱，是由增值的和裂解的微生物細胞釋放出來、累積在土壤中的胞外酶，它們都參與土壤中纖維素的分解轉化過程。酶活性均是用底物的減少量和產物的生成量來進行表征，傳統分光光度法測定土壤纖維素酶活性是使用羧甲基纖維素鈉作為測定底物，酶解后的產物葡萄糖使用顯色劑顯色后通過分光光度計測定出其在690nm條件下的吸光度，此種方法所需測試時間較長(反應體系培養時間，酶解產物提取等)，操作較復雜，勞動量較大。而本改進方法依據的是一種熒光檢測手段，此檢測方法靈敏度高，對待測液的需求量較小，所以將反應體系(土壤懸液、底物及相應緩沖液)置于微孔板內進行即可，反應后在酶標儀上可同時獲得所有微孔內的熒光物質的量，另外，因土壤量及底物量較小，所以只需較短的培養時間即可完成反應，此法簡化操作步驟，大大提高測定效率。但與傳統方法相比同樣具有對儀器依賴性較大的缺點。與過去的分析方法相比較，本發明的優點主要有1)反應體系培養時間較短，培養后無需過濾或離心等提取步驟，直接加入終止劑進行終止反應后在多功能酶標儀上進行測定，且微孔內的熒光物質可在15s內同時獲得測定數據，允許大量樣品同時進行測定，提高工作效率；2')操作簡單，分析結果穩定可靠，重現性好；3)所需試劑品種減少，易獲得，測定過程無需劇毒試劑，提高測定過程的安全性。具體實施例方式試劑配制1.0.5mol丄"pH5.5醋酸緩沖液溶解41g無水乙酸鈉于蒸餾水中，定容至11;吸取60ml冰乙(醋)酸于500ml容量瓶中，用蒸餾水定容。將11無水乙(醋)酸鈉溶液和45ml冰乙(醋)酸稀釋液混合，用乙(醋)酸調節pH到5.5;2.10mmol丄"乙二醇甲醚溶液稱取0.98g乙二醇甲醚于11常量瓶中，用500ml水溶解后定容至刻度；3.lOmmol.I/1底物(4-MUB-P-D-纖維二糖苷)溶液0.5184g底物(4-MUB-P-D-纖維二糖苷)于100ml容量瓶中，用試劑2溶解并定容至刻度；4.2mo11/1NaOH溶液80gNaOH溶于800ml水中，轉移至11容量瓶中定容。操作步驟1)標準曲線的制作及測定過程如下，①配制0.5mol，L"pH5.5醋酸緩沖液；②應用0.5mol'L—ipH5.5醋酸緩沖液配制濃度為0，0.01，0.05，0.1，0.25，和1.0mol.L"MUB標準液，配制方法稱取MUBO，0.176，0.881，1.762，4.404禾B1.762g定容至100ml,搖勻即可，此液需當日配制；③向微孔中加入100^1此系列溶液和lOO(il水，100^12mol.L"NaOH后進行熒光測定；此系列溶液中含有MUB0，0.1，0.5，1.0，2.5，lO^imol;標準曲線每個點3次重復；(D根據已知濃度的MUB量及通過熒光檢測數據得到工作標準曲線。2)分別稱取n份3-5g過l-2mm篩的土壤風干樣品于n支粗試管中，n^，向各試管中加入30-50ml0.5mol丄"pH5.5的醋酸緩沖溶液，使用微量進液槍在旋渦振蕩條件下取100pl土壤懸液加入96微孔板(占有n個微孔)，向n-l個孔中加入10mmol丄"底物溶液(4-MUB-7-l3-D-木糖苷，MUB為熒光物質4-羥甲基-7-香豆素)100|il，另一孔中加入100nl水作為無底物對照，向第n+l個孔中加入100pl底物溶液和100Ml水作為無土壤對照；3(TC條件下振蕩培養3h;3)分別向孔內加入100^12moll/1NaOH終止反應；4)將微孔板置入多功能酶標儀進行熒光檢測，發射光波長365nm，測定光波長470nm;5)在多功能酶標儀上測定熒光度為A6)以MUB標準溶液的系列濃度和測定的吸光值A'制作工作標準曲線，得到斜率b;7)根據吸光值A和斜率b，計算所測濾液中MUB的濃度S,S=A*b;8)根據MUB的量計算出酶活性；計算公式為x=(S*40)/(V*b*T)式中x為纖維素酶活性(單位pmolMUB，g"七—1)，S為步驟6所獲得的熒光物質的量，V為反應體系內的溶液總體積(單位ml)，b為稱取的土壤重量(單位g)，T為培養時間(單位h)實施例1本實施例所使用的土壤采自江蘇省無錫市安鎮鎮年余農場G1。37'N，120。28，E)稻-麥輪作FACE(Free-airCarbonElevation開放式CCV濃度增高)系統平臺，平臺共有3個FACE試驗圈和5個對照圈，FACE試驗圈保持C02濃度比對照圈高200pmoLmol"。土壤類型為水耕人為土(俗稱黃泥土)。兩個處理即為C02濃度增高和對照，C02濃度增高處理3次重復，對照5次重復，在小麥生長的成熟期采樣并用上述方法檢測土壤纖維素酶活性。每種土壤的具體分析步驟如下1)分別稱取3份3g過2mm篩的土壤風干樣品于粗試管中，向各試管中加入40ml0.5mol，L/1pH5.5的醋酸緩沖溶液，使用微量進液槍在旋渦振蕩條件下取lOOpl土壤懸液加入微孔板(占有n個微孔)，向n-l個孔中加入10mmoll"底物溶液(4-MUB-(3-D-纖維二糖苷，MUB為熒光物質4-羥甲基-7-香豆素)lOOpl，另一孔中加入100nl水作為無底物對照，向第n+l個孔中加入100pl底物溶液和100pl水作為無土壤對照，3(TC條件下振蕩培養3h;2)分別向孔內加入lOOpl2mol丄"NaOH終止反應；3)將微孔板置入多功能酶標儀進行熒光檢測，發射光波長365nm，測定光波長470nm;4)在多功能酶標儀上測定熒光度為A5)以MUB標準溶液的系列濃度和測定的吸光值A、制作工作標準曲線，得到斜率b;6)根據吸光值A和斜率b，計算所測濾液中MUB的濃度S,S=A*b;7)根據MUB的量計算出酶活性；計算公式為x=(S*40)/(V*b*T)式中x為纖維素酶活性(單位pmolMUB，g"，h")，S為步驟6所獲得的熒光物質的量，V為反應體系內的溶液總體積(單位ml)，b為稱取的土壤重量(單位g)，T為培養時間(單位h)試驗結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表中數據可以看出，較小的標準差值表明該分析方法結果之間的偏差較小，精確度較高，重現性好。實施例2本實施例所使用的三種黑土均采于黑龍江省綏化市海倫縣處理1土壤為大豆連作，處理2土壤為水稻連作，處理3土壤為玉米連作。三種不同種植制度的土壤均過2mm篩后進行測定。具體步驟同實施例1。試驗結果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>權利要求1.一種檢測土壤中纖維素酶活性的分析方法，其特征在于1)以已知系列濃度的MUB溶液為標準物，采用酶標儀進行熒光檢測，發射光波長365nm，測定光波長470nm；作為測定的標準曲線；以MUB標準溶液的系列濃度和測定的吸光值A`制作工作標準曲線，得到斜率b；2)分別稱取n份3-5g過1-2mm篩的土壤風干樣品于n支粗試管中，n為≥3的正整數，向各試管中加入30-50ml0.45-0.55mol·L-1pH5.0-6.0的醋酸緩沖溶液，使用微量進液槍在旋渦振蕩條件下取100μl土壤懸液加入微孔板中，占有n個微孔，向n-1個孔中加入10mM4-MUB-β-D-纖維二糖苷100μl，另一孔中加入100μl水作為無底物對照，向第n+1個孔中加入100μl底物溶液和100μl水作為無土壤對照；25℃-30℃條件下振蕩培養2.5-3.5h；分別向孔內加入100μl2-2.5mol·L-1NaOH終止反應；3)將微孔板置入多功能酶標儀進行熒光檢測，發射光波長365nm，測定光波長470nm；在多功能酶標儀上測定熒光度為A；4)根據吸光值A和斜率b，計算所測濾液中MUB的濃度S，S＝A*b；4)在多功能酶標儀上測定熒光度為A5)根據MUB的量計算出酶活性；計算公式為x＝[S*(30-50)]/(V*b*T)式中x為纖維素酶活性(單位μmolMUB·g-1·h-1)，S為步驟4所獲得的熒光物質的濃度，V為反應體系內的溶液總體積(單位ml)，b為稱取的土壤重量(單位g)，T為培養時間(單位h)。2.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于所述標準曲線的制作及測定過程如下，①配制0.5mol丄"pH5.5醋酸緩沖液；②應用0.5mol.L"pH5.5醋酸緩沖液配制濃度為0，0.01，0.05，0.1，0.25,和l.Omol'L"MUB標準液，配制方法稱取MUBO，0.176，0.881，1.762，4.404和1.762g定容至100ml，搖勻即可，此液需當日配制；③待土壤樣品培養結束后向微孔中加入100pl此系列溶液和100inl水，100|il2-2.5mol'L"NaOH后進行熒光測定；此系列溶液中含有MUB0，0.1，0.5，1.0，2.5，10|imol;④標準曲線每個點3-5次重復；⑤根據己知濃度的MUB量及通過熒光檢測數據得到工作標準曲線。3.根據權利要求1所述的分析方法，其特征在于所述微孔板為96微孔板，使用96微孔板作為反應體系承載物，其應用使得大量土壤樣品的同時測定成為可能，提高檢測效率。全文摘要本發明涉及一種檢測土壤中纖維素酶活性的分析方法1)稱取篩分的土壤風干樣品n份于n支粗試管中，向各試管中加入醋酸緩沖溶液，使用旋渦振蕩器振蕩，在振蕩條件下取土壤懸液至96微孔板(占有n個微孔)，向n-1個孔中加入4-MUB-7-β-D-纖維二糖苷底物溶液，另一孔中加入等量水作為無底物對照，向第n+1個孔中加入等量底物溶液和等量水作為無土壤對照，恒溫條件下振蕩培養；2)培養結束后向微孔板中加入NaOH終止反應；3)多功能酶標儀對反應產物進行熒光測定；4)計算纖維素酶活性。本發明的優點為1)與傳統方法相比，減短了培養時間，省略了過濾等操作程序，簡化了操作步驟；2)微孔板內的熒光物質可通過多功能酶標儀在15s內同時獲得測定數據，允許大量樣品同時進行測定；3)準確度高，易操作；4)結果穩定可靠，重現性好。文檔編號G01N21/64GK101586146SQ200810011539公開日2009年11月25日申請日期2008年5月23日優先權日2008年5月23日發明者張麗莉,武志杰,陳利軍申請人:中國科學院沈陽應用生態研究所