斑蝥素測定方法

專利名稱：斑蝥素測定方法
技術領域：
本發明提供一種針對來源于中藥的單體化合物在血漿中含量的測定方 法，特別涉及血漿中斑蝥素測定方法。
背景技術：
斑蝥為芫菁科昆蟲南方大斑蝥Mylabris phalerata Pallas或黃黑小斑 蝥Mylabris cichorii Linnaeus的干燥全蟲，是我國最早被發現的具有抗 癌作用的中藥，其性寒味辛，有大毒。據《神農本草經》記載，斑蝥可以治 療癰疽、潰瘍、癬瘡等病癥，具有攻毒蝕疽、破血散結的作用。現代藥學研 究表明其主要活性成分是斑蝥素(cantharidin)，[化學名]1， 2順式一二 甲基，3， 6—氧橋六氫化鄰苯二甲酸酐。1810年法國藥學家Robiquet從綠 芫菁Lytta vesicatoria中首次得到斑蝥素晶體現代藥理學證明斑蝥素可干 擾癌細胞核酸及蛋白質代謝，能明顯抑制多種動物移植性腫瘤，具有抗癌作 用。在臨床上，斑蝥素在治療癌癥和一些疑難雜癥方面顯示出其獨特的療效。 目前國內市場上有復方斑蝥注射液(商品名為艾迪注射液，國藥準字 Z52020236，貴州益佰制藥股份有限公司)、復方斑蝥膠囊(國藥準字 Z19993294;國藥準字Z20003270，寶雞華西制藥股份有限公司；國藥準字 ZF20000427)，均證實有較好的抗癌作用。
斑蝥素是白色片狀晶體，12(TC升華，熔點215 216。C，極微溶于冷水， 微溶于熱水，易溶于丙酮(l g: 40 mL)、氯仿(l g: 65mL)、 二氯甲垸、乙 醚(l g: 560 mL)、乙酸乙酯等油脂(l g: 150ml)為鄰苯二甲酸酐結構，在酸性條件下穩定，無共軛吸收基團，紫外吸收弱，多采用氣相色譜法測定斑
蝥素的體外含量，2005年中國藥典規定用氣相色譜法測定芫菁蟲內斑蝥素含
斑蝥素為毒性抗癌藥，臨床用量很小，血藥濃度很低，目前沒有針對臨 床使用劑量下的血漿中低濃度斑蝥素的測定方法，建立對低濃度斑蝥素的測 定方法會對斑蝥素各類制劑的質量控制及用藥安全具有重大意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種血漿中斑蝥素測定方法，該方法能夠高靈敏 度地測定血漿中低濃度斑蝥素的含量。
本發明目的是通過如下技術方案實現
本發明所述的血漿中斑蝥素測定方法，其特征在于為氣相色譜-質譜聯 用方法(GC-MS);
其中氣相色譜條件為采用(20-40) mX (0.20-0. 35)mmX (0. 20-0. 35) Pm的色譜柱；載氣惰性氣體；進樣口溫度230-280°C;進樣量:0.5-2W， 柱流量0. 5-2ml/min;升溫程序50-7(TC保持lmin，以4-8°C/min升溫至 200-240°C，保持lmin，以15-25。C/min升溫至260-300。C，保持2-4min;
其中質譜條件為離子源溫度230-280°C;接口溫度230_280°C;電 子轟擊能60-90ev;溶劑切除時間3-5min;單離子檢測，m/z=70-135。
本發明所述的一種血漿中斑蝥素測定方法，其優選的氣相色譜-質譜聯
用方法為
其中氣相色譜條件:采用30mX0.25mmX0.25nm色譜柱；載氣氦氣， 純度:99.999%;進樣口溫度250°C;進樣方式不分流進樣；進樣量1W， 柱流量lml/min;升溫程序6(TC保持lmin，以6tVmin升溫至220°C ，保持 lmin,以20。C/min升溫至280。C，保持3min;
其中質譜條件為離子源溫度25CTC;接口溫度250°C;電子轟擊能70ev;溶劑切除時間4min;單離子檢測，m/z=90-130，其中m/z值優選128 或96.01。
本發明所述的血漿中斑蝥素測定方法，其中血漿處理方法為
血漿加入3-7M的酸；萃取劑選自氯仿，乙酸乙酯，乙醚，二氯甲烷等油脂 或甲苯，甲醇，乙腈中的任意一種；渦旋震蕩80-100秒，14000-16000r/min 高速離心10-25min，吸取上清液，微孔濾膜過濾，氮氣常溫下吹干，用乙酸 乙酯、甲醇、乙腈、氯仿、甲苯、乙醚，二氯甲垸中的任意一種復溶；優選 乙酸乙酯復溶；所述的酸可以為鹽酸、磷酸、硫酸中的任意一種。 本發明所述的血漿中斑蝥素測定方法，其中血漿處理方法優選為
犬血漿500W，加入6M的鹽酸200W，渦旋30s;萃取劑為2ml，選自氯 仿，乙酸乙酯，乙醚，二氯甲垸等油脂或甲苯，甲醇，乙腈中的任意一種；渦 旋震蕩90s， 15000r/min高速離心15min，吸取上清液1600W， 0.25陶微孔 濾膜過濾，吸取過濾液1400W，氮氣常溫下吹干，用的乙酸乙酯復溶， 進樣1W。
所述萃取劑優選乙酸乙酯。
本發明所述的血漿中斑蝥素測定方法，其特征在于在血漿中加入內標物 氯貝丁酯。具體方法為取500ul的含藥血漿，加入200ul的6mol/L的 鹽酸，渦旋30s，加入10ul的內標液(28ng/ml)加入2ml的乙酸乙酯，渦 旋90s, 15000r/min高速離心15min，吸取上清液1. 6ml， 0. 25u m微孔濾膜 過濾,氮氣常溫下吹干，100 u 1乙酸乙酯復溶。
本發明提供了對低濃度斑蝥素的測定，對斑蝥素各類制劑的質量控制及 用藥安全具有重大意義。在方法中通過對氣相條件中程序升溫條件的優化， 使斑蝥素和內標完全分開，卻不被血樣中的雜質干擾，提高了方法的專屬性， 從而使用低分辨率的質譜即可完成定量要求。本發明通過對方法中各參數的 篩選，實現了檢測低劑量斑蝥素技術目的，具有良好的精密度和準確度。下述實驗例和實施例用于進一步說明但不限于本發明。 實驗例1萃取環境選擇
取4份500W空白血漿，分別配置成含斑蝥素濃度為11. 5Pg/ml的含 藥血漿，加入200WHCL (2.0， 3.0， 6.0, 12M)，加入lml乙酸乙酯，60s 渦旋震蕩，吸取上清液，氮氣吹干，復溶，進樣。
表l斑蝥素萃取酸性環境篩選
鹽酸(mol/L) 峰面積
4.0 12454917
5.0 13518188
6.0 20213455
8.0 16207734
以斑蝥素的峰面積值比較，峰面積越大說明斑蝥素的量越大，由表1可 見，500 u 1的含藥血漿中加入200 u 1不同濃度的鹽酸提取斑蝥素，加入200 u 1的6mol/L的鹽酸對斑蝥素的提取率最高。
實驗例2精密度和準確度試驗
取空白血漿500W，配制成斑蝥素濃度分別為2. 14， 85.6， 256. 8ng/ml
的對照品血漿數份，按本發明實施1的"血漿樣品處理方法5. 1"項下處理 每個濃度進行5個樣本分析，計算回收率，同一樣本， 一日內測定5次，計 算日內變異，每日測定1次，計算日間變異，進行氣相色譜-質譜分析。表2斑蝥素日內精密度和日間精密度(n=5)
斑蝥素濃曰內曰間
度XSDRSDXSDRSD
(ng/ml)
2. 142. 560. 3915. 222.371.0819.8
85.682. 822. 002.4186. 666.036. 96
256.8241. 7911.404. 72245. 0921.78.86
由表可知，(內標法計算)日內精密度在2.4-15.2%之間，日間精密度在 6.9-19.8%之間，精密度均小于20%，符合藥典中的精密度(RSD〈20%)和準 確度(RSD<20%)的規定，表明此方法準確、可靠。
實驗例3回收率試驗
按照本發明技術方案所述的方法，配制高(256.8 ng/ml)、中(85.6
ng/ml)、低(2. 14 ng/ml)三種濃度的標準溶液，按照本發明技術方案所述 的方法操作，進樣，記錄色譜圖；另取同樣濃度標品直接進樣，記錄色譜圖。 平行測定三份，計算相對回收率與絕對回收率。
相對回收率=(處理后測得量/加入量)X100% 絕對回收率=(處理后測得峰面積/直接測得峰面積)X100% 表3斑蝥素的相對回收率與絕對回收率考察(11=5)(內標法計算)
Goncen.Absolute recovery(%)Relative recovery(%)
(ng/ml)Mean (%)SD (%)RSD (%)Mean (%)SD (%)RSD (%)
2. 1479.53.844. 83110. 76.926.25
85.687.43. 333.83101.28.718.61
256. 885.25.816.8293.86. 506. 93
由表3可知，斑蝥素此方法的絕對回收率在80-87%之間，表明本提取方法 符合生物樣品提取的要求，可用于斑蝥素的血漿樣品的提取；相對回收率在94_111%之間，結果表明此方法準確，可用于斑蝥素血藥濃度的檢測。
實驗例4非內標法標準曲線的建立與線性范圍
取離心管數支，分別精密加入斑蝥素對照品標準液后用氮氣吹干，加入 比格犬空白血漿500ul，渦旋振蕩30s，配成血漿中含斑蝥素分別為2. 14， 4.28， 8.56， 21.4， 42.8， 64.2， 85.6， 171.2， 342.4ng/ml的標準系列濃 度的血漿樣品，按本發明實施例1的"血樣處理方法5.2"操作，記錄色譜 圖，以斑蝥素的峰面積對血藥濃度做圖，采用加權最小二乘法做回歸計算， 結果表明血漿中斑蝥素在2. 14-342. 4ng/ml的濃度范圍內有良好的線性關 系。
回歸方程為-
y二1886, 5x-9266. 5 (2. 14-342. 4ng/ml) ， r=0. 9952 y=1673. 5x+2791 (2. 14-21. 4ng/ml) ， r=0. 9992 y二1965.9x—27293 (21. 4—342. 4ng/ml) ，r=0. 9902， 最低檢測限為0. 5ng/ml (信噪比S/N二3)
本發明無內標法建立的犬血漿中微量斑蝥素的GC-MS檢測方法，線性范 圍是2. 14-342. 4ng/ml，最低檢測限是0. 5ng/ml。 實驗例5內標法標準曲線的建立與線性范圍
取離心管數支，分別精密加入斑蝥素對照品標準液后用氮氣吹干，加入 比格犬空白血漿500 u 1，渦旋振蕩30s，配成血漿中含斑蝥素分別為2. 14， 4.28， 8.56， 21.4， 42.8， 64.2， 85.6， 171.2， 342.4ng/ml的標準系列濃 度的血漿樣品，按本發明實施例1的"血樣處理方法5. 1"操作，記錄色譜圖及斑蝥素和內標峰面積，以斑蝥素對內標物的面積比值對血藥濃度做圖， 采用加權最小二乘法做回歸計算，結果表明血漿中斑蝥素在
2. 14-342. 4ng/ml的濃度范圍內有良好的線性關系。 回歸方程為
y=1.03X l(T2x +2. 2X 10—3 (2. 14-342. 4ng/ml), r=0. 9999 y二1.01X 10—2x +2.8X1CT3 (2. 14-21. 4ng/ml) ， r=0, 9997 y:1.03X 10—2x—6.4Xl(T3 (21.4—342. 4ng/ml) ， r二O. 9999，最低檢測限 為O. 5ng/ml (信噪比S/N=3)
本發明按內標法計算建立的犬血漿中微量斑蝥素的GC-MS檢測方法，線 性范圍是2. 14-342. 4ng/ml，最低檢測限是0. 5ng/ml。
實驗例6特異性實驗
經優化氣相條件，最終斑蝥素的tK (保留時間^18.30s.內標物的"(保
留時間)^18.55s, R(分離度)大于2.5;選擇性監測離子m/z-128。附圖1所 示為空白血漿的GC-MS總離子流圖，可見在如上所述"氣相色譜-質譜條件" 下，血漿中的雜質在斑蝥素和內標物的出峰處無干擾。附圖2是空白血漿中 加入斑蝥素對照品和內標物對照品，按照本發明血樣處理方法項下處理后的 GC-MS的總離子流圖，由圖可見，兩物質分離良好。附圖3是比格犬靜脈注 射斑蝥素后80min時取血，按照本發明血樣處理方法處理后的GC-MS總離子 流圖，由圖可知，本實驗建立的血漿中微量斑蝥素測定方法，檢測的是斑蝥 素的原形產物，且在斑蝥素和內標物的出峰處無血漿中雜質的干擾，兩峰峰 形良好，符合藥典中"生物樣品分析要求"中特異性的要求，表明本方法準 確，可靠。


圖1所示為選擇性監測m/z=128的空白血漿的GC-MS總離子流圖。 圖2是空白血漿中加入斑蝥素對照品和內標物對照品經本發明血樣處理 方法處理后的GC-MS的總離子流圖(選擇性監測m/z=128)。 A:斑蝥素，B:內標物。
圖3是比格犬靜脈注射斑蝥素后80min時取血，按照本發明血樣處理方 法項下處理后的GC-MS總離子流圖(選擇性監測m/z二128)。 A:斑蝥素，B:內標物。
下述實施例均能實現上述實驗例所述的效果。 實施例l:斑蝥素犬的體內實驗
給藥劑量確定參考目前臨床斑蝥素的使用劑量靜注初始量0.5mg/
日，漸增至2mg/日口服初始量0.5mg/日，漸增至4mg/日。
制定給藥方案參照《實驗動物學》中人用劑量和不同種動物種類間的
劑量換算關系計算。
犬靜注給藥為34ng/Kg (相當于人靜注量lmg/日)，犬口服給藥為102
Ug/Kg (相當于人口服量3mg/日)。
1. 藥品
斑蝥素原料藥(批號070818， 98. 54%，南京青澤醫藥科技開發有限公
司)
犬雄性，6只，比格犬，北京通利試驗動物養殖場。健康，體重(10.8 ±1.11)
2. 給藥
2.1靜注給藥6只犬實驗前禁食12h，靜脈注射斑蝥素生理鹽水溶液，按體 重給藥，劑量34ug/Kg。
采血時間為服藥前2min，服藥后5、 10、 20、 40、 80、 120、 240、 300min，從前肢靜脈取血2ml-3ml，肝素抗凝，以4000r/min離心，分離血漿，冷凍備用。
2.2口服給藥5只犬實驗前禁食12h， 口服斑蝥素自制膠囊，按體重給藥， 劑量102 u g/Kg 。
采血時間服藥前2min，服藥后0.5, 1， 2， 3， 4, 6， 8， 10， 12h從前 肢靜脈取血2m1-3ml，肝素抗凝，以4000r/min離心，分離血漿，冷凍備用。
3、 氣相條件
儀器型號使用了兩種廠家不同型號的GC-MS儀器,具體如下
(1) THERMO DSQ， TRACE氣相系統，單四級桿質量分析器。
(2) Agilent 6890N氣相系統5973N質譜儀，單四級桿質量分析器。
色譜條件采用Agilent DB-5MS (30mX 0. 250mmX 0. 25 y m)色譜柱； 載氣氦氣(純度99.999%)，進樣口溫度250°C，進樣方式不分流進樣， 進樣量1W，柱流量lml/min，
升溫程序60。C保持lmin，以6。C/min升溫至220°C,保持lmin，以20 。C/min升溫至28(TC，保持3min。
4、 質譜條件離子源溫度250°C，接口溫度250°C，電子轟擊能70ev， 溶劑切除時間4min。
單離子檢測，m/z=128。
5、 血樣處理方法
從比格犬前腿靜脈取血，肝素抗凝，以4000r/min離心，分離血漿，冷 凍備用。
5. 1:取500ul的含藥血漿，加入200ul的6mol/L的鹽酸，渦旋30s， 加入10ul的內標物溶液(28ng/ml)加入2ml的乙酸乙酯，渦旋90s， 15000r/min高速離心15min，吸取上清液1.6ml， 0. 25 u m微孔濾膜過濾，氮 氣常溫下吹干，100ul乙酸乙酯復溶，吸取lul用于GC-MS檢測。內標物 為氯貝丁酯(Clofibrate)。
5. 2:取500ul的含藥血漿，加入200ul的6mol/L的鹽酸，渦旋30s， 加入2ml的乙酸乙酯，渦旋90s， 15000r/min高速離心15min，吸取上清液1.6ml， 0.25um微孔濾膜過濾，氮氣常溫下吹干，100ul乙酸乙酯復溶，吸 取lul用于GC-MS檢測。 6、結果
6.1犬單劑量注射斑蝥素后各時間點的血藥濃度，如表4、表5所示。 表4犬單劑量注射斑蝥素后的平均血藥濃度(n=6)(內標法)
時間(min)_^_^_20 40_80 120 240 300
平均血藥濃度
169.8 131.6 111.6 94.1 55.8 29.3 10.3 4.6
(ng/ml)
±SD±24.9±12.3±18.7 ±18.1 ±18.7 ±10.5 ±8.0 ±2.2
表5犬單劑量注射斑蝥素后平均血藥濃度-時間圖(n=6)(無內標法)
時間(min) 5 10 20 40 80 120 240 300 平均血藥濃度
132.0 108.9 90.9 71.4 44.7 19.6 8.4 2.5
(ng/ml)
±SD±26.6 ±20.3 ±16.6 ±14.6 ±10.4 ±7.2 ±3.6 ±1.3
6.2犬單劑量口服斑蝥素后各時間點的血藥濃度，如表6、表7所示。
表6犬單劑量口服斑蝥素后的平均血藥濃度(11=5)(內標法)
時間(h)_^_^_^_^_4 6 8 10
平均血藥濃度
26.2 40.6 41.4 29.822.8 12.9 5.8 3.3
(ng/ml)
±SD±16.6±15.1 ±14.6±14.9 ±16.8 ±7.7 ±2.4 ±1.3
表73號犬單劑量口服斑蝥素后的血藥濃度(無內標法)
時間(h)_0.5 1234 6 8 10
血藥濃度(ng/ml)13.5 52.6 32.6 27.116.8 7.5 3.2 2.1
136. 3采用非房室模型，計算藥物濃度-時間曲線下面積(AUC)、半衰期(T^)、 生物利用度(F)等藥物動力學參數，結果如表8、表9所示。
表8斑蝥素兩種給藥方式的藥動學參數(t^5)(內標法)
CantharidinAUC0~t(ng/ml)-hAUCo~t(ng/ml>h/DMRT T1/2(h)Fr
靜注217.21± 35.076.38xl0"41.25 0.866100%
口服204.72±36.172.04x10—43.134.9%
表9 3號犬斑蝥素兩種給藥方式的藥動學參數(無內標法)CantharidinAUC0~t(ng/ml).hAUC。—t(ng/ml>h/DMRT T1/2(h)Fr
靜注240.716.33xl(T4l扁 0.76100%
口服153.861.38X10—42.8921.3%
按照本發明的檢測方法，實現了對比格犬通過單次靜脈給藥和口服給 藥，測定不同時間點犬血漿中的斑蝥素的血藥濃度，進而了解斑蝥素的犬體 內的濃度變化趨勢，計算斑蝥素在犬體內的藥物動力學參數。采用非房室模 型，用統計矩方法分別計算靜脈和口服給藥的藥物濃度-時間曲線下面積，
計算結果發現，斑蝥素的口服生物利用度為靜脈給藥的34. 9%。
國內外文獻均未見臨床使用劑量下的斑蝥素體內藥物動力學研究報道。 本發明使用GC-MS方法，建立了臨床使用劑量下的血漿中微量斑蝥素的測定 方法，進而對其藥物動力學展開了研究，獲得了相關的藥動學參數，為新劑 型的設計提供了試驗依據，對斑蝥素各類制劑的質量控制及用藥安全具有重 大意義。
權利要求
1、一種血漿中斑蝥素的檢測方法，其特征在于為氣相色譜-質譜聯用方法；其中氣相色譜條件為采用(20-40)m×(0.20-0.35)mm×(0.20-0.35)μm的色譜柱；載氣惰性氣體；進樣口溫度230-280℃；進樣量0.5-2μl，柱流量0.5-2ml/min；升溫程序50-70℃保持1min，以4-8℃/min升溫至200-240℃，保持1min，以15-25℃/min升溫至260-300℃，保持2-4min；其中質譜條件為離子源溫度230-280℃；接口溫度230-280℃；電子轟擊能60-90ev；溶劑切除時間3-5min；單離子檢測，m/z＝70-135。
2、 如權利要求1所述的方法，其特征在于為氣相色譜-質譜聯用方法，其中氣相色譜條件采用30mX0.25mmX0. 25um色譜柱；載氣氦氣，純度99.999%;進樣口溫度250°C;進樣量1W，柱流量lml/min;升溫程序60。C保持lmin，以6°C/min升溫至220°C,保持lmin，以20。C/min升溫至280。C，保持3min;其中質譜條件為離子源溫度250°C;接口溫度250°C;電子轟擊能70ev;溶劑切除時間4min;單離子檢測，m/z=90-130。
3、 如權利要求2所述的方法，其特征在于質譜條件中m/z值為128或96.01。
4、 如權利要求2所述的方法，其特征在于氣相色譜條件中進樣方式為不分流進樣。
5、 如權利要求1-4所述的任意一種方法，其特征在于血漿的處理方法為血槳加入3-7M的酸；萃取劑選自氯仿、乙酸乙酯、乙醚，二氯甲垸、甲苯、甲醇或乙腈中的任意一種；渦旋震蕩80-100秒，14000-16000r/min高速離心10-25min，吸取上清液，微孔濾膜過濾，氮氣常溫下吹干，用乙酸乙酯、甲醇、乙腈、氯仿、甲苯、二氯甲烷、乙醚中的任意一種復溶。
6、 如權利要求5所述的方法，其特征在于血漿的處理方法為血漿500W，加入6M的鹽酸200W，渦旋30s;萃取劑為2ml，選自乙酸乙酯、甲醇、乙腈、氯仿、甲苯、乙醚，二氯甲烷中的任意一種；渦旋震蕩 90s， 15000r/min高速離心15min,吸取上清液1600W， 0.25Mm微孔濾膜過 濾，吸取過濾液140(Hi1，氮氣常溫下吹干，用的乙酸乙酯復溶，進樣
7、 如權利要求5所述的方法，其特征在于血漿的處理方法中萃取劑為 乙酸乙酯。
8、 如權利要求5所述的方法，其特征在于血槳中加入內標物氯貝丁酯 (Clofibrate)。
全文摘要
本發明公開了一種血漿中斑蝥素測定方法，該方法為氣相色譜-質譜聯用，其中氣相條件為色譜條件載氣惰性氣體；進樣口溫度230-280℃；進樣方式不分流進樣；進樣量0.5-2μl，柱流量0.5-2ml/min；升溫程序50-70℃保持1min，以4-8℃/min升溫至200-240℃，保持1min，以15-25℃/min升溫至260-300℃，保持2-4min；其中質譜條件為離子源溫度230-280℃；接口溫度230-280℃；電子轟擊能60-90ev；溶劑切除時間3-5min；SIM檢測，m/z＝128。本發明能夠檢測血漿中低劑量的斑蝥素，具有良好的精密度和準確度。
文檔編號G01N30/00GK101487819SQ20081000076
公開日2009年7月22日 申請日期2008年1月16日 優先權日2008年1月16日
發明者黨云潔, 朱春燕 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所