檢測豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條及其制備方法

專利名稱：檢測豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測動物疾病的試紙條，尤其涉及一種快速檢測豬繁殖與呼吸綜 合癥抗體的試紙條，本發明還涉及該試紙條的制備方法和應用方法，屬于動物疾病檢 驗檢疫領域。
背景技術：
豬繁殖與呼吸綜合癥(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS )是 20世紀80年代末出現的一種新病，其癥狀主要表現為懷孕母豬流產、早產、產死胎、 木乃伊胎及仔豬感染后的成活率下降，成年豬的呼吸道癥狀，同時還會導致免疫抑制 而繼發多種其它疾病。目前，該病在全世界幾乎所有養豬地區都有流行，給世界養豬 業造成了巨大的經濟損失，引起了國內的廣泛關注。2006年夏季我國南方諸省爆發 豬無名高熱病，損失嚴重，疫情持續反彈，其中PRRS是最主要病原之一。目前PRRS 老疫區并未消滅，新疫區又不斷發生，且由于繼發病的增多，使豬場防疫無所適從， 防疫形勢十分嚴峻。目前，7>知的豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)的診斷方法有間接ELISA、免疫熒 光檢測法(IFA )。 (l)間接ELISA主要用于檢測血清中的抗體成分。該方法是將特異性 抗原包被在固相載體的表面，形成固相抗原，加入待檢樣品，使其中的相應抗體結合 到固相載體的抗原上，再加入酶標記的抗抗體，形成抗原-抗體-酶標記抗抗體復合物， 最后加入底物溶液顯色。固相載體上的酶催化底物成為有色產物。通過比色測知樣品 中抗體的含量。但是，ELISA法要求抗原純度高、特異性好，否則會出現非特異性反 應，操作程序較復雜，需反復洗滌，若洗滌次數不夠或過多易造成假陽性或假陰性， 并易造成操作者受害或環境污染，實驗時間較長，需兩個小時以上得出檢測結果。該 法必須具備酶標儀和洗板機，這在基層實驗室和小型門診較難達到，且試驗受溫度等 條件限制，給檢測帶來不便。(2)熒光免疫檢測法(IFA)根據抗原抗體特異性免疫反 應原理設計，把感染病毒的細胞固定在玻片上，將待檢測血清滴于上面，帶有病毒的 血清中含有相應抗體，結合與玻片上，加入焚光試劑，即可顯示出焚光。在熒光免疫顯微鏡下可直接觀察檢測結果。IFA法靈敏度高，但必須具備熒光免疫顯微鏡和暗室 條件，為獲得良好熒光觀察效果必須配置合適的濾光片，實驗時間需兩小時，結果檢 測于免疫顯微鏡下進行，必須由有經驗的專業技術人員判定檢測結果。發明內容本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的問題，提供一種能夠快速檢測 豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條，該試紙條不需要專業的技術人員進行操作，方法 簡便易學，不用任何儀器進行輔助檢測，檢測結果特異性高，重復性好。本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的 一種豬繁殖與呼吸綜合癥抗體快速檢測試紙條，包括樣品墊、玻璃纖維膜、硝 酸纖維素膜(NCM)、吸水墊和支持物；所述的硝酸纖維素膜含有一條由豬繁殖與 呼吸綜合癥病毒M蛋白包被而成的檢測線和由兔抗PRRSV抗體包被而成的對照線； 所述的玻璃纖維膜結合由膠體金標記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白；玻璃纖維 膜、硝酸纖維膜和吸水墊按照以下次序相連接并附著在支持物上玻璃纖維膜與靠 近硝酸纖維膜檢測線的一端相連接，吸水墊與靠近硝酸纖維膜對照線的一端相連接； 樣品墊附著在玻璃纖維膜上，樣品墊的一端與硝酸纖維素膜相銜接。其中，所述的支持物只要是具有一定的硬度，可以將樣品墊、玻璃纖維膜、硝 酸纖維素膜和吸水墊負載于其上以達到支持和負載的目的，均可作為本發明的支持 物；可以選用各種材料作為本發明的支持物，例如塑料板(優選為PVC)、硬紙板、 鋁板等。所述的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白可按 照常規的基因工程方法進行制備或表達，這些方法都是本領域技術人員所能掌握或 通曉的。所述的兔抗PRRSV抗體可參考以下方法制備得到用豬繁殖與呼吸綜合癥弱毒 疫苗采用多點注射法免疫陰性家兔3只，每隔2周加強免疫1次，共進行3次，最后一 次免疫10天后采血，分離血清，純化后得兔抗PRRSVIgG。所述硝酸纖維素膜(該硝酸纖維素膜也可由尼龍膜來替換)上的;f全測線和對照 線之間的間隔優選為3-5mm,更優選為4mm。一種制備本發明檢測豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條的方法，包括(1 )用噴膜機將膠體金標記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白復合物噴涂在玻 璃纖維膜上，備用；(2 )將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白和兔抗PRRSV IgG依次間隔3-5mm噴在 硝酸纖維膜上，分別作為檢測線和對照線，將包被好的硝酸纖維膜封閉其余蛋白結合位點，洗滌，干燥，備用；(3) 將硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊按照以下次序粘貼在支持板 上將玻璃纖維膜連接在靠近硝酸纖維膜檢測線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜 上；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜銜接；吸水濾紙板連接在竭酸纖 維素膜的另一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上；(4) 將粘好的支持板材料切成60mm長、4mm寬的試紙條，即得。 本發明試紙條的應用方法1、 操作方法在檢測前先將樣本和試紙條放在室溫條件下放置一段時間(10 分鐘)，使其恢復至室溫；從鋁箔袋中取出檢測試紙條；在橢圓形加樣孔內加入3—5 滴(100_200/il )待4企豬血液或血清樣品；將試紙條平放在桌面上，在室溫下靜置 20分鐘判定結果；2、 結果判斷無效對照線和斗全測線都不出現色線；陰性對照線出現一條色線，檢測線不出現色線；弱陽性在對照線出現一條顏色較深的紫紅色線，而在檢測線出現一條顏色 很淺的紫紅色線；陽性在對照線和檢測線各出現一條顏色較深的紫紅色線，樣品中的抗體表 達水平越高，檢測線(T)色線顏色越深。本發明利用基因工程技術表達PRRSV核蛋白(N蛋白)和M蛋白，采用酶聯 免疫原理和膜層析技術制成快速檢測豬血液或血清中的抗體的試紙條。與ELISA和 IFA相比，本發明試紙條具有以下明顯的優勢安全性好，無需培養病毒本身，避 免了因操作病毒造成的病毒擴散；可以大批量制備，工藝簡單，生產成本低廉；抗 原成分穩定均一，操作簡便省力，不用儀器，檢測結果特異性高，重復性好。整個 實驗僅需15分鐘。操作簡便、快速、準確、靈敏度高、直觀、結果容易判定。本發明結合膠體金標記技術和膜層析技術，可快速檢測樣本中可能存在的豬 繁殖與呼吸綜合癥抗體，達到快速檢測、及時控制疫情的目的，為下一步的分離鑒 定創造了有利條件，節省了大量的人力物力。檢測方法方便、快速、簡便，不需特 殊儀器設備，不需專業培訓，結果清晰易辨；操作簡單、易于推廣、適合基層以及突發事件的大批量現場檢測，適合流行病調查，對豬繁殖與呼吸綜合癥病毒感染診 斷起到輔助作用。


圖1 本發明試紙條的正面示意圖；圖2 本發明試紙條的側面示意圖；圖3檢測結果示意圖從左至右依次為檢測線和對照線顯色為陽性；對照 線顯色為陰性；；險測線和對照線兩條帶未顯色為無效。附圖標記說明1:吸水墊；2:硝酸纖維膜(6:包被基因工程表達PRRSV M 蛋白；7:包被兔抗PRRSV IgG) ; 3:含有膠體金標記抗原的玻璃纖維膜；4:樣 品墊；5:反應支持物。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述 而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本 領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方 案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。實施例1 本發明檢測豬繁殖與呼吸綜合癥抗體試紙條的制備 1基因工程表達PRRSVN蛋白的制備① 材料來源(1)毒林、菌種PRRSV美洲抹ATCC-VR2332 、表達載體、受體菌BL21 均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所流行病學與診斷中心保存；(2)限制性內 切酶EcoRI, Xhol, Taq酶，pET30 ( a) 、 T4DNA連"l妻酶購于大連寶生物/^司；(3 ) IPTG、卡那霉素購于上海生工，ProBord純化試劑、Trizol試劑盒購于Invitrogen公司。② N蛋白的制備(1)表達載體的構建可參考周艷君等的所公開的方法進行(周艷君，童光志， 薛強等.豬繁殖與呼吸綜合征病毒CH-la株核蛋白基因在原核系統中的高效表達與 初步應用[J].中國預防獸醫學4艮.2002, 6:401-404.)，也可按照以下方法構建將PRRSV病毒培養液經差速離心、超速離心后，收獲的病毒粒子用Trizol試劑盒提耳又病毒核酸，應用特異性引物(上游5'GTGGGAATTCTTGTCAAATATGCC AAATAA3，,下游5'ATTCTAACCTC GAGGATCC CAAA GAATA CC3，)經RT-PCR擴增N蛋白基因，用EcoRI、 XhoI酶切所獲得N蛋白基因和原核表達載體pET30 (a), 分別回收0.4kb、 5.3kb的目的片段，用T4DNA連接酶于低溫下連接，以BL21 菌種制備的感受態進行轉化。(2) N蛋白基因的誘導表達活化陽性菌種，于37。C搖床中以200轉/分劇烈振搖，至菌液的OD值約為0.5時， 加人誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol/L,繼續振搖3—4小時，收獲細菌。將菌體用 200mmol/L Tris-Cl (pH=7.5 )洗2次，然后用PBS懸浮細菌至終濃度lmg/ml。(3) PRRSV N蛋白的純化將超聲裂解后的菌體以10000r/min離心，經0.22)tmi微孔濾膜過濾后，加入lmL 鎳親合層析基質，裝柱，4。C作用30min。依次用10 ~ 20倍柱床體積、含10mM咪唑 和20mM咪唑，500mMNaCl的磷酸鹽緩沖液洗滌3次；再用含IOO ~ 500 mM咪唑的 磷酸鹽緩沖液洗脫含His2tag的重組N蛋白，分管收集，洗脫流速控制在2 ~ 3ml/min。2基因工程表達PRRSVM蛋白的制備① 材料來源(l)毒林、菌種PRRSV美洲抹ATCC-VR2332、表達載體pET-32a、受體菌 BL21均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所流行病學與診斷中心保存；Taq DNA 聚合酶、T4 DNA連接酶和限制性內切酶及各種》務飾酶，Trizol試劑盒，購于大連寶 生物公司；IPTG、氨卞青霉素上海生工；其它試劑均為國產。(3)引物合成。P 上游(5'隱CCTGGATCCTACTCAGCCATAGAAACCT-3，)； P下游(5，陽CATAAGCT CGCTTGCCG TTGTTATTTG-3'),上、下游引物分別包含設計為SamHI、 /fzwJIII 酶切位點。② PRRSVM蛋白的制備 (1 )表達載體的構建將PRRSV病毒培養液經差速離心、超速離心后，收獲的病毒粒子用Trizol試劑 盒提耳又病毒核酸，應用特異性引物(P上游5'-CCTGGATCCTACTCAGCCATAGA AACCT-3; P下游5，-CATAAGCTCGCTTGCCG TTGTTATTTG-3，)經RT-PCR擴增 M蛋白基因，用SawHI、 ///"^III酶切所獲得M蛋白基因和原核表達載體pET-32a。分 別回收0.3kb、 5.9kb的目的片段，用T4 DNA連接酶于低溫下連接，以BL21菌種制 備的感受態進行轉化，小量提取質粒。(2 ) PRRSV M蛋白的誘導表達將含有重組質粒的BL2!菌種在含氨卞抗生素的LB平板上劃線，37。C培養過夜， 挑取單個菌落，于含氨千抗生素的LB中37。C搖床培養至OD600為0.5-0.6時加入誘導 劑IPTG至終濃度0.6mM,繼續振搖培養4小時，收獲細菌。離心后將菌體用0.5M NaCl、 20mM Tris'Cl(pH二7.6)洗兩次，然后用PBS懸浮細胞。 (3 ) PRRSVM蛋白的純化將超聲裂解后的菌體以10000r/min離心，經0.22um微孔濾膜過濾后，加入lmL 鎳親合層析基質，裝柱，4。C作用30min。依次用10 ~ 20倍柱床體積、含10mM咪 唑和20mM咪唑，500mM NaCl的磷酸鹽緩沖液洗滌3次；再用含IOO ~ 500 mM咪唑 的磷酸鹽緩沖液洗脫含His2tag的重組M蛋白，分管收集，洗脫流速控制在2 3ml/min。3制備兔抗PRRSV高免血清用豬繁殖與呼吸綜合癥弱毒疫苗(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所生產)采 用多點注射法免疫陰性家兔3只，每隔2周加強免疫1次，共進行3次，最后一次免疫 IO天后采血，分離血清，純化后得兔抗PRRSVIgG。4膠體金顆粒制備將氯化金(中國醫藥集團上海化學試劑公司)配制成0.01%水溶液，取100ml煮 沸2 min后，邊攪拌邊加入檸檬酸三鈉(1% ) 2 ml,煮沸至溶液顏色變成酒紅色后， 繼續煮沸至適宜濃度(OD535 =0. 9312),冷卻后加入雙蒸水恢復到原體積，置4。C 保存。5膠體金標記N蛋白制備及純化將待標記N蛋白倍比稀釋，分別取100/xl加入l ml月交體金中，10min后加入10% NaC1100jul， 4。C靜止lh。取膠體金顏色沒有發生改變的最高稀釋倍數為準，在此基 礎上加30%為最佳標記量。取一定量調配好的膠體金用0.2 mo1/L K2C03調至pH = 9.0,按最佳標記量加入表達抗原N蛋白，室溫作用20min,加入Tris-HCl (pH8.0, 20mmol/L) 配制的BSA,使終濃度為1%, 4。C放置2h后使用。將金標抗原3000r/ min離心30 min,取上清，60000 g離心60 min，沉淀用0.02 mo1/ L pH7.2含O.l % BSA 的PBS溶解，恢復到原體積。再超離l次，沉淀用少許上述PBS溶解，使OD535nn^ 1.5。 0.22]Lim濾膜過濾，4。C保存備用。6、試紙條的組裝(1 )用噴膜機將膠體金標記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白復合物噴涂在玻璃纖維膜上，備用；(2) 將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白和兔抗PRRSVIgG依次間隔3-5mm噴在 硝酸纖維膜上，分別作為檢測線和對照線，將包被好的硝酸纖維膜封閉其余蛋白結 合位點，洗滌，干燥，備用；(3) 將硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊按照以下次序粘在支持板上 將玻璃纖維膜連接在靠近硝酸纖維膜^r測線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上； 樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜銜接；吸水濾紙板連接在硝酸纖維素 膜的另一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜上；(4) 將粘好的支持板材料切成60mm長、4mm寬的試紙條，即得。試驗例1本發明豬繁殖與呼吸綜合癥抗體快速檢測試紙條的相關試驗 1材料來源豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗原，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所生產；高免血清的制備用中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所生產的弱毒疫苗，用多 點注射法免疫陰性健康豬4頭，每隔2周加強免疫1次，共進行3次，最后l次免 疫10后天采血；分離血清。參考血清豬圓環病毒(PCV)陽性血清、豬流型性腹瀉病毒(PEDV)陽性 血清、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)陽性血清、豬輪狀病毒(PRoV)陽性血清、 豬偽狂犬病毒(PRV)陽性血清、豬細小病毒(PPV)陽性血清均為中國農業科學 院哈爾濱獸醫研究所流行病學與診斷中心保存。待檢血清采自黑龍江、天津、福建等全國各地36個豬場的1285頭份血清和 全血(其中460頭為假設健康豬被采豬全血)，雞血清、鴨血清、鵝血清、羊血清 各15份，共計825份血清和460份全血。并把上述血清、全血編號待檢；對照試劑盒ELISA和IF試劑盒由中國農業科學院中國農業科學院哈爾濱獸醫 研究所提供。一、本發明試紙條敏感性試驗同一份PRRSV陽性高免血清，同時用本發明試紙條(實施例1所制備)和間 接ELISA試劑盒景象檢測，最低檢出量ELISA為1:2560-5120,本發明試紙條為 1:2560。壽1感性相似。用本發明試紙條、ELISA試劑盒和IF試劑盒，分別對上述 825份血清進行檢測，結果基本一致，其中，825份豬血清中陽性739份，陰性147份。在作上述ELISA實驗時時，825份豬血清中，滴度在l: 16以上的樣品666份， 在1: 16以下的樣品76份。用本發明試紙條對上述采豬場的460份血液進行檢測， 并把檢測結果和對應血清檢測結果進行對照，結果基本完全相符。其最小檢出量為 ELISA 1:2560, IF 1:16。二、 本發明試紙條特異性試驗用本發明試紙條對豬圓環病毒(PCV)陽性血清、豬流型性腹瀉病毒(PEDV) 陽性血清、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)陽性血清、豬輪狀病毒(PRoV)陽性血 清、豬偽狂犬病毒(PRV)陽性血清、豬細小病毒(PPV)陽性血清進行檢測，均 不出現紅色斑點線，而用純化的PRRSV陽性高免血清和未純化的PRRSV陽性血清 則出現紅色斑點線。三、 批內和批間的重復性試驗(1 )批內重復性試驗3份陰陽血清樣品在同一批次試紙條試驗中每份樣品平 行設6個重復。(2)批間重復性試驗在5個不同試驗日重復測定6份樣品。 試驗結果為批內重復變異系數為3.2-8.9%之間，批間重復變異系數為 4.1-9.3%之間。四、 符合率試-驗用本發明試紙條對上述豬場的460 f分血液進行4企測，并4巴4企測結果和對應血清 檢測結果進行對照，結果基本完全相符。用本發明試紙條檢測與用ELISA、 IF兩種 方法4企測的符合率為99.60%和97.83%。五、 保存期試驗2002年12月以來對保存的紙條試劑盒進行了試驗，結果表明，試劑盒保存期 均在2年以上。建"^義試劑盒在-20。C保存，有效期為12-18個月。
權利要求
1、一種快速檢測豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條，其特征在于包括樣品墊(4)、玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維素膜(2)、吸水墊(1)和支持物(5)；所述的硝酸纖維素膜含有一條由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白包被而成的檢測線(6)和由兔抗豬繁殖與呼吸綜合癥病毒抗體包被而成的對照線(7)；所述的玻璃纖維膜結合有膠體金標記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白；玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維膜(2)和吸水墊(1)按照以下次序相連接并附著在支持物(5)上玻璃纖維膜與靠近硝酸纖維膜檢測線(6)的一端相連接，吸水墊與靠近硝酸纖維膜對照線(7)的一端相連接；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，樣品墊的一端與硝酸纖維素膜相銜接。
2、 按照權利要求l所述的試紙條，其特征在于所述的支持物(5)是具有一定 硬度的塑料板、硬紙板或鋁板。
3、 按照權利要求l所述的試紙條，其特征在于，所述的兔抗PRRSV抗體按照以 下方法制備得到用豬繁殖與呼吸綜合癥弱毒疫苗采用多點注射法免疫陰性家兔3 只，每隔2周加強免疫1次，共進行3次，最后一次免疫10天后采血，分離血清，純化 后，即得。
4、 按照權利要求l所述的試紙條，其特征在于所述的硝酸纖維素膜能夠由尼 龍膜代替。
5、 按照權利要求l所述的試紙條，其特征在于所述硝酸纖維素膜上的檢測線 和對照線之間的間隔為3-5mm。
6、 按照權利要求5的試紙條，其特征在于所述硝酸纖維素膜上的檢測線和對 照線之間的間隔為4mm。
7、 一種制備權利要求1所述的檢測豬繁殖與呼吸綜合癥抗體的試紙條的方法， 包括(1 )用噴膜機將膠體金標記的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒N蛋白復合物噴涂在玻璃 纖維膜上，備用；(2 )將豬繁殖與呼吸綜合癥病毒M蛋白和兔抗PRRSV IgG依次間隔3-5mm噴在硝 酸纖維膜上，分別作為檢測線和對照線，將包被好的硝酸纖維膜的其余蛋白結合位 點封閉，洗滌，干燥，備用；(3)將硝酸纖維膜、玻璃纖維膜、樣品墊、吸水墊按照以下次序粘貼在支持板上將玻璃纖維膜連接在靠近硝酸纖維膜檢測線的一端，邊緣附著在硝酸纖維素膜 上；樣品墊附著在玻璃纖維膜上，與硝酸纖維素膜銜接；吸水濾紙板連接在硝酸纖 維素膜的另一端，邊l^附著在硝酸纖維素膜上；(4 )將粘好的支持板材料切成60mm長、4mm寬的試紙條，即得。
全文摘要
本發明公開了一種快速檢測豬繁殖與呼吸綜合癥(PRRS)抗體的試紙條及其制備方法。本發明試紙條由樣品墊(4)、玻璃纖維膜(3)、硝酸纖維素膜(2)、吸水墊(1)和支持物(5)組成；其中，所述的硝酸纖維素膜含有一條由PRRSVM蛋白包被而成的檢測線(6)和由兔抗PRRSV抗體包被而成的對照線(7)；所述的玻璃纖維膜結合有膠體金標記的PRRSV N蛋白。本發明試紙條可以大批量制備，工藝簡單，生產成本低廉。利用本發明試紙條檢測豬繁殖與呼吸綜合癥，無需培養病毒本身，安全性好。本發明試紙條靈敏度高、重復性好，操作簡便、快速、準確，直觀，結果容易判定。
文檔編號G01N33/569GK101216488SQ20081000044
公開日2008年7月9日 申請日期2008年1月10日 優先權日2008年1月10日
發明者崔尚金 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所