治療幽門螺旋菌感染的新方法

專利名稱：治療幽門螺旋菌感染的新方法
治療幽門螺旋菌感染的新方法
技術領域：
本發明涉及作為幽門螺旋菌(He//c^^"^^_y/0W) Y谷氨酰基轉肽基 酶(HPGGT)片段的多肽；包含它們的免疫原性組合物，包含HPGGT失 活形式的免疫原性組合物；所述多肽和HPGGT失活片段的用途；針對和 特異性結合所述多肽和HPGGT失活形式的抗體、適體、和鏡像異構適體 (spiegelmer);用于識別候選藥物的方法，用于開發疫苗的方法；HPGGT 的配體的用途。
幽門螺旋菌是革蘭氏-陰性病原菌，其選擇性定居于人的胃粘膜，并 普遍存在于世界人口的多于50%中。該感染通常持續一生，并在胃和十二
指腸潰瘍、胃粘膜-相關淋巴樣組織淋巴瘤、和胃癌的發病機制中有所涉及。 幽門螺旋菌感染的標志是慢性的活躍性胃炎，其特征在于嗜中性粒細胞、 淋巴細胞、和單核細胞/巨噬細胞對粘膜的密集浸潤。若干研究提供了這樣 的證據，即在幽門螺旋菌相關胃炎過程中，增加并活化T-輔助1型細胞， 顯示出體內上調CD25和CD69。還引起了針對多種幽門螺旋菌抗原的強 烈體液應答。盡管其是炎性應答，宿主免疫系統不清除該感染。因此，似 乎幽門螺旋菌干擾免疫系統，后前仍不清楚其獨特的機制。
一些研究解決了這個問題，并描述了幽門螺旋菌逃脫免疫應答的被動 和主動方式。報告了幽門螺旋菌對吞噬作用的抗性，并且其依賴于編碼IV 型分泌裝置組分的毒力基因，諸如v/r57和v/M77。 Zabaleta等報告幽門螺 旋菌精氨酸酶抑制T-細胞增殖并減少T-細胞受體匸鏈的表達。顯示出幽門 螺旋菌的促炎肽通過活化單核細胞產生反應性氧自由基誘導淋巴細胞功 能異常。這些數據強調了細菌和非-特異性免疫應答的相互作用；然而，特 異性T-細胞應答對消除細菌似乎是決定性的，因為在T細胞或干擾素i (IFN-力缺陷的小鼠中疫苗接種試驗失敗了 。
盡管付出這些努力，但是關于胃病原菌的慢性持續性的原因仍不清 楚。1已經顯示出CD4陽性T細胞對細菌消除是關鍵的2但它們的增殖受到幽門螺旋菌的抑制。在該上下文中，若干小組研究了來自幽門螺旋菌的 蛋白質的免疫抑制作用。Knipp和同事部分純化了所謂的"增殖-抑制-蛋 白(PIP)"，其獨立于毒力因子CagA (細胞毒素相關基因A)和VacA (空 泡細胞毒素A)減少淋巴細胞和單核細胞的增殖。4
相反地，兩個小組近期報告了淋巴細胞增殖在高濃度的純化的VacA 的存在下受到抑制。5'6然而，自相矛盾的是，VacA-缺陷型幽門螺旋菌突 變體在它們的增殖抑制特性上沒有缺陷。5另外，早期公認了在受到VacA-表達的螺旋菌株感染的患者中胃炎不改變或甚至不增加。7，8
早期顯示，幽門螺旋菌的分泌產物通過誘導細胞周期停滯在G1階段 來抑制T淋巴細胞增殖。3這種作用與已知的毒力因子包括蛋白質VacA和 CagA無關。
盡管關于幽門螺旋菌逃脫宿主消除作用的可能機制的工作增加了，在 開發特異性治療或預防幽門螺旋菌感染的臨床方法中尚未獲得實質的成 功。
作為本發明基礎的問題是提供適合于在動物或人中引起免疫應答的
多肽，其中所述免疫應答賦予針對幽門螺旋菌感染和與幽門螺旋菌有關或
由其引起的任何疾病的保護。
作為本發明基礎的另一個問題是提供適合于引起所述免疫應答的免
疫原性組合物。
作為本發明基礎的另一個問題是提供確定用于治療和/或預防幽門螺
旋菌感染的新型候選藥物的方法，以及治療和預防這種感染的方法。
這些和其他問題是通過獨立權利要求的主題解決的。由從屬權利要求
可以獲得優選的實施方案。
更具體地，在第一方面通過包括氨基酸序列的多肽解決問題，其中所
述多肽的氨基酸序列與HPGGT區域的一段連續氨基酸序列至少80%相
同，所述HPGGT區域包括對應于SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列，其中通過
以下各項定義所述區域
(a) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或
(b) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，和 其中所述多肽適合于引起能夠抑制HPGGT催化活性的免疫應答。在第一方面的實施方案中，所述多肽包括約15-約30個氨基酸。 在第二方面，通過多肽，優選地，按照第一方面的多肽解決問題，其 中所述多肽包括對應下列各項的氨基酸序列
(a) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或
(b) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480， 其中所述多肽包括約15-約30個氨基酸。
在第二和第一方面的實施方案中，所述多肽的氨基酸序列與所述位置 的一段15-30個連續氨基酸的序列一致。
在第二和第一方面的實施方案中，所述多肽包括選自由下列各項組成 的組的一個序列
QRQAETLKEARERFLKY (SEQ.ID.No. 2), FDIKPGNPNLYGLVGGDANAI (SEQ.ID.No. 3), DFSIKPGNPNLYGLVGGDANAIEANKRPL (SEQ.ID.No.4)和 SSMSPTIVLKNNKVFLVVGSP (SEQ.ID.No.5)
在第三方面，通過免疫原性組合物解決問題，所述免疫原性組合物包 括一種或數種按照第一和第二方面的多肽。
在第四方面，通過免疫原性組合物解決問題，所述免疫原性組合物包 括HPGGT的失活形式。
在第五方面，通過免疫原性組合物解決問題，所述免疫原性組合物包 括HPGGT的片段，其中所述片段由包括HPGGT的氨基酸451和452的 一段連續氨基酸序列組成。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述組合物用于動物或人的 疫苗接種。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述組合物能夠在動物或人 中誘導免疫應答。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述免疫應答是抗體應答。 在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述抗體應答包括對 HPGGT，更優選地，對HPGGT的特異性活性具有抑制作用和/或對淋巴細胞增殖的HPGGT依賴性抑制具有消除作用的抗體。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述組合物用于在患有幽門 螺旋菌感染或處于發展為幽門螺旋菌感染風險中的患者中促進淋巴細胞 的活化和增殖。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述淋巴細胞是B或T細胞。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述組合物包括一種或數種 佐劑。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述組合物包括一種或數種 來自幽門螺旋菌的抗原。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述抗原選自包括外膜蛋白 的組。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述抗原選自包括HpaA、 Ompl8和其組合的組。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述組合物用于預防和/或 治療由幽門螺旋菌引起的或與之相關的疾病，更優選地，由幽門螺旋菌感 染引起的或與之相關的疾病。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述疾病選自包括下列各項
的組幽門螺旋菌感染、由幽門螺旋菌引起的胃與十二指腸病癥、胃炎、
慢性胃炎、胃或十二指腸潰瘍、胃癌和(MALT)淋巴瘤。
在第三、第四和第五方面的實施方案中，所述免疫原性組合物是疫苗。 按照第六方面，通過按照本發明第一方面的多肽用于制備藥物的用途
解決作為本發明基礎的問題。
在第七方面，通過按照本發明第三、第四和第五方面的免疫原性組合
物用于制備藥物的用途解決作為本發明基礎的問題。
在本發明第六和第七方面的實施方案中，所述藥物是疫苗。 在本發明第六和第七方面的實施方案中，所述藥物用于預防和/或治
療由幽門螺旋菌引起的或與之相關的疾病，更優選地，由幽門螺旋菌感染
引起的或與之相關的疾病。
在第八方面，通過按照第一方面的多肽用于檢測樣品中抗體的用途解決作為本發明基礎的問題，其中所述抗體針對HPGGT。
在第八方面的實施方案中，所述抗體能夠抑制HPGGT酶活性和/或
HPGGT對淋巴細胞增殖的抑制活性。
在第九方面，通過特異結合按照第一方面的多肽的抗體解決作為本發
明基礎的問題。
在第九方面的實施方案中，所述抗體具有對HPGGT，更優選地，對 HPGGT的特異性活性的抑制作用和/或對淋巴細胞增殖的HPGGT依賴性 淋巴細胞抑制的消除作用。
在第十方面，通過編碼按照第九方面的抗體的核酸解決作為本發明基 礎的問題。
在第十一方面，通過特異結合按照第一方面的多肽或結合HPGGT的 片段的核酸分子解決作為本發明基礎的問題，其中所述片段由包括 HPGGT的氨基酸451和452的一段連續氨基酸序列組成，其中所述核酸 分子選自包括適體和鏡像異構適體的組。
在第十一方面的實施方案中，所述核酸具有對HPGGT，更優選地， 對HPGGT的特異性活性的抑制作用和/或對淋巴細胞增殖的HPGGT依賴 性抑制的消除作用。
在第十二方面，通過按照第九方面的抗體用于制備藥物的用途解決作 為本發明基礎的問題。
在第十三方面，通過按照第十一方面的核酸用于制備藥物的用途解決 作為本發明基礎的問題。
在第十二和第十三方面的實施方案中，所述藥物用于治療和/或預防 由幽門螺旋菌引起的或與之相關的疾病，更優選地，由幽門螺旋菌感染引 起的或與之相關的疾病。
在第十四方面，通過用于確定治療疾病的候選藥物的方法解決作為本 發明基礎的問題，所述方法包括評估候選藥物的下列各項的步驟
a. 對幽門螺旋菌的7-谷氨酰基轉肽基酶的特異性活性的抑制作用和
b. 對淋巴細胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用。 在第十四方面的實施方案中，所述疾病是由幽門螺旋菌引起的或與之
相關的疾病，更優選地，由幽門螺旋菌感染引起的或與之相關的疾病，和更優選地，人中的幽門螺旋菌感染。
在第十五方面，通過用于開發疫苗的方法解決作為本發明基礎的問 題，所述方法包括下列步驟
a) 提供包括HPGGT或至少一個它的片段的免疫原性組合物；
b) 用所述免疫原性組合物免疫動物，并由此產生抗體；
c) 評估所述抗體對幽門螺旋菌的Y-谷氨酰基轉肽基酶的特異性活性 的抑制作用和它們對淋巴細胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用和
d) 選擇合適的免疫原性組合物。
在第十五方面的實施方案中，所述疫苗是針對人中幽門螺旋菌感染的 疫苗。
在第十六方面，通過HPGGT配體制備用于預防和/或疾病的藥物的 用途解決作為本發明基礎的問題，其中所述配體顯著抑制HPGGT活性并 消除淋巴細胞增殖的HPGGT依賴性抑制。
在第十六方面的實施方案中，所述疾病是由幽門螺旋菌引起的或與之 相關的疾病，更優選地，由幽門螺旋菌感染引起的或與之相關的疾病。
在第十六方面的實施方案中，所述配體是按照第九方面的抗體，或按 照第十一方面的核酸。
在第十六方面的實施方案中，在淋巴細胞增殖測定中評估淋巴細胞增 殖和/或活化。
在第十七方面，通過HPGGT用于制備免疫抑制刑組合物的用途解決 作為本發明基礎的問題。
在第十八方面，通過免疫抑制劑組合物解決作為本發明基礎的問題， 所述免疫抑制劑組合物是可以在容許HPGGT特異性活性的培養基中培養 HPGGT和谷氨酰胺后作為上清液獲得的。
在不希望受到任何理論局限的條件下，本發明人意外地發現針對幽門 螺旋菌的Y-谷氨酰基轉肽基酶(HPGGT) (E.C.2.3.2.2.)的配體可以用于治 療和/或預防幽門螺旋菌感染，具體地，胃與十二指腸病癥，其中所述配體 是HPGGT催化活性的抑制劑并與對照相比恢復淋巴細胞增殖，所述對照 在存在該酶的條件下受到抑制。此外，本發明人發現當與HPGGT—起培 養時，淋巴細胞的增殖受到HPGGT特異性活性的阻斷，所述HPGGT特異性活性導致淋巴細胞中的Gl細胞周期停滯，并由此抑制淋巴細胞增殖。
因此，HPGGT特異性活性的抑制消除淋巴細胞增殖的抑制，并因此使幽
門螺旋菌不可能逃脫宿主的免疫系統。因此，如本發明提示的配體的使用 預防或至少基本減少幽門螺旋菌定居在宿主/患者中。最后，本發明人發現
幽門螺旋菌的Y谷氨酰基轉肽基酶(GGT)的催化活性對于抑制淋巴細胞增 殖，特別是宿主中T細胞增殖是必需的。這由下列證據清楚地證實，所述 證據顯示在GGT活性中有缺陷的突變細菌喪失消除淋巴細胞增殖的能力， 并同時不能定居在小鼠中。對淋巴細胞的抑制作用由重組HPGGT完全呈 現。關于其對T細胞中信號轉導的作用的分析提示Ras信號傳導通路的中 斷，從而導致誘導Gl細胞周期停滯。重要地，注意到每種幽門螺旋菌株 具有HPGGT，且由抑制配體耙向該酶將提供適用于每種幽門螺旋菌感染 的新型療法，由此避免與抗生素療法相關的問題(抗性、副作用、突變體 選擇等)。按照本發明，優選地，對幽門螺旋菌感染的保護是通過抑制 HPGGT的催化活性和由此破壞免疫抑制而賦予的，所述免疫抑制否則阻 止針對幽門螺旋菌的有效免疫應答。
HPGGT廣泛分布于動物、植物和細菌中。其代表異源二聚體蛋白， 其作為單多肽鏈翻譯，并在翻譯后分裂為兩個具有不同分子量的亞單位。 該酶的哺乳動物形式是膜-結合的蛋白質，所述蛋白質主要表達于全身的腺 體和導管腔表面上。 一些細菌性GGT，包括幽門螺旋菌同源物的細胞定位 與哺乳動物的酶的細胞定位不同。先前顯示，HPGGT被分泌到細胞外培 養基中(Bumann等2002)。另外，不同GGT同源物氨基酸序列的排列揭 示HPGGT與人和其他哺乳動物GGT之間22%的低同源性，而對細菌性 同源物的較高同源性。HPGGT和來自其他物種的同源物之間的另一個重 要區別是在HPGGT的C-末端缺乏GY-殘基(Chevalier等1999)。因此，關 于HPGGT和其哺乳動物同源物之間的細胞定位和蛋白質結構的基本區別 是明顯的。
Y-谷氨酰基轉移酶還稱為谷氨酰基轉肽基酶；a-谷氨酰基轉肽基酶；g-谷氨酰基肽基轉移酶；g-谷氨酰基轉肽基酶;g-GPT; g-GT; g-GTP; L-g-谷氨 酰基轉肽基酶;L-g-谷氨酰基轉移酶;L-谷氨酰基轉移酶；GGT; g-谷氨酰基 轉肽基酶。特異性(催化)活性是如下概述的谷氨酰基殘基轉移(5-L-谷氨酰基)-肽+氨基酸=肽+ 5-L-谷氨酰基氨基酸
該反應或進行所述反應的能力在本文中也指HPGGT的酶活性或 HPGGT的特異性活性。
可以用本領域技術人員巳知的方法(例如，使用L-Y-谷氨酰基 -p-nitroanilide作為供體底物；見下)評估GTT活性。可以如本文中所詳 述地，在存在或缺乏HPGGT和/或配體的條件下進行淋巴細胞增殖測定。
早期，其他小組已經描述了 GGT作為來自幽門螺旋菌的因子對體內 定居很重要。"，13然而，該發現的基礎原因尚不清楚。
本發明提供關于人T淋巴細胞增殖的GGT-依賴性抑制和由幽門螺旋 菌誘導Gl停滯的明確證據。這在一方面通過使用細菌的同基因 (isogenic)GGT敲除突變體得到證實，其未能抑制抗原-刺激的初級人T細 胞以及PBMC的增殖。在另一 方面，大腸桿菌(Eco")中表達的重組HPGGT 在缺乏幽門螺旋菌分泌的其他蛋白的條件下，抑制T細胞增殖。有趣地， 我們的數據顯示哺乳動物的GGT缺乏這種抑制功能。如上提及地，報告 了哺乳動物和HPGGT的結構和定位中的區別。我們的結果指出哺乳動物 和HPGGT的催化機制和/或底物特異性的其他差別，這是哺乳動物GGT 不能抑制淋巴細胞增殖的原因。
使用了結構研究和誘變實驗來確定絲氨酸殘基451和452對GGT催 化活性而言是必需的。21本文顯示HPGGT絲氨酸451/452位置-定向誘變 為丙氨酸導致完全消除其針對淋巴細胞的催化活性和特別地，抑制活性， 這與現有技術的技術教導相反，在現有技術中報告了氨基酸位置380 (T380)對HPGGT的催化活性很關鍵31。因此，用GGT抑制劑阿西維 辛(acividn)培養HPGGT完全消除該酶的催化活性以及抑制功能。所以， 我們的數據證明HPGGT的催化結構域的結構完整性是其免疫抑制作用的 必要先決條件。按照來自幽門螺旋菌的GGT在體內定居過程中的重要作 用1U3，我們發現該酶甚至在宿主胃粘膜中存在的低pH值下是催化活性 的。
非常確定地，人胃中的上皮細胞形成連續的屏障，所述屏障限制分子在內部和外部區室之間運動。另外，多種機制，包括緊密和粘著連接阻止 大分子被動擴散經過該屏障的細胞旁空間。因此，出現了這樣的問題，即 幽門螺旋菌分泌的GGT蛋白如何能夠與上皮屏障另一側的宿主免疫系統
相互作用，從而抑制T細胞增殖。在該上下文中，先前己經證明了HP能 夠通過若干機制減弱胃上皮的屏障功能。另外，以前已經證明了由HP蛋 白VacA和CagA引起上皮連接復合物的破壞以及由幽門螺旋菌脲酶引起 增多的胞轉蛋白(tmnscytotic protein)穿過上皮屏障傳遞。這些機制最終 導致固有層中存在增多的HP蛋白，和它們與作為幽門螺旋菌感染的結果 浸潤胃粘膜的免疫系統細胞的相互作用。支持HPGGT對胃粘膜中T細胞 的影響，我們的結果顯示明確的血清抗體應答HP感染的而非未感染的對 照患者中的這種毒力因子。這支持抗原處理GGT蛋白組分和將這些抗原 呈遞給免疫系統的組分，包括胃粘膜中的T淋巴細胞的想法。因此，通過 HPGGT抑制胃粘膜中的T淋巴細胞增殖可以有助于幽門螺旋菌的免疫逃 脫機制，從而促進其在人胃中的慢性持久性。
解釋本發明的研究的結果揭示了在與幽門螺旋菌野生型上清液和還 有與重組HPGGT溫育的過程中T細胞活化的重要機制是完整的。這與本 發明人先前的研究一致，所述先前的研究顯示細胞表面抗原CD69和CD25 (IL-2受體a-鏈)的表達在存在幽門螺旋菌上清液的條件下不減少。3另 夕卜，證明了 HPGGT對淋巴細胞的抑制功能受到與凋亡無關機制的介導， 因為通過Annexin V-FITC染色測量的磷脂酰絲氨酸的暴露，在存在幽門螺 旋菌上清液和重組HPGGT的條件下不增加。早期描述了 HPGGT誘導胃 上皮細胞中的氧化壓力和凋亡。12'16然而，先前沒有確定該酶對免疫系統 的細胞的作用，且觀察到的區別可以反映靶細胞之間的區別。
本發明人分析了在T細胞中用細胞周期進展干擾HPGGT，并發現 HPGGT通過引起細胞周期Gl階段中的停滯，抑制淋巴細胞的增殖。Gl 停滯的特征在于增多的Cdk-抑制子p27的量以及減低的細胞周期蛋白細 胞水平。Ras-和PDK-依賴性途徑在用它們的催化配偶體誘導、合成和裝 配D-型細胞周期蛋白的過程中非常重要。22'23 Ras-信號傳導的活化通過涉 及c-Raf和其他激酶的蛋白級聯誘導細胞周期蛋白D-轉錄。24另外，確定 了誘導Ras信號傳導導致增強合成c-Myc蛋白25，這在調節細胞周期、細胞生長、和轉化過程中起重要作用。26先前的研究證明了 PI3K-信號傳導 不依賴于T細胞中的Ras-信號傳導而進行。17盡管重要介體PI3K-信號傳 導(AKT， p70S6K和Foxo3)的活化狀態在存在HPGGT的條件下不改變，我 們在用HPGGT培養的細胞中發現了降低的c-Raf磷酸化和c-Myc蛋白水 平。因此，我們的數據提示由來自幽門螺旋菌的GGT引起的Ras-而非PI3K-依賴性信號傳導的中斷在誘導T細胞中細胞周期停滯的過程中起作用，從 而導致消除的細胞增殖。
另一個重要問題是酶，如HPGGT如何能夠影響導致細胞周期停滯和 抑制增殖的細胞內信號傳導事件。在轉肽基反應過程中，GGT催化Y-谷氨 酰基部分從供體轉移到受體基質中。"通過系統氨基酸消耗分析，本發明 人發現在缺乏來自培養基的氨基酸谷氨酰胺的條件下完全消除HPGGT的 抑制作用，這提示來自幽門螺旋菌的GGT的抑制作用受到轉肽基作用過 程中形成代謝物的間接介導。這通過我們這樣的觀察得到支持，即與 HPGGT —起預培養培養基并隨后在加入到細胞前使酶失活足以抑制淋巴 細胞增殖。
先前的研究描述了幽門螺旋菌的若干不同于GGT的因子，其抑制人 T淋巴細胞的增殖。Wang和同事顯示處于300的MOI (300個細菌/T細 胞)的幽門螺旋菌通過誘導凋亡，抑制T細胞的增殖。然而，這種高細菌 量是否接觸到人胃的固有層中的T細胞是不確定的。在我們先前的公開文 獻中(胃腸病學(Gastroenterology) 2005 2005;128(5):1327-39)，本發明 人顯示甚至比l (l個細菌/T細胞)低300倍的MOI足以在我們的系統中 抑制淋巴細胞增殖。當與淋巴細胞一起培養的HP培養物上清液的濃度升 高超過100pg/ml時，觀察到與Wang等相似量的凋亡。這提示本文中所述 的HP對淋巴細胞的抑制作用與該小組所述的機制相比更明確 (pronounced)并且不同。
由Zabaleta等進行另一項研究描述了細胞質HP蛋白精氨酸酶抑制T 細胞增殖3、作者使用來自HP的全細胞溶解物，其包含細菌的細胞質和 膜-結合蛋白。相反，本發明人使用來自HP包含其分泌的蛋白的培養物上 清液。由于HP不分泌精氨酸酶，所以該酶針對T細胞可能的抑制作用是 于此使用的系統中不可檢測的，且不太可能在體內發生。Gebert等進行的工作提示由幽門螺旋菌分泌的空泡細胞毒素A (VacA) 抑制T細胞增殖。作者使用了是我們在我們目前工作中使用濃度(10pg/ml) 的25倍的濃度(250ng/ml)的細菌上清液。在先前的研究中，本發明人證明 了高HP培養物上清液濃度(2100嗎/ml)在淋巴細胞中誘導顯著量的凋亡。 另外，在我們的系統中存在或缺乏VacA對HP針對淋巴細胞的抑制沒有 影響(Gastro 2005)。
因此，不管前述由幽門螺旋菌引起T細胞抑制的其他方式，在本文 中使用的系統中，細菌分泌的GGT對抑制T細胞增殖是必需的和充分的。
總之，解釋本申請的數據提供一種由幽門螺旋菌應用的免疫逃避的新 型機制，其利用分泌的蛋白質抑制免疫效應子細胞的細胞周期進展。顯示 了酶GGT是造成幽門螺旋菌抑制T細胞增殖的原因，因為在細菌的GGT-缺陷型突變體中抑制作用完全消除。該作用明顯依賴于GGT的催化活性， 因為重組HPGGT蛋白的酶失活突變體缺乏抑制T細胞增殖的能力。另外， 顯示了僅在存在來幽門螺旋菌的GGT條件下誘導細胞周期停滯在T細胞 的Gl期。再一次，在不希望受到任何理論限制的條件下，其他結果指出 由HPGGT引起的Ras-而非PI3K-依賴性信號傳導的中斷是Gl停滯和抑制 的T細胞增殖的原因。將HPGGT鑒定為淋巴細胞抑制因子形成在動物模 型中觀察的生物基礎，顯示HPGGT對于幽門螺旋菌定居的重要作用。在 WO 00/01825和WO98/17804中討論了 HPGGT及其在宿主細胞的定居中 的可能作用。然而，這兩篇文獻沒有提供這樣的證據，即HPGGT活性是 造成宿主免疫系統抑制的原因，且它們沒有記載HPGGT對宿主細胞內T 細胞增殖和免疫抑制的影響。
本發明人發現不僅所述HPGGT，優選地，具有按照SEQ.ID.No.l的 氨基酸序列的野生型HPGGT，可以作為用于產生抗體、適體、和鏡像異 構適體的抗原使用，而且其不同片段也可以，所述抗體、適體、和鏡像異 構適體各自優選地與所述抗原特異性結合，這適合于抑制HPGGT的特異 性活性禾卩/或對淋巴細胞增殖的淋巴細胞抑制的HPGGT依賴性抑制的消 除作用。
因此，在一方面，本發明涉及特異性多肽。所述多肽包括氨基酸序列， 其與HPGGT不同區域的一部分或一段氨基酸序列相同或相對應。優選地，HPGGT的氨基酸序列包括按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列。
優選地用于本文時，如果氨基酸的序列或順序在氨基酸性質和其彼此 間相對位置方面相同，則氨基酸序列與另一個氨基酸序列相同。
優選地用于本文時，如果氨基酸的序列或順序在氨基酸性質和其彼此 間相對位置方面相同，則氨基酸序列與另一個氨基酸序列相同。在另一個 實施方案中， 一致的序列的一級氨基序列是相同的。
如本文所優選使用的，如果氨基酸的序列或順序在氨基酸性質和其彼 此間相對位置方面相同，則氨基酸序列與另一個氨基酸序列相同。在另一 個實施方案中，彼此對應的序列的一級氨基酸序列相同，其中這兩個對應 的氨基酸序列的全部鄰近序列(context)相同或不同。由該氨基酸序列的 一個或兩個末端相鄰的氨基酸定義氨基酸的全部鄰近序列。
本領域中技術人員應該公認彼此相同或對應的序列具有至少80 %， 85%， 90%, 95 %或100 %的序列同源性。
在實施方案中，按照本發明的多肽包括或由與HPGGT的一段保守氨 基酸序列相同或對應的氨基酸序列組成。優選地，且對本發明的任何實施 方案和方面適用地，HPGGT具有按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列。本領 域技術人員應該公認可以存在HPGGT的變體和突變體，其應該包括在術 語HPGGT之內。本發明還包括，如果HPGGT的序列與如SEQ.ID.No.l 中指定的HPGGT之一不同，則本文中關于具有如SEQ.ID.No.l中指定的 氨基酸序列的HPGGT所公開的內容也適用于HPGGT的所述不同形式。 更具體地，本領域中技術人員應該識別處于所述不同形式的氨基酸，其在 其位置、化學性質和/或功能方面，與具有如SEQ.ID.No.l中指定的氨基酸 序列的HPGGT中確定的氨基酸和位置分別對應。
如本文中公開地，按照本發明的多肽與HPGGT不同區域的氨基酸序 列相同或對應。在一個實施方案中，所述區域是由按照SEQ.ID.No.l的氨 基酸序列的氨基酸位置150-200定義的區域。在另一個實施方案中，所述 區域是由按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列的氨基酸位置410-480定義的區 域。
本發明人意外地發現由氨基酸150-200定義的HPGGT部分和由氨基 酸410-480定義的HPGGT部分特別有益于作為產生能夠抑制HPGGT的催化活性的抗體的抗原或疫苗使用，由此提供這樣的先決條件，即免疫應 答是針對幽門螺旋菌，或至少針對受到幽門螺旋菌感染或處于其感染風險 中的生物體中的HPGGT引起的。
在不希望受到任何理論限制的條件下，本發明人假定由氨基酸位置
150-200和氨基酸位置410-480定義的區域都具有與HPGGT酶活性的特殊 關系。更具體地，認為由氨基酸位置410-480定義的HPGGT區域與HPGGT 的活性中心有關或接近。更具體地，該HPGGT區域包括與所述活性中心 直接接觸的環區域和所述活性中心本身的一部分。因此，這部分HPGGT 的阻斷是抑制HPGGT酶活性的合適方法，大概是通過阻斷HPGGT催化 活性物質的進入。這些，在原則上，對于由氨基酸位置150-200定義的 HPGGT區域也是正確的。按照SEQ.ID.No.l的HPGGT的氨基酸位置 150-200的區域涉及或形成處于HPGGT活性中心外的環(的一部分)，然 而，其與底物的結合袋緊密空間接近。由于這些，所以任何特異干擾這些 區域的分子是如本文中更詳細描述地能夠關于具有這種類型結合特性的 抗體使用的試劑。除抗體外，可以分別產生和使用如現有技術中所述的肽 適體、抗促成素(anticaline)、適體和鏡像異構適體，以獲得本文中關于 抗體公開的多種目的。
本申請提供多肽，其序列與下列氨基酸位置對應或相同
(a) (150 + n) — (150 + n + m)，其中n是0-35之間的任何整數，且 m是15-30之間的任何整數。應該理解由此定義的位置是由n和m的任意 組合產生的那些。還應該理解所述組合優選地僅限于這樣的范圍內，即由 此定義的上游位置是約200;由(150 + n)定義的位置也稱為下游位置；且 由(150 + n + m)定義的位置也稱為上游位置。
(b) (410 + n) —(410 + n + m)，其中n是0-55之間的任何整數，且 m是15-30之間的任何整數。應該理解由此定義的位置是由n和m的任意 組合產生的那些。還應該理解所述組合優選地僅限于這樣的范圍內，即由 此定義的上游位置是約200;由(410 + n)定義的位置也稱為下游位置；且 由(410 + n + m)定義的位置也稱為上游位置。
在另一個實施方案中，按照本發明的多肽是HPGGT的片段，優選地， HPGGT的免疫原性片段，和更有效地，適合于在宿主生物體內引起免疫應答，優選地抗體應答的HPGGT免疫原性片段，其中所述抗體具有對 HPGGT，更優選地對HPGGT的特異性活性的抑制作用，和/或對淋巴細 胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用。優選地，按照本發明的免疫原 性片段包括HPGGT的氨基酸451和或452。該片段可以是任何長度。然 而，使用10-約50個氨基酸殘基的肽，更優選的10-40、 10-30，或最優選 的10-20。為了基于肽的疫苗的設計，在此應用表位預測算法。優選地用 于本文時，宿主生物體是動物，優選地哺乳動物，或人，其優選地能夠針 對抗原形成免疫應答。
優選地用于本文時，氨基酸是a-氨基酸。也優選地用于本文時，氨 基酸是D-或L-氨基酸，優選地，L-氨基酸。更優選地，氨基酸是天然存 在的氮基酸。
本發明人還意外地發現將HPGGT的絲氨酸殘基451和域452誘變 為丙氨酸完全消除重組HPGGT的酶活性，并消除其對T細胞增殖的抑制。 然而，絲氨酸殘基385的取代(S385A)不減少對T細胞增殖的HPGGT 依賴性抑制作用，因管顯著降低這種突變HPGGT的催化活性(即，約 50%)。因此，治療幽門螺旋菌感染的合適藥物物質需要滿足2個要求，即 (i)它必須表現出對HPGGT催化活性的抑制作用，且在與HPGGT—起 培養時還必須恢復T細胞增殖。按照本發明用于識別合適候選藥物的有效 方法因此包括這兩種評估。
由于這些發現，本發明的另一方面涉及HPGGT失活形式的用途。 HPGGT的失活形式是HPGGT的一個實施方案，其缺乏如本文中所 示的HPGGT酶活性。本領域中技術人員應該公認，存在多種提供所述 HPGGT失活形式的方法，包括刪除一個或數個氨基酸，改變一個或多個 氨基酸，總是與酶活性的HPGGT相比較。HPGGT失活形式的一個實施 方案是在按照SEQ.ID.No.l的氨基酸序列的位置451和452處缺少絲氨酸 氨基酸的HPGGT。在一個實施方案中，HPGGT的失活形式仍能夠引起如 本文中所述的免疫應答，優選地，動物和/或人中的抗體應答，其包括具有 對野生型HPGGT，更優選地，對HPGGT的特異性活性的抑制作用和/或 對淋巴細胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用的抗體。優選地用于本 文時，術語HPGGT的特異性活性與酶活性，和更具體地，如本文中所述的HPGGT的酶活性，.以同義方式使用。HPGGT失活形式的另一個實施 方案是具有野生型氨基酸序列的HPGGT，但通過向HPGGT的酶活性添 加抑制劑抑制酶活性。所述抑制劑可以是抗體、鏡像異構適體、適體或剝 奪HPGGT的HPGGT酶活性所需的因子包括離子的任何分子。
應該理解，多肽、HPGGT失活形式和HPGGT在本文中也稱為耙分 子，具體地，和與之特異結合的抗體、適體和鏡像異構適體的產生有關。
本發明的另一方面涉及抗體，所述抗體針對按照本發明的多肽、 HPGGT的失活形式或HPGGT，優選地典型具有按照SEQ.ID.No. 1的氨基 酸序列的野生型HPGGT。
本文中優選使用的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，其制備和產生 分別為本領域中的技術人員所熟知。
特異于所述靶標的抗體的制備是本領域中技術人員己知的，例如，記 述在Harlow, E,，和Lane, D.,"抗體:實驗室手冊"("Antibodies: A Laboratory Manual,")冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷 泉港，紐約(Cold Spring Harbor, NY) ,(1988)中。優選地，單克隆抗體可 以連同本發明使用，其可以按照K6hlei"和Milsteiii的方案和基于此的其他 發展方案而制備。抗體，用于本文時，包括，但不僅限于，完全抗體、抗 體片段或衍生物，諸如Fab片段、Fc片段和單鏈抗體或抗促成素，只要它 們適合于且能夠結合于所述靶標。除單克隆抗體外，也可以使用和/或生成 多克隆抗體。多克隆抗體的生成也是本領域中技術人員已知的，例如，記 述在Harlow, E.,和Lane, D.,"抗體:實驗室手冊"("Antibodies: A Laboratory Manual,")冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory),冷 泉港，紐約(Cold Spring Harbor, NY) ,(1988)中。優選地，用于治療目的 的抗體是人源化的或人抗體。
按照本發明可以使用的抗體可以具有一個或數個標記或標簽。所述標 記或標簽可以在其診斷應用或其治療應用中有效檢測抗體。優選地，所述 標記和標簽選自包含抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、生物素、金和熒 光素的組，并用在例如ELISA法中。這些和其他標記以及方法，例如記述 在Harlow, E.,和Lane, D.,"抗體實驗室手冊"("Antibodies: A Laboratory Manual,")冷泉港實驗室(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港，紐約(Cold Spring Harbor, NY) ,(1988)中。另外地或備選地，本文中所述的抗 體以及任何其他靶拮抗劑或相互作用配偶體可以是如本文中更一般描述 的帶有標簽的拮抗劑。
本發明還包括所述標簽或標記表現出除檢測以外的其他功能，諸如與 其他分子相互作用。所述相互作用可以是，例如與其他化合物的特異性相 互作用。這些其他化合物可以是使用抗體的系統如人或動物體中所固有的 那些，或在通過使用各自抗體進行分析樣品中固有的那些。合適的標記可 以，例如，是生物素或熒光素，其具有其特異性相互作用配偶體，諸如抗 生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白等，所述配偶體存在于與由此標記或帶有 標簽的抗體相互作用的各種化合物或結構上。而且，這也應用于本文中所 述的其他靶相互作用配偶體，諸如適體和鏡像異構適體。
在實施方案中，所述抗體是具有針對HPGGT表位的特異性活性的抗 體，優選地單克隆抗體，其包括重組HPGGT的氨基酸451和/或452。在 另一個實施方案中，所述抗體應該靶向在空間上接近這些氨基酸位置的表 位，優選地，靶向并特異結合于鄰近所述位置的環，更優選地，所述表位 由下述序列所定義或包含在下述序列中由SEQ.ID.No. 1的HPGGT氨基 酸位置150-200，更優選地，位置174-190定義的這段HPGGT序列，或通 過SEQ.ID.No. 1的HPGGT氨基酸位置410-480，更優選地，位置423-443 所定義的這段HPGGT序列，和其在這樣的附帶條件下的衍生物，所述附 帶條件是它們顯示基本相同的免疫反應性。
優選地，本發明的抗體以至少50%,更優選地至少70%,最優選地至少 80或90%,抑制HPGGT特異性活性并抑制宿主中淋巴細胞增殖的HPGGT 依賴性抑制。還優選地，體外評估時，按照本發明的抗體還表現出對 HPGGT特異性活性的抑制作用，并消除T細胞增殖的HPGGT依賴性抑 制。
按照本發明可以 以與所述抗體相同方式并由此為了相同目的使用的 另一類相互作用配偶體是所謂的"抗促成素"，其為耙結合多肽的特殊形 式。其中，抗促成素及其制備方法，記述在德國專利申請DE 197 42 706 中。
可以以與所述抗體相同的方式并由此為了相同的目的使用的另一類分子是所謂的肽-適體。利用靶標，可以使用篩選方法生成肽適體，所述篩選方法利用如本文中更詳細描述的多肽文庫。選擇標準是分泌的多肽實際上并特異地結合于所述靶標。
更特別地，可以通過利用按照現有技術的方法，諸如噬菌體展示生成所述肽適體。基本上，生成肽文庫，諸如處于噬菌體形式，且這類文庫與靶分子接觸。隨后，從各個反應中去除這些結合靶分子的肽，優選地，作為與靶分子的復合物。本領域中技術人員已知結合特征，至少在一定程度上，依賴于具體實行的實驗設置，諸如鹽濃度等。在將以較高親和性或較大強度結合靶分子的那些多肽與所述文庫中的非-結合成員分開后，且任選地，還在從耙分子和多肽的復合物中去除靶分子后，可以隨后表征各個多肽。表征前，任選地，實行擴增步驟，諸如，例如，通過增殖編碼所述多肽的噬菌體。表征優選地包括測序所述靶結合多肽，和最后對作為如本文中定義的靶標的拮抗劑或相互作用配偶體的多肽進行測序。基本上，所述多肽不受其長度的限制，然而，優選地，具有約8-20個氨基酸長度的多肽是在各種方法中優選獲得的。所述文庫的尺寸可以是約102-1018，優選地，108-1015個不同的多肽，然而，不受其限制。
本發明的另一方面涉及針對按照本發明的多肽，HPGGT的失活形式或HPGGT，優選地，典型地具有按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的野生型HPGGT的適體。
適體是單鏈或雙鏈的D-核酸，且其與靶分子特異性相互作用。適體的制備或選擇，例如，記述在歐洲專利EP0 533 838中。基本上，實行下列步驟。第一，提供核酸混合物，即潛在的適體，其中每種核酸典型地包括若干，優選地至少8個隨后的隨機化核苷酸的區段。該混合物隨后與靶分子接觸，其中與候選混合物相比，所述核酸，諸如基于對所述靶標增強的親和性或與其更大的強度結合靶分子。隨后將結合核酸從混合物的殘余物中分離。任選地，利用，例如聚合酶鏈反應擴增由此獲得的核酸。這些步驟可以重復若干次，從而最終提供具有增高比例的特異性結合于靶標的核酸的核酸混合物，然后任選地從所述核酸混合物中選擇最終結合核酸。這些特異性結合核酸指適體。顯然地，在生成或識別適體的方法的任何階段，可以采用各種核酸的混合物樣品，利用標準技術確定其序列。本發明包括可以固定適體，諸如，例如通過引入定義的化學基，這些化學基是生成適體技術領域中技術人員己知的。所述修飾可以例如存在于核苷酸糖部分的2'-位置處的氨基引入中。目前使用適體作為治療和診斷劑。然而，本發明還包括由此選擇或生成的適體可以用于耙標確認和/或用作開發藥物，優選地基于小分子的藥物的引導物質。這實際上是通過競爭測定完成的，其中靶分子和適體之間的特異性相互作用受到候選藥物的抑制，其中根據從靶標和適體的復合物中替換適體，可以假定各種候選藥物容許特異性抑制靶標和適體之間的相互作用，且如果該相互作用是特異性的，則所述候選藥物應該，至少原則上，適合于阻斷所述靶標并由此在包括所述耙標的各種系統中降低其生物學有效性或活性。然后，由此獲得的小分子可以進行進一步的衍生化和修飾，從而最優化其物理、化學、生物學和/或醫學特性，諸如毒性、特異性、生物降解能力和生物有效性。
本發明的另一方面涉及針對按照本發明的多肽，HPGGT的失活形式或HPGGT，優選地，典型地具有按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的野生型HPGGT的鏡像異構適體。
鏡像異構適體是特殊形式的適體。可以按照本發明利用所述耙標使用
或生成的鏡像異構適體的生成或制備基于相似的原則。鏡像異構適體的制
備記述在國際專利申請WO 98/08856中。鏡像異構適體是L-核酸，這意
味著它們由L-核苷酸組成，而不是向適體那樣由D-核苷酸組成。鏡像異
構適體的特征在于這樣的事實，即它們在生物學系統中具有非常高的穩定
性，且類似于適體，與它們針對的靶分子特異性相互作用。為了生成鏡像
異構適體的目的，在存在例如所述靶標的天然存在的L-對映異構體的D-
對映異構體的情形中，創建了D-核酸的異源群體，且該群體與耙分子的光
學對映體接觸。隨后，分離不與靶分子的光學對映體相互作用的那些D-
核酸。然而，對與靶分子的光學對映體相互作用的那些D-核酸進行分離、
任選地確定和/或測序，并且隨后基于獲自D-核酸的核酸序列信息合成相
應的L-核酸。這些與前述與靶分子的光學對映體相互作用的D-核酸序列
相同的L-核酸應該與天然存在的靶分子，而非其光學對映體特異性相互作
用。類似于生成適體的方法，還可能重復所述多種步驟若干次，并由此富集與靶分子的光學對映體特異性相互作用的那些核酸。在另一方面，本發明涉及免疫原性組合物。所述免疫原性組合物包括至少一種按照本發明的多肽和/或HPGGT的失活形式，具體地，如本文中
所述的HPGGT失活形式，和/或野生型HPGGT。應該理解所述按照本發明的多肽和/或所述HPGGT的失活形式，具體地如本文中所述的HPGGT失活形式，和/或所述野生型HPGGT，在一個實施方案中，綴合于載體物質，諸如KLH或匙孔血藍蛋白、BSA、卵清蛋白等，從而以這樣的方式對宿主的免疫系統呈現各自的抗原，所述方式容許或促進引起免疫應答和引起高滴度抗體。
應該理解，根據本發明，可以體外或體內使用免疫原性組合物。在后者的情形中，所述免疫原性組合物典型地是疫苗，且優選地配置為所述疫苗。免疫原性組合物、包括所述免疫原性組合物的藥物和疫苗，分別可以用于預防幽門螺旋菌感染，優選地，在兒童中，或用于治療和/或預防患有或處于患有幽門螺旋菌感染和由所述生物體引起或與其相關的任何疾病的風險中動物和人。
在實施方案中，本發明的免疫原性組合物包括一種或數種佐劑。優選地，佐劑是提供免疫系統一般剌激的試劑。佐劑是本領域中已知的，且包括，但不僅限于，聚陽離子多聚體、免疫刺激脫氧核苷酸(ODN)、合成KLK肽、神經活性化合物、alumn、弗氏完全或不完全佐劑、霍亂毒素。優選地，聚陽離子多聚體是聚陽離子肽和/或其中神經活性化合物是人生長激素。
在另一方面，免疫原性組合物包括幽門螺旋菌的外膜蛋白，諸如BabA、 HpaA、 Omp 18和其組合物。HpaA和Ompl8，例如，記述在Volandp.等.，感染和免疫性(Infection and Immunity) , 2003年7月，3837-3843頁中。本發明包括術語BabA,HpaA和Omp18，該術語不僅包括全長多肽，還包括其任何的免疫原性片段或肽。HpaA是推定的N-乙酰神經氨糖酸基乳糖(N-acetylneumminyllactose)-結合血凝素，Bab A是與路易斯血型抗原結合的黏著蛋白。應該理解，其他抗原和優選地蛋白質和多肽，和其各自的片段，可以用于增加針對幽門螺旋菌的免疫應答。可以在本發明的實施方案中使用的優選蛋白質和多肽，分別是外膜蛋白，所述外膜蛋白典型地被引入幽門螺旋菌的外質膜中，并對例如，離子運輸、粘著、結構和滲透穩定性和細菌毒力很重要。
可以獲自幽門螺旋菌和可以是按照本發明的免疫原性組合物的一部
分的其他抗原是記述在公開的美國專利申請20070042448中的那些。
應該承認，優選地配制本發明的多肽和蛋白質，包括HPGGT的失活形式和野生型HPGGT，以及本文中所述的意欲施用于動物或人體的任何其他化合物。所述制劑是本領域中技術人員已知的。在一個實施方案中，所述制劑如美國專利6,838,089中所述。該美國專利中所述的制劑是包括許多多聚體粒子的遞送系統，其中不溶于水的蛋白質抗原與所述多聚體粒子結合，所述多聚體粒子包括基質多聚體，其包括一種或多種同聚物和/或共聚物，其中所述方法包括(a)混合水相(W)和有機相(0)，所述水相包括處于其臨界微團濃度的0.1-100倍濃度的不溶于水的試劑諸如蛋白質和一種或多種親水性表面活性劑，所述有機相包括處于有機溶劑中的基質多聚體，所述溶劑不變性蛋白質抗原且其中O與W不混溶，從而產w/o乳劑，其中W或O或二者還包括一種或多種穩定劑，所述穩定劑在混合前加入，從而在存在增溶劑的條件下穩定w/o乳劑，并在步驟(b)
過程中促進多聚體粒子中的不溶于水的蛋白質的引入；和(b)通過將所述乳劑分散在流動的基質中而形成所述W/0乳劑的小滴，和從所述W/O乳劑小滴的O相中去除所述溶劑，從而形成引入不溶于水的蛋白質抗原的多聚體粒子。
在另一個實施方案中，關于本文中所述的試劑和化合物的制劑和遞送試劑是微球系統，諸如，如美國專利6,372260中所述的那些。
在本發明的一方面，按照本發明的多肽、HPGGT的失活形式、抗體、鏡像異構適體和適體、包括按照本發明的任意這些的免疫原性組合物、藥物組合物優選地用于預防和/或治療由幽門螺旋菌引起的或與之相關的，更優選地由幽門螺旋菌感染引起的疾病。在一個實施方案中，所述疾病是由幽門螺旋菌感染引起的胃與十二指腸病癥。在另一個實施方案中，所述疾病是胃炎，大部分慢性胃炎。由于慢性胃炎涉及胃或十二指腸潰瘍或甚至胃癌和MALT淋巴瘤的發病機理，本發明的方法和以上試劑可以用于預防這些疾病。其還可以用于治療，例如胃和十二指腸潰瘍病和(MALT)淋巴瘤。按照本發明，使用一般術語"治療"一 除非另外明確定義一 作為任何形式的治愈、減輕、診斷或預防病理學病癥。
在另一方面，本發明和關于其對淋巴細胞增殖，具體地T細胞增殖
的抑制作用，HPGGT在宿主中誘導免疫抑制，并由此可以作為新型免疫
抑制劑來應用。免疫抑制劑可以，例如，用于減小移植后的器官移植排異風險，或用于治療自體免疫疾病，諸如風濕性關節炎、局限性回腸炎或特
應性濕疹。HPGGT的催化活性需要存在谷氨酰胺，以起到y谷氨酰基的供體/受體的作用。因此，包括HPGGT的免疫抑制劑組合物優選地還包括
谷氨酰胺。
而且，本發明人可以顯示用谷氨酰胺、亮氨酸和組氨酸和活性HPGGT預培養應用于淋巴細胞增殖測定的細胞培養基對T細胞表現出抗-增殖作用，甚至在隨后對HPGGT進行失活時。因此，總結出免疫抑制作用是HPPGT依賴性的；然而，尚未確定該作用模式中涉及酶反應的直接或間接產物。因此，本發明的一個實施方案涉及能夠通過優選地，在藥用培養基中，培養HPGGT和谷氨酰胺、亮氨酸和組氨酸和容許HPGGT特異性反應獲得的免疫抑制組合物。然后將該反應的上清液作為合適的免疫抑制組合物應用。優選地，該組合物包括谷氨酰基-肽，例如，通過向所述物質轉移谷氨酰基產生的多-谷氨酰基-谷氨酸(glutamate)或谷氨酰基-衍生物。
本發明包括根據這個方面使用的HPGGT是任何具有本文中所述的特異性酶活性的HPGGT。在這種情況下，術語HPGGT包括野生型HPGGT、全長HPGGT和任何的衍生物和更特別地，其具有這種酶活性的任何片段。本領域中的技術人員可以通過利用本領域中熟知的方法生產所述衍生物和片段。
優選地用于本文時，術語促進淋巴細胞的增殖意指在優選的實施方案中促進淋巴細胞的活化和增殖。
在另一方面，本發明涉及生產HPGGT，更具體地重組HPGGT的方法，所述重組HPGGT缺乏分泌序列(信號肽)或具有非-功能性分泌序列。所述缺乏功能性分泌序列，即氨基酸1-26，在pos. 26和27: LSA-AS之間的分裂位點的HPGGT有利地屬于這樣的范圍，即所述HPGGT在宿主細胞中產生過程中不從所述宿主細胞中分泌出來。根據這個方面，宿主生物體優選地是原核生物，諸如大腸桿菌(E.coli)，然而，不局限于此。本領域中的技術人員已知制備所述缺乏功能性分泌序列的HPGGT的方法。例如，這可以通過表達編碼無分泌前導序列的蛋白質的基因而實現。
所述修飾的HPGGT蛋白應該保持在其宿主細胞中，并由此可以從中純化出來。
在另一方面，本發明涉及按照本發明的多肽和按照本發明的失活HPGGT用于制備抗體的用途。在密切相關的方面，用于免疫動物，從而分別產生抗體和提供起始細胞和細胞系，產生本領域中技術人員已知的雜交瘤細胞系。本領域中技術人員應該承認可以進一步培養和進一步選擇所述雜交瘤。因此，本發明還包括按照本發明的多肽和按照本發明的活性和失活HPGGT用于篩選測定，從而識別產生針對和/或特異性結合按照本發明的多肽和按照本發明的失活HPGGT的抗體的那些雜交瘤細胞系。具體地，可以通過應用HPGGT活性測定進行篩選來選擇雜交瘤，從而識別產生消除HPGGT催化和抑制功能的抗體的雜交瘤。
在另一方面，本發明涉及編碼按照本發明的多肽和按照本發明的失活HPGGT的核酸。本領域中技術人員應該承認已知在宿主生物體中是遺傳密碼和，任選地密碼子來表示所述核酸，本領域中的技術人員可以制備所述核酸。在另一方面，所述核酸包含在載體，優選地表達載體中。在一個實施方案中，術語載體包括質粒、粘粒、病毒、噬菌體和通常用于遺傳工程領域中的其他載體。在另一方面，本發明涉及包括所述載體的宿主生物體。在實施方案中，所述宿主生物體和具體地宿主細胞是重組宿主細胞，其瞬時或穩定地包含本發明的核酸分子或載體。理解宿主細胞或宿主生物體是能夠吸收體外重組DNA并，如果是這種情形，則合成由本發明核酸分子編碼的蛋白質的生物體。優選地，這些細胞是原核或真核細胞，例如哺乳動物細胞、細菌細胞、昆蟲細胞或酵母細胞。優選地，本發明的宿主細胞的特征在于這樣的事實，即引入的本發明的核酸分子對于轉化的細胞而言是異源的，即它不天然存在于這些細胞中，或局限于基因組中的一個位置，該位置與相應的天然存在的序列的位置不同。
本發明的另一個實施方案涉及分離的蛋白質，其表現出HPgGT，優選地，其中正常存在的分泌序列被除去或是非-功能性的，并由本發明的核酸分子編碼的HPgGT的生物學性質，以及涉及用于它們的生產的方法，其中，例如，在容許合成所述蛋白質的條件下培養本發明的宿主細胞和隨后從培養的細胞和/或培養基中分離所述蛋白質。重組生成的蛋白質的分離和純化可以通過常規方法，包括制備性層析法和涉及單克隆或多克隆抗體親合層析法的親合和免疫學分離執行。用于本文時，術語"分離的蛋白質"包括基本無與之天然結合的其他蛋白、核酸、脂質、碳水化合物或其他物質的蛋白。然而，所述蛋白質不僅包括重組產生的蛋白質，還包括分離的天然存在的蛋白質、合成產生的蛋白質、或通過這些方法的組合產生的蛋白質。用于制備所述蛋白質的方法是本領域熟知的。本發明的蛋白質優選地處于基本純化的形式。
因此，本發明還涉及在原核或真核宿主細胞制造蛋白質的一般方法，外部應用時對所述細胞是有害的，所述方法包括(a)在一定條件下培養用編碼所述蛋白質的核酸序列轉染的宿主細胞，所述蛋白質具有刪除的或非-功能性分泌信號序列，所述條件是表達所述蛋白質；和(b)從所述細胞中回收所述蛋白質。也對用編碼按照本發明的多肽的核酸轉染的宿主細胞應用相同的方法，所述多肽是可以從所述細胞中回收的。
應該理解，優選地，可以將按照本發明的抗體、抗促成素、肽適體、
適體和鏡像異構適體認作為針對幽門螺旋菌的Y谷氨酰基轉肽基酶(HPGGT)的配體。
本發明包括術語野生型HPGGT或相似的表述優選地意指野生型的HPGGT，其缺乏分泌序列，但是是催化活性的，更具體地，催化本文中關于HPGGT所述的酶反應。
現在通過附圖和實施例進一步說明本發明，從所述附圖和實施例可以獲得其他特征、實施方案和優點。


圖1A是一個表，其指示根據Kim等和Bumann等9'1Q，從幽門螺旋菌中分泌的具有分子量30-66kDa的蛋白。
圖1B是銀染色后的SDS-PAGE，顯示了來自大小排阻層析的洗脫餾分中的蛋白質，其中只有餾分b-f抑制了人T細胞的增殖，而所有其他餾分沒有；由箭頭標記了與餾分的抑制特征相對應的蛋白質條帶。
圖1C是柱形圖，表示通過如實施例1中所述的分光光度測定確定的凝膠過濾餾分的酶GGT活性。(HP-幽門螺旋菌)。圖2A-C是柱形圖，顯示在通過311-胸苷引入測定確定存在或缺乏指定的HPSN的條件下受刺激的PBMC(A)和分離的初級人T淋巴細胞(C)的細胞增殖；構建的敲除株的GGT表現型是通過酶活性測定和利用針對大GGT-亞單位的多克隆抗體的免疫印跡證實的(B)。為了免疫印跡，使用了 30jiig的HPSN蛋白。對抗-VacA抗體的免疫印跡用作裝載對照(見插入圖)。數據表示三次獨立實驗的平均值± SD。認為如通過StudenU-檢驗確定的+P值〈001是顯著的。(m^幽門螺旋菌，SN:上清液，WT-野生型)。
圖3A和B描述對純化的具有針對其大亞單位的抗-GGT抗體的重組HPGGT餾分銀染色(A)和免疫印跡(B)后的凝膠，其顯示了 GGT的處理。星號表示***原-形式，**大和*小亞單位。
圖3C-3E是柱形圖，其顯示由大腸桿菌中表達的重組HPGGT(rHPGGT)引起的酶活性(C)和人PBMC的增殖抑制(D)。作為對照使用的來自大腸桿菌的LPS不抑制PBMC增殖。重組HPGGT在pH 2-10顯示出催化活性(E)。數據表示三次獨立實驗的平均值士 SD。認為如通過StudenU-檢驗確定的申P值〈.001是顯著的。(FT-流經，ffi^幽門螺旋菌)。圖4A-D是柱形圖，顯示從馬腎中純化的GGT表現出催化GGT活性
(A) 但缺乏針對淋巴細胞的增殖-抑制作用(B)。重組HPGGT在Ser451/452 (S451/452A)處的位點定向誘變消除GGT酶活性(A)和抑制作用
(B) 。用阿西維辛(50pM)在37。C預培養HPWTSN2小時消除GGT活性
(C) 和PBMC增殖的抑制(D)。數據表示三次獨立實驗的平均值士SD。認為如通過Studentf-檢驗確定的申P值<.05是顯著的。(HP-幽門螺旋菌，SN-上清液，WT-野生型)。
圖5A和B是圖表，顯示由PBMC產生的細胞因子IL-2 (A)和IFN-y(B)，如實施例中所述地，這是在通過ELISA24小時后測量的。數據表示三次獨立實驗的平均值土 SD。指示通過Student ,-檢驗確定的P值。
圖5C描述Jurkat T細胞的FACS-分析結果，所述Jurkat T細胞是如所示(灰色曲線)處理了24小時，并用膜聯蛋白V-FITC和碘化丙錠染色的。通過測試10000個事件的FACS-分析確定凋亡Jurkat T細胞的比率。抗癌藥星形孢菌素(空白曲線)，用作陽性對照，在lpM的濃度時強烈誘導凋亡。(^>=幽門螺旋菌，WT^野生型)。
圖6A顯示在存在或不存在指定的HPSN的條件下處理了 24小時的JurkatT細胞的細胞周期分析結果。描述了處于Gl-期(左下)、早和晚S-期(左上和右上)和G2-期(右下)中的細胞的百分比(y-軸BrdU-FITC;x-軸PI)。通過免疫印跡在相同細胞中確定細胞周期調節蛋白的細胞水平。
圖6B是獲自107 PBMC的蛋白質的SDS PAGE,所述PBMC是在不同濃度的HPWT和HPAGGTSN或rHPGGT中培養了 24小時和48小時并隨后被溶解的。通過SDS-PAGE分離并通過免疫印跡分析35pg總蛋白。利用相應的抗體確定指定的蛋白質的水平。以相似結果重新數據2次。(HP-幽門螺旋菌，SN-上清液，WT:野生型)。
圖7是來自幽門螺旋菌陽性(泳道l-9)和陰性(泳道10-14)的血清的免疫印跡，其中通過如實施例1中所述的免疫印跡測試患者是否存在針對HPGGT的抗體。使用兔抗-GGT抗體(aGGT)作為陽性對照。星號表示HPGGT蛋白的"f原-形式和**大亞單位。
圖8是柱形圖，顯示HPGGT抑制淋巴細胞增殖依賴于谷氨酰胺，但不受谷氨酸或g-谷氨酰基谷氨酰胺，也不受谷氨酰胺消耗的介導。用PMA/伊屋諾霉素(除基礎外的所有)刺激并如所示處理PBMC。以2pg/ml使用的Rek. HPGGT在24小時后失活。然后，改變培養基并在刺激后，將HPGGT-處理的培養基加入到PBMC中。同時(未顯示)或也在24小時后，以2mM加入谷氨酰胺，從而研究可能的谷氨酰胺消耗。BPMC刺激后加入谷氨酸或g-谷氨酰基谷氨酰胺，從而研究可能的抑制作用。不具有(w/o)谷氨酰胺的氨基酸用于顯示抑制作用對谷氨酰胺的依賴性。
圖9是圖表，顯示來自免疫的或感染的小鼠的血清對HPGGT酶活性的抑制作用。小鼠受到指定的制劑的免疫，或接受PBS作為對照，或受到活的幽門螺旋菌的感染。免疫或感染后6周時，從尾靜脈獲取血清，并分析針對GGT催化活性的抑制活性。CT—GGT，可溶性CT和失活GGT蛋白，[CT—GGT]enc，包封在微球中的CT和失活GGT蛋白。
實施例1:材料和方法
細菌培養。本研究中使用的幽門螺旋菌野生型菌株G27 WT (VacA+cagA+)獲自A. Covacd (IRIS,錫耶納，意大利)。將該細菌培養在增補了前述登特增補劑抗生素混合物的(Dent supplement antibiotic mix) (Oxoid,Wesel,德國)Wilkins-Chalgren或腦心浸液(BHI)板上。29在增補了 10%FCS(西格瑪，慕尼黑，德國)和1。/。登特增補劑的BHI肉湯中進行HP的液體培養。為了生產HP上清液，使細菌在板上生長48小時，在磷酸鹽緩沖液
(PBS)中清洗3次，并調節至OD6,m為K對應于大約2xl()S個細菌/ml)。在微需氧條件下，在PBS中劇烈搖動培養所述細菌2小時，并通過隨后以3000xg和10000xg離心步驟沉淀去除細菌和膜。隨后，利用超濾濃縮上清液(Amicon UltraMWCO 10kDa,微孔(Millipore) , Schwalbach,德國)。以牛血清清蛋白作為標準，通過布氏測定(Bradfordassay) (Bio-Rad實驗室
(Bio-Rad Laboratories) ， Richmond, VA)測量上清液的總蛋白含量，并保存在-80。C。在Luria肉湯(LB)瓊脂板(USB, Cleveland, OH)上，并且對于液體培養物在具有相關抗生素的LB肉湯中(USB)培養大腸桿菌。
幽門螺旋菌上清液的凝膠過濾層析。如上所述制備來自幽門螺旋菌野生型菌株G27的上清液。如前所述進行大小排阻層析3。簡要地，將500)ig蛋白質加載到Superdex 200 10/300柱(GE衛生保健(GE Healthcare),慕尼黑，德國)上，并在4。C用脫氣的PBS洗脫。標準蛋白a-淀粉酶(200kDa),乙醇脫氫酶(150 kDa),牛血清清蛋白(66 kDa)，和碳酸酐酶(29 kDa)用于進行洗脫的蛋白質的分子量評估。如下所述測試每種餾分的增殖抑制和GGT活性。
生成GGT突變菌株。通過天然轉化將GGT k.o.質粒轉化到幽門螺旋菌菌株G27中。在包含25 jug/ml卡那霉素(西格瑪)的瓊脂板上培養轉化株。3天后，挑取克隆并涂布在具有卡那霉素的新鮮瓊脂板上。質粒的插入是通過細菌 DNA 的 PCR (引物有義鏈5'-AAACGATTGGCTTGGGTGTGATAG-3' (SEQ.ID.No.6); 反義鏈5'-GACCGGCTTAGTAACGATTTGATAG-3' (SEQ.ID.No.7))和來自幽門螺旋菌AGGT上清液的蛋白質的Western印跡證實的。
細胞培養如前所述進行外周血淋巴細胞(PBMC)的分離3。在37。C，5% C02下培養所有的細胞。在具有10% FCS的RPMI 1640 (Invitrogen,Karlsruhe，德國)中培養Jurkat T細胞和PBMC。在增補了 10%馬血清(Cambrex， Verviers,比利時)的DMEM(Invitrogen)培養EL-4 T細胞。
分離初級人T淋巴細胞。通過按照制造商的說明書，使用PanT細胞分離試劑盒II (Miltenyi生物技術(Miltenyi Biotech) , Bergisch Gladbach，德國)，通過陰性選擇，從來自未感染幽門螺旋菌的健康志愿者的暗黃覆蓋層或肝素化的外周靜脈血中分離初級人T細胞。
細胞增殖測定在96-孔平底板的完全培養基中培養細胞(l()SpBMC,純化的初級T細胞或104 Jurkat/EL-4細胞/孔)。用PMA(20ng/ml;西格瑪)和伊屋諾霉素(100ng/ml;西格瑪)一式三份地刺激PBMC，并使所有細胞在具有或不具有指定的幽門螺旋菌上清液或重組蛋白的總蛋白濃度下生長。如上所述用PMA/伊屋諾霉素或用處于1個珠/T細胞的抗-CD3/CD28珠(Invitrogen)刺激初級人T細胞。48小時后，使用Packard直接(3計數器矩陣9600 (Packard Direct Beta Counter Matrix 9600) (Packard儀器公司(Packard Instruments Co) ， Downer's Grove, IL)，通過甲基-[3司-胸苷(GEHealthcare)的引入確定細胞增殖。
制備重組蛋白。按照制造商的說明書，將幽門螺旋菌的GGT蛋白表達為6xHis-標記的蛋白質(Qiagen，Hilden,德國)。通過PCR擴增來自幽門螺旋菌的 GGT 蛋白的編碼區(引物有義鏈5'-TGAAAGGAAAACCCATGGGACGGAG-3' (SEQ:ID.No.8);反義鏈5'-CAAAGGTACCAAATTCTTTCCTTGG-3' (SEQ，ID.No.9))。通過瓊脂糖凝膠電泳分離并通過凝膠提取純化PCR產物(Qiagen)。然而，用Ncol和Kpnl (新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs) , Ipswich, MA)對其進.行限制性酶切，并隨后在重新-純化后將其連接到pQE-Tri系統載體(Qiagen)中。將由此產生的載體轉化到大腸桿菌菌株M15中。用轉化的細菌的過夜培養物接種增補了 lOOpg/ml氨芐青霉素(西格瑪)和25pg/ml卡那霉素的LB肉湯，并在劇烈搖動下，在37。C生長，直到OD,達到0.6。重組HPGGT的表達通過添加最終濃度為lmM的異丙基(3-D-l-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG; Applichem， Darmstadt,德國)受到誘導，并在25。C進行4小時，從而最小化內含體的量。然后，在4。C離心(5000xg)全部培養物10分鐘。為了在自然條件下的細胞溶解，將沉淀溶解在包含蛋白酶抑制劑(關于His-標記的蛋白質的蛋白酶抑制劑混合物，西格瑪)的冰冷的結合緩沖液(20mM Tris/HCl, 500mM NaCl, 20mM咪唑(西格瑪)，pH 7.4)中。然后，通過在液N2中進行的兩個冷凍和融化循環和隨后在冰上進行的超聲波降解法(2xl分鐘超聲波降解，它們之間在冰上間隔5分鐘)溶解細胞。離心(17500xg，在4。C)10分鐘后，對上清液進行DNA和RNA消化。進一步離心步驟(22000xg， IO分鐘，4。C)后，準備上清液，以進行純化。在第一純化步驟中，使用5ml HisTrapHP柱(GE衛生保健(GE Healthcare))。在RT下進行純化，并將樣品始終保持在冰上。將大腸桿菌的溶解產物，以lml/分鐘，加載到Ni-瓊脂糖柱上，并收集流出液。樣品加載后，用10倍柱體積(cv)的結合緩沖液、10倍cv的清洗緩沖液(20mMTris/HCl， 900mMNaCl, 20mM咪唑，pH 7.4)和另外的10倍cv的結合緩沖液清洗該柱。利用階梯式咪唑梯度(100mM階梯)，用洗脫緩沖液(20mMTris/HCl， 500mMNaCl, 100-1000mM咪唑,pH 7.4)洗脫結合的蛋白質。將洗出液收集在一份餾分/階梯度中。然后測試每份餾分的GGT酶活性，并進行SDS-PAGE和免疫印跡分析。為了進一步純化重組的HPGGT，匯集來自Ni-瓊脂糖親合層析的酶活性餾分，在4°C針對20mM Tris/HCl pH 7.5透析1小時，并進行第二純化步驟。將透析的樣品加載到Affi-Gel Blue (BioRad)柱(cv: 12.3ml)上。用2倍cv的結合緩沖液清洗該柱，并用洗脫緩沖液(20mMTris/HCl,50-1000mMNaCl， pH 7.5)，利用階梯式NaCl梯度(50mM階梯)洗脫結合的蛋白質。通過利用抗-GGT抗體的免疫印跡(見下)和通過GGT酶活性測定(見下)分析所有收集的餾分是否存在重組HPGGT。匯集活性餾分，;在4。C針對20mMTris/HClpH7.5透析90分鐘，分成等分試樣，并保存在-80。C直至進一步使用。
位點定向誘變。按照制造商的說明書，利用QuikChange位點定向誘變試劑盒(Stratagene,阿姆斯特丹，荷蘭)進行HPGGT的位點定向誘變。引物 序 列 如 下 W5〃45Z4 有 義 鏈 5'畫CCAATAAGCGCCCTTTAGCCGCCATGTCGCCTACGATTGTG-3，(SEQ.ID:No. 10); W5〃CZ4 反義鏈
5'-CACAATCGTAGGCGACATGGCGGCTAAAGGGCGCTTATTGG-3'(SEQ:ID:No. 11)。通過測序證實了成功的誘變。
免疫印跡。為了免疫印跡分析，使用了 10"urkatT細胞或PBMC。在實驗前，使Jurkat細胞在包含0.2% FCS的培養基中血清缺乏培養18小時。然后，用10。/。FCS釋放并如所述地處理細胞。在指定的時間點處，收獲細胞，用冰冷的PBS清洗一次，重新混懸在包含蛋白酶抑制劑(2.5mM焦磷酸鈉，lmMJ3-甘油磷酸，lmMNa3V04, lpg/ml擬酶醛肽，lmMPMSF;西格瑪)的lx細胞溶解緩沖液Cell Signaling Technology, Danvers, MA)中，并用微尖端超聲波降解器在冰上超聲波處理30秒。在4°C，以lOOOOxg離心溶解產物10分鐘，上清液用于免疫印跡。通過Tricine-SDS-PAGE分離等量的蛋白質(通過Bradford測定確定，BioRad)，并將其電轉移到硝化纖維膜上(BioRad)。為了檢測，用初級抗體抗-p27、抗-細胞周期蛋白D3、抗-細胞周期蛋白E、抗-c-Myc (Dianova,漢堡，德國)，抗-Cdk2(Santa-Cruz生物技術(Santa-CruzBiotechnology),海德堡，德國)，抗-磷-AKT (Ser 473)，抗-磷-c-Raf (Ser 338),抗-磷-p70S6K (Thr 389;細胞信號傳導(Cell Signaling)),抗-磷-FKHRLl/Foxo3 (Thr 32;上州，Placid湖，NY),抗-肌動蛋白(西格瑪)和抗-VacA(南部生物學(Austral Biologicals) , SanRamon, CA)探測膜。利用合適的過氧化物酶綴合的第二抗體(Dianova)和化學發光試劑(Perbio Science, Bonn,德國)顯示初級抗體的結合。為了檢測HPGGT蛋白的大亞單位，使用多克隆兔-抗-GGT抗體，所述抗體是針對包括HP 1118基因產物(Charles River, Kisslegg,德國)的氨基酸殘基356-371的合成肽IQPDTVTPSSQIKPGM產生的。
血清印跡。為了檢測人血清中的HPGGT特異性抗體，通過SDS-PAGE分離0.1 純化的重組HPGGT蛋白，并如上所述轉移到硝化纖維膜上。用麗春紅S溶液(處于H20中的0.2%麗春紅S， 3%三氯乙酸)對該膜進行染色，并切割成條帶。封閉(lxTBS + 5Q/。低脂奶粉)后，在4。C，隨著攪拌，分別用感染和未感染幽門螺旋菌的患者的血清(1:20000稀釋在封閉緩沖液中)培養每個條帶過夜。清洗后，用HRP-綴合的抗-兔二級抗體(Dianova;稀釋1:10000)培養膜條帶，并最后，在另一次清洗步驟后，如上所述，通過化學發光反應顯示血清抗體與HPGGT蛋白的結合。利用常規幽門螺旋菌IgG ELISA評估患者幽門螺旋菌感染的狀況。
細胞周期分析。分析前，使JurkatT細胞(5乂106細胞/分析)在包含0.2% FCS的培養基中血清缺乏培養18小時。用10% FCS釋放并用指定的幽門螺旋菌菌株上清液處理細胞24小時后，通過使用FITC-綴合抗隱BniU抗體(BD生物科學(BD Bioscience),海德堡，德國)，按照制造商的說明書，通過BrdU-FITC/PI(西格瑪)染色，進行細胞周期分析。在隨后的熒光-活化細胞分類器(FACS)分析過程中，利用Becton-DickinsonFACScan流式細胞儀，獲得10000個事件。利用Cell Quest軟件包(生物科學(BD Biosciences))分析數據。
y-谷氨酰基轉肽基酶(GGT)活性測定。根據Mdster等的方法改進了GGT活性的測定。27簡要地，制備由20mM作為受體的甘氨酰甘氨酸(西格瑪)、2.5 mM作為供體物質的L卞谷氨酰基-p-硝基酰苯胺(anilide)(Calbiochem, Schwalbach，德國)和100 mM Tris-HCl (pH 8.0)組成的反應緩沖液。在一些實驗中，測定緩沖液的pH在2-10之間變化。加入不同幽門螺旋菌菌株的上清液、純化的重組HPGGT或馬腎GGT(西格瑪)，且在37°C進行反應30分鐘。通過分光光度法，在405nm處監測p-硝基酰苯胺的釋放。將1活性單位定義為在37°C釋放1 pmol p-硝基酰苯胺/分鐘/mg蛋白的酶量。
ELISA。如所述地處理PBMC(各5xl()S)24小時。在指定的時間點，通過離心去除細胞，并按照制造商的說明書，通過ELISA分析上清液的IL-2 (eBioscience,圣地亞哥，CA)和IFN-y (生物來源(Biosource),索林根,德國)的量。檢測的下限是4pg/ml。
分析凋亡。如所示處理5x105 JurkatT細胞。24小時后，通過離心收獲細胞，清洗，重新混懸在500|^1 AnnexinV-結合緩沖液(10mMHEPES/NaOH, pH7.4, 140mM NaCl， 2.5mM CaCl2)中，并用5pl重組的Annexin V-FITC (Caltag， Burlingame， CA)和0.5pg/ml PI在室溫，黑暗下各染色10分鐘。通過FACS分析測量凋亡的細胞(見上)。利用Cell Quest軟件分析數據。
統計學。將數據表示為平均值士標準偏差(SD)。為了統計學分析，使用Student Mt驗。認為P-值〈0.05是顯著的。
實施例2:確定作為幽門螺旋菌假定T細胞增殖抑制蛋白的GGT
先前顯示了從幽門螺旋菌中分泌的低分子量蛋白抑制T淋巴細胞的增殖。3為了確定免疫抑制因子，對來自幽門螺旋菌菌株G27的上清液進行大小排阻層析。符合先前的工作，只有洗脫具有分子量30-66kDa的餾分抑制淋巴細胞的增殖，而所有其他餾分不抑制(數據未顯示)。
先前，兩個獨立的小組通過不同的蛋白質組技術進行分泌的幽門螺旋菌蛋白的系統分析。9，10利用這些數據，列出了具有分子量30-66 kDa的所有分泌的幽門螺旋菌蛋白(圖1A)。通過SDS-PAGE和銀染色進一步分析所獲得的層析餾分的蛋白質(圖1A)。發現四種具有30-66 kDa尺寸的潛在候選者，其表現出與該餾分的抑制活性特征相匹配的洗脫特征(圖1B;由箭頭表示)。抑制餾分中的所有其他蛋白質條帶也出現在非-抑制的餾分中，并因此可以不對T細胞增殖抑制負責。這四種候選蛋白中的兩種的分子量(圖1B)對應于分泌的幽門螺旋菌蛋白y-谷氨酰基轉肽基酶(GGT,HP1118)的片段。位于60 kDa的第一條帶可能代表GGT-原-形(MW 61kDa)，且位于38kDa的另一個條帶可能代表GGT的大亞單位。"為了研究這些上清液餾分中催化活性HPGGT的存在，進行光度GGT活性測定。圖1C顯示只有抑制淋巴細胞增殖的餾分(b-f)也表現出GGT活性。
實施例3: GGT-缺陷型幽門螺旋菌突變體缺乏抑制T細胞增殖的能力
為了確定GGT是否對觀察到的淋巴細胞增殖抑制負責，產生幽門螺旋菌的同基因GGT敲除突變體。如其他小組所述地，所述突變體正常體外生長，這說明GGT對幽門螺旋菌的存活不是必需的。"，。"測試這些突變體的上清液，以獲得它們與相應的野生型菌株相比，對受到抗-CD3/CD28或PMA/伊屋諾霉素刺激的分離的人T細胞和PBMC的增殖抑制活性(圖2A、 C)。與野生型菌株相反，完全消除了AGGT細菌針對初級人T細胞和PBMC的抑制潛力。為了排除GGT的自發重組和再活化，通過測量酶活性和通過利用我們針對HPGGT的大亞單位生成的多克隆抗體的免疫印跡驗證來自GGT-缺陷型細菌的上清液。加載對照顯示來自野生型和GGT-缺陷型細菌的上清液中存在分泌的VacA蛋白質(圖2B)。因此，GGT對由幽門螺旋菌引起的T細胞增殖抑制負責。
實施例4:重組HPGGT抑制淋巴細胞的增殖。為了進一步顯示觀察到的抑制作用是通過HPGGT單獨介導的，表
達了大腸桿菌中的重組His-標記的HPGGT蛋白。如"材料和方法"部分 中所述，通過層析法將蛋白質純化為同質性。SDS-PAGE和銀染色以及免 疫印跡顯示將重組HPGGT合成為原-形，并隨后分別處理為具有分子量 38和 20kDa的大和小亞單位(圖3A、 B)。重組蛋白質顯示強GGT活 性(圖3C)并有效抑制PBMC增殖(圖3D)。另夕卜，其他實驗顯示HPGGT 在pH2-10范圍內的催化活性(圖3E)支持感染位點存在功能酶。
實施例5: HPGGT的抑制作用依賴于催化GGT活性。
由于GGT也通過哺乳動物細胞包括人T細胞表達，所以我試圖確定 哺乳動物GGT是否也抑制淋巴細胞增殖。從馬腎中純化的GGT表現出催 化活性(圖4A)。然而，與HPGGT相比甚至4倍更高量的馬GGT不能 抑制PBMC增殖(圖4B)。為了探究抑制T細胞增殖是否需要GGT的催 化轉肽基酶活性，我們生成了重組蛋白質的突變體。我們發現將絲氨酸殘 基451和452誘變為丙氨酸(S451/452A)完全消除重組HPGGT的酶活性(圖 4A)，并且還消除淋巴細胞增殖抑制(圖4B)。
為了證實這些結果，用GGT抑制劑阿西維辛預培養來自幽門螺旋菌 野生型菌株G27的重組HPGGT和上清液。該化合物起到GGT的不可逆 轉的競爭性抑制劑的作用。顯示出由阿西維辛引起的GGT抑制涉及其在 結合附著于GGT的指定羥基的抑制種類中的酶后的轉化。14，15酶GGT活 性的測量和淋巴細胞增殖的確定顯示利用阿西維辛的預處理通過幽門螺 旋菌野生型上清液，完全抑制GGT活性(圖4C)和PBMC增殖的抑制(圖 4D)。對重組HPGGT獲得了相似的結果(數據未顯示)。
實施例6: HPGGT在不減少IL-2和IFN，分泌物的條件下和在不誘導凋亡 的條件下抑制淋巴細胞增殖。
至今尚不知HPGGT在抑制宿主免疫應答過程中的作用。本文中報 告的由HPGGT引起的淋巴細胞增殖抑制可以由干擾人PBMC的細胞因子 分泌而產生。為了測試該假說，用PMA和伊屋諾霉素刺激細胞，并在具 有或不具有處于不同濃度的幽門螺旋菌野生型和AGGT上清液或重組HPGGT的條件下進行培養24小時。與受刺激的對照相比，這些處理中沒 有一種導致IL-2分泌物的減少(圖5A)，已知這對于淋巴細胞增殖是必需 的。另外，IFN-Y分泌物沒有減少(圖5B)。因此，我們顯示由HPGGT引 起的T細胞增殖抑制不是由這些細胞減少的活化引起的。先前的報告提示 在胃上皮細胞中由HPGGT誘導氧化壓力和凋亡。12'16然而，尚不知來自 幽門螺旋菌的GGT對淋巴細胞的作用。
另外的報告提示由幽門螺旋菌在T細胞中誘導的凋亡作為通過該細 菌抑制T細胞增殖的機制(Wang等免疫學雜志(J Immunol) 2001)。為了 檢查凋亡是造成由本文所述HPGGT引起的淋巴細胞增殖減少的原因的可 能性，利用JurkatT細胞進行了 Annexin V-FITC/PI染色和隨后的FACS分 析(圖5C)。來自幽門螺旋菌野生型和AGGT菌株的上清液或以導致強烈 淋巴細胞增殖抑制的濃度使用的重組HPGGT均不誘導凋亡的增加。因此， 由HPGGT消除T細胞增殖是由凋亡-依賴性機制介導的。
實施例7: HPGGT對T細胞中的細胞周期進展的作用。
接下來，我們試圖進一步表征HPGGT對T細胞增殖中涉及的細胞 過程的作用。利用BrdU/PI-染色的分析顯示由來自幽門螺旋菌的野生型而 非由GGT-缺陷型上清液誘導的Jurkat T細胞中的Gl細胞周期停滯(圖 6A)。該停滯的特征在于在存在幽門螺旋菌GGT條件下，Gl期(圖6A; 左下象限)中細胞從35°/。增加至46%。因此，在用幽門螺旋菌的野生型而 非GGT-缺陷型上清液處理過程中，與對照(基礎的，55%)相比，S-期(左 上和右上象限)中的細胞量減少至38%。于此相符合地，相同樣品的免疫 印跡分析顯示細胞的細胞周期蛋白D3以及E1蛋白水平的明確減少。另外， Cdk-抑制劑p27Kipl的量以GGT-依賴性方式升高(圖6A)。用10和 5pg/ml HP WT上清液處理的細胞之間的細胞周期蛋白水平的差別說明 為了對抗淋巴細胞增殖，必須超過GGT活性的閾值。這在上清液中總蛋 白濃度為10pg/ml的情形中非常明顯。在較低濃度5pg/ml時，GGT需要 更長時間抑制淋巴細胞中的細胞周期進展。利用重組HPGGT蛋白，我們 觀察到在低至2pg/ml濃度時細胞周期蛋白水平的完全減少。
在人PBMC情形中證實了這些結果，其在受到重組HPGGT或來自幽門螺旋菌野生型而非AGGT菌株的不同濃度上清液處理時，表現出相同
細胞周期調節蛋白甚至更強烈的減少(圖6B)。我們的結果清楚的指出 GGT是造成由幽門螺旋菌誘導的T淋巴細胞中的Gl細胞周期停滯的因 素。
實施例8:在T細胞中用Ras-依賴性信號傳導干擾HPGGT。
Ras-和PI3K-依賴性途徑是細胞周期進展的關鍵調節子。由于顯示出 這些途徑在T細胞中不彼此依賴地發生17，我們研究了幽門螺旋菌上清液 以及重組HPGGT對這兩個途徑中重要成員活化狀態的影響。免疫印跡分 析來自Jurkat T細胞和PBMC的細胞溶解產物顯示AKT、 p70S6k和Foxo 3,即PI3K-信號傳導的重要介體的細胞水平和磷酸化在存在HPGGT的條 件下不減少(圖6A)。相反，c-Myc的細胞水平以及c-Raf蛋白，艮卩Ras-依賴性途徑的中心介導子的磷酸化在相同細胞中存在HPGGT的條件下減 少(圖6A、 B)。
實施例9:針對HP-陽性患者血清中HPGGT的抗體應答
盡管顯示出來自幽門螺旋菌的GGT由該細菌分泌到細胞外的培養 基中(Bumann等)，但是該蛋白質是否到達固有層中的T細胞，從而發揮 其免疫抑制作用尚不清楚。為了解決這個問題，我們測試了來自14名患 者(9名感染幽門螺旋菌的和5名未感染幽門螺旋菌的)的血清是否存在 HPGGT特異性抗體。結果顯示在幽門螺旋菌-陽性(圖7， 1-9)而非未感 染的患者(圖7， 10-14)中針對HPGGT的原形和大亞單位的強烈抗體應 答，這提示了HPGGT與人免疫系統的相互作用。
實施例10:免疫而非感染后針對HPGGT的抑制免疫應答
用位于距幽門螺旋菌Y-谷氨酰基-轉肽基酶(HPGGT)的催化中心遠 程(fare distance)的肽356 IQPDTVTPSSQIKPGM 371或用與作為佐劑的 CT聯合的失活重組HPGGT蛋白接種動物。只有在用HPGGT失活形式接 種的動物中，血清中的抑制性抗體是可以利用標準HPgGT活化測定檢測 的。在僅接受緩沖液的對照動物中、在感染的動物中或在用肽356-371接種的動物中沒有檢測到抑制性免疫應答。這些結果證明針對HPGGT的抑 制性免疫應答是可以實現的，且高度依賴于抗原的選擇。此外，幽門螺旋 菌的感染不引起所述抑制性應答。 結果顯示在圖9中。
參考文獻
本文中利用編號參考的現有技術文獻如下，并將其全文引入本文作 為參考。
1. Blaser, M.J, Atherton, J.C.幽門螺旋菌的持久性生物學和疾病
(Helicobacter pylori persistence: biology and disease). 臨床石開究雜 志(J Clin Invest.) 2004;113:321-333.
2. Ermak TH, Giannasca PJ, Nichols R, Myers GA, Nedrud J， Weltzin R, Lee CK, KIeanthous H, Monath TP.用脲酶疫苗免疫小鼠在缺乏抗體 的條件下提供針對幽門螺旋菌感染的保護并且受到MHC類II-限制 的應答的介導(Immunization of mice with urease vaccine affords protection against Helicobacter pylori infection in the absence of antibodies and is mediated by MHC class Il-restricted responses).實驗 醫學雜志(JExpMed.) 1998;188:2277-2288.
3. Gerhard M, Schmees C, Voland P, Endres N, Sander M， Reindl W, Rad R, Oelsner M, Decker T, Mempel M, Hengst L， Prinz C.從幽門蟲累方定菌 中分泌的低分子量蛋白誘導T細胞的細胞周期停滯(A secreted low-molecular-weight protein from Helicobacter pylori induces cell-cycle arrest of T cells).胃腸病學(Gastroenterology) .2005; 128: 1327-1339.
4. Knipp, U., Birkholz， S., Kaup, W., Opferkuch， W.由幽門螺旋菌產生 的細胞增殖-抑制蛋白的部分特征(Partial characterization of a cell proliferation-inhibiting protein produced by Helicobacter pylori).感染禾口 免疫學(InfectImmun.) 1996;64:3491-3496.5. Gebert, B., Fischer, W., Weiss, E.， Hoffmann, R., Haas, R.幽門螺旋菌 空泡細胞毒素抑制T淋巴細胞活化(Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin inhibits T lymphocyte activation).禾斗學(Science). 2003; 301: 1099-1102.
6. Sundrud, M.S., Torres, V丄，Unutmaz， D., Cover, T丄.幽門螺旋菌空 泡細胞毒素對初級人T細胞增殖的抑制與VacA對IL-2分泌物的作 用無關(Inhibition of primary human T cell proliferation by Helicobacter pylori vacuolating toxin (VacA) is independent of VacA effects on IL-2 secretion).美國國家科學院學報(Proc Natl Acad Sci U S A) .2004; 101: 7727-7732.
7. Atherton, J.C,, Peek, R.M. Jr.， Tham, K.T., Cover, T丄.，Blaser， M丄 VacA即幽門螺旋菌的空泡細胞毒素基因中異質性的臨床和病理學 重要性(Clinical and pathological importance of heterogeneity in vacA, the vacuolating cytotoxin gene of Helicobacter pylori). 胃腸病學
(Gastroenterology) . 1997; 112:92-99.
8. Rad R, Gerhard M, Lang R, Schoniger M, Rosch T, Schepp W, Becker I， Wagner H, Prinz C.幽門螺旋菌血液組抗原-結合粘著素促進細菌定 居并增加非特異性免疫應答(The Helicobacter pylori blood group antigen-binding adhesin facilitates bacterial colonization and augments a nonspecific immune response).免疫學雜志(J Immunol.) 2002; 168: 3033-3041.
9. Kim N, Weeks DL, Shin JM， Scott DR, Young MK, Sachs G.幽門螺旋 菌體夕卜釋放的蛋白質(Proteins released by Helicobacter pylori in vitro). 細菌學雜志(JBacteriol.) 2002;184:6155-6162.
10. Bumann D, Aksu S, Wendland M， Janek K， Zimny-Arndt U， Sabarth N， Meyer TF， JungblutPR.胃病原體幽門螺旋菌的分泌蛋白的蛋白質組 分木斤(Proteome analysis of secreted proteins of the gastric pathogen Helicobacter pylori).感染禾口免疫學(Infect Immun.) 2002; 70: 3396-3403.11. Chevalier, C.， Thiberge, J.M., Ferrero， R.L.， Labigne， A.幽門螺旋菌Y -谷氨酰基轉肽基酶對小鼠胃黏膜定居的基本作用(Essential role of Helicobacter pylori y-glutamyltranspeptidase for the colonization of the gastric mucosa of mice).分子微生物學(Mol Microbiol.) 1999; 31: 1359-1372.
12. Shibayama K, Kamachi K, Nagata N, Yagi T, Nada T， Doi Y， Shibata N, Yokoyama K， Yamane K, Kato H， Iinuma Y, Arakawa Y.來自幽門螺 旋菌的一種新型凋亡-誘導蛋白(A novel apoptosis-inducing protein from Helicobacter pylori).分子微生物學(Mol Microbiol.) 2003; 47: 443-451.
13. McGovern KJ, Blanchard TG, Gutierrez JA， Czinn SJ, Krakowka S, YoungmanP. Y-谷氨酰基轉移酶是幽門螺旋菌的毒力因子但不是定 居所必需的(y- glutamyltransferase is a Helicobacter pylori virulence factor but is not essential for colonization).感染禾口免疫學(Infect Immim.) 2001;69:4168-4173.
14. Stole, E., Smith, T.K., Manning, J.M., Meister， A. y-谷氨酰基轉月太基酶 禾口阿西維辛的相互作用(Interaction of glutamyltranspeptidase with acivicin) 生物化學雜志(JBiolChem.) 1994;269:21435-21439.
15. Smith, T.K., Ikeda, Y.， Fujii， J" Taniguchi, N., Meister， A.阿西維辛結 合的不同位點和Y-谷氨酰基轉肽基酶的失活(Different sites of acivicin binding and inactivation of y-glutamyltranspeptidases ).美國國 家科學院學報(proc Natl Acad Sd USA) 1995; 92: 2360-2364.
16. Busiello I， Acquaviva R, Di Popolo A, Blanchard TG, Ricci V, Romano M, Zarrilli R.幽門螺旋菌y-谷氨酰基轉肽基酶上調COX-2和EGF-相關肽在人胃細胞中的表達(Helicobacter pylori Y_ glutamyltranspeptidase upregulates COX-2 and EGF-related peptide expression in human gastric cells).細胞微生物學(Cell Microbiol.) 2004; 6: 255-267.
17. Genot E, Reif K, Beach S, Kramer I, Cantrell D.在T淋巴細胞中 p21ras起始Rac-1而非磷脂酰肌醇3激酶/PKB，介導的信號傳導(p21ras initiates Rac-l but not phosphatidyl inositol 3 kinase/PKB， mediated signaling pathways in T lymphocytes).致癌基因(Oncogene ) 1998; 17:1731-1738.
18. Riou, J.Y., Buissiere, J,, Richard, C.， Guibourdenche， M. "Neisseriaceae"家族中的 ？谷氨酰基-轉移酶活性
(Y-Glutamyl-transferase activity in the family "Neisseriaceae").微生 物學記錄(Ann Microbiol)(巴黎).1982; 133:387-392.
19. Suzuki, H., Kumagai， H.， Tochikura, T.分離、遺傳繪圖、和表征缺乏 谷氨酰基轉肽基酶的大腸桿菌K-12突變體(Isolation, genetic mapping, and characterization of Escherichia coli K-12 mutants lacking
glutamyltranspeptidase). 細菌學雜志(JBacteriol.) 1987; 169: 3926-3931.
20. Xu, K., Strauch， M.A..枯草桿菌中編碼Y-谷氨酰基轉肽基酶的基因 的i只另U、序歹ll禾口表達(Identification, sequence, and expression of the gene encodingglutamyltranspeptidase in Bacillus subtilis).細菌學雜 志(JBacteriol.) 1996;178:4319-4322.
21 Ikeda, Y.， Fujii， J,， Anderson, M.E., Taniguch，i N.， Meister， A.人y-谷 氨酰基轉肽基酶催化作用中涉及Ser-451和Ser-452 (Involvement of Ser-451 and Ser-452 in the catalysis of human
Y-glutamyltranspeptidase).生物化學雜志(JBiolChem.) 1995; 270: 22223-22228.
22. SherrCJ. G期進展提示的循環變化(phase progression: cycling on cue).細胞(Cell) .1994;79:551-555.
23. TakuwaN, Takuwa Y.由Ras效應子系統調節細胞周期分子
(Regulation of cell cycle molecules by the Ras effector system ). 分子細胞內分泌學(Mol Cell Endocrinol) . 2001; 177: 25-33.
24. Sherr CJ, Roberts JM. CDK抑制劑Gl-期進展的陽性和陰性調節劑
(CDK inhibitors: positive and negative regulators of Gl-phase progression) 基因發育(Genes Dev.) 1999;13:1501-1512.25. KerkhoffE,HoubenR, LofflerS，Troppmair J,LeeJE, RappUR.由 Ras/Raf f言號4專導i周節c-myc表達(Regulation of c匿myc expression by Ras/Raf signaling),致癌基因(Oncogene) .1998;16:211-216.
26. Oster SK, Ho CS， Soucie EL, Penn LZ. Myc致癌基因MarvelouslY 復合物(The myc oncogene: MarvelouslY Complex).現代癌癥研究
(Adv Cancer Res) . 2002; 84: 81-154.
27. Meister， A., Tate, S.S., Griffith, O.W. r-谷氨酰基轉肽基酶(y_ glutamyltranspeptidase).酶學方t去(Methods Enzymol.) 1981; 77: 237-253.
28. Glupczynski, Y., Megraud, F., Lopez-Brea, M.， Anderson, L.P.體夕卜抗 菌劑在幽門螺旋菌中抗性的歐洲多通道調查(Europeanmulticenter survey of /" W/ro antimicrobial resistance in Z/e/z'coZ ac^"/oW).
歐洲臨床微生物學和傳染病雜志(￡^/(^>7滅^0&'0//"/6"/^).
2001;20:820-823.
29. Gerhard M， Lehn N, Neumayer N, Boren T, Rad R, Schepp W, Miehlke S， ClassenM,PrinzC.幽門螺旋菌基因對血液-組抗原-結合粘著素的 臨床相關性(Clinical relevance of the Helicobacter pylori gene for blood-group antigen-binding adhesin).美國國家禾斗學院學報(Proc Natl Acad Sci U S A) 1999; 96: 12778-12783.
30. Zabaleta J， McGee DJ， Zea AH, Hernandez CP， Rodriguez PC, Sierra RA, Correa P， Ochoa AC. 幽門螺旋菌精氨酸酶抑制 T細胞增殖并減少TCR;-鏈(CD3;)的表達(Helicobacter pylori arginase inhibits T cell proliferation and reduces the expression of the TCR zeta-chain (CD3zeta) ) . J Immunol. 2004 Jul l;173(l):586-93.
31. Boanca G, Sand A.， Baiycki J丄，分開幽門螺旋菌，谷氨酰基轉肽基 酶的酶活性和自體處理活性(Uncoupling the Enzymatic and Autoprocessing Activities of //e//co6a"er _p_y/oh y-Glutamyltranspeptidas).生物化學雜志(The Journal of Biological Chemistry) , 2006年7月14日,巻281, No. 28
Schmees C, Prinz C, Treptau T， Rad R, Hengst L， Voland P, Bauer S,Brenner L, Schmid RM， Gerhard M由幽門螺旋菌y-谷氨酰基轉肽基 酶抑制T細胞增殖(Inhibition of T cell proliferation by He"coZ "cfer y隱glutamyltranspeptidase).胃腸病學(G2strae"tera/c^). 2007 年5月；132(5):1820-33
說明書、權利要求和/或附圖中公開的本發明特征可以獨立地和以其 任何組合作為以其多種形式實現本發明的材料。
權利要求
1.包括氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列與由包括對應于SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的HPGGT區域的一段連續氨基酸序列至少80％相同，其中所述區域通過以下各項定義(a)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或(b)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，和其中所述多肽適合于引起能夠抑制HPGGT催化活性的免疫應答。
2. 按照權利要求1的多肽，其中所述多肽包括約15-約30個氨基酸。
3. 多肽，優選地，按照權利要求1或2的多肽，其中所述多肽包括對應于下列各項的氨基酸序列-(a) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或(b) 按照SEQ.ID.No. 1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480， 其中所述多肽包括約15-約30個氨基酸。
4. 按照權利要求3的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列對應于所述位 置的一段15-30個連續氨基酸的序列。
5. 按照權利要求1-4中任一項的多肽，其中所述多肽包括選自包括下 列各項組中的一個序列QRQAETLKEARERFLKY (SEQ.ID.No. 2), FDIKPGNPNLYGLVGGDANAI (SEQ.ID.No. 3), DFSIKPGNPNLYGLVGGDANA正ANKRPL (SEQ.ID.No.4)禾口 SSMSPTIVLKNNKVFLVVGSP (SEQ.ID.No.5)
6. 免疫原性組合物，包括一種或數種按照權利要求1-5中任一項的多肽。
7. 免疫原性組合物，包括HPGGT的失活形式。
8. 免疫原性組合物，包括HPGGT的片段，其中所述片段由包括 HPGGT的氨基酸451和452的一段連續氨基酸序列組成。
9. 按照權利要求6-8中任一項的免疫原性組合物，其中所述組合物用 于動物或人的疫苗接種。
10. 按照權利要求6-9中任一項的免疫原性組合物，其中所述組合物能夠在動物或人中誘導免疫應答。
11. 按照權利要求6-10中任一項的免疫原性組合物，其中所述免疫應 答是抗體應答。
12. 按照權利要求6-11中任一項的免疫原性組合物，其中所述抗體應 答包括對HPGGT，更優選地，對HPGGT的特異性活性具有抑制作用和/ 或對淋巴細胞增殖的HPGGT依賴性抑制具有消除作用的抗體。
13. 按照權利要求6-12中任一項的免疫原性組合物，其中所述組合物 用于在患有幽門螺旋菌(//. j^/on')感染或處于發展幽門螺旋菌感染風險 中的患者中促進淋巴細胞的活化和增殖。
14. 按照權利要求13的免疫原性組合物，其中所述淋巴細胞是B或T 細胞。
15. 按照權利要求6-14中任一項的免疫原性組合物，其中所述組合物 包括一種或數種佐劑。
16. 按照權利要求6-15中任一項的免疫原性組合物，其中所述組合物 包括一種或數種來自幽門螺旋菌的抗原。
17. 按照權利要求16的免疫原性組合物，其中所述抗原選自包括外膜 蛋白的組。
18. 按照權利要求17的免疫原性組合物，其中所述抗原選自包括 HpaA、 Ompl8和其組合的組。
19. 按照權利要求6-18中任一項的免疫原性組合物，其中所述組合物 用于預防和/或治療由幽門螺旋菌引起的或與之相關的疾病，更優選地，由 幽門螺旋菌感染引起的或與之相關的疾病。
20. 按照權利要求19的免疫原性組合物，其中所述疾病選自包括下列 各項的組幽門螺旋菌感染、由幽門螺旋菌引起的胃與十二指腸病癥、胃 炎、慢性胃炎、胃或十二指腸潰瘍、胃癌和(MALT)淋巴瘤。
21. 按照權利要求6-20中任一項的免疫 性組合物，其中所述免疫原 性組合物是疫苗。
22. 按照權利要求1-5中任一項的多肽用于制備藥物的用途。
23. 按照權利要求6-21中任一項的免疫原性組合物用于制備藥物的用途。
24. 按照權利要求22-23中任一項的用途，其中所述藥物是疫苗。
25. 按照權利要求22-24中任一項的用途，其中所述藥物用于預防和/ 或治療由幽門螺旋菌引起的或與之相關的疾病，更優選地，由幽門螺旋菌 感染引起的或與之相關的疾病。
26. 按照權利要求1-5中任一項的多肽用于檢測樣品中抗體的用途， 其中所述抗體針對HPGGT。
27. 按照權利要求26的用途，其中所述抗體能夠抑制HPGGT酶活性 和/或HPgGT對淋巴細胞增殖的抑制活性。
28. 特異性結合按照權利要求1-5中任一項的多肽的抗體。
29. 按照權利要求28的抗體，其中抗體具有對HPGGT，更優選地， 對HPGGT的特異性活性的抑制作用和/或對淋巴細胞增殖的HPGGT依賴 性淋巴細胞抑制的消除作用。
30. 編碼按照權利要求28-29中任一項的抗體的核酸。
31. 特異性結合按照權利要求1-5中任一項的多肽或結合HPGGT的片 段的核酸，其中所述片段由包括HPGGT的氨基酸451和452的一段連續 氨基酸序列組成，其中所述核酸分子選自包括適體和鏡像異構適體的組。
32. 按照權利要求31的核酸，其中所述核酸具有對HPGGT，更優選 地，對HPGGT的特異性活性的抑制作用和/或對淋巴細胞增殖的HPGGT 依賴性抑制的消除作用。
33. 按照權利要求28-29中任一項的抗體用于制備藥物的用途。
34. 按照權利要求31-32中任一項的核酸用于制備藥物的用途。
35. 按照權利要求33-34中任一項的用途，其中所述藥物用于治療和/ 或預防由幽門螺旋菌引起的或與之相關的疾病，更優選地，由幽門螺旋菌 感染引起的或與之相關的疾病。
36. 用于確定治療疾病的候選藥物的方法，所述方法包括評估候選藥 物的下列各項的步驟a.對幽門螺旋菌的Y-谷氨酰基轉肽基酶的特異性活性的抑制作用和b.對淋巴細胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除作用。
37. 按照權利要求36的方法，其中所述疾病是由幽門螺旋菌引起的或 與之相關的疾病，更優選地，由幽門螺旋菌感染和更優選地，人中的幽門 螺旋菌感染引起的或與之相關的疾病。
38. 用于開發疫苗的方法，所述方法包括下列步驟a) 提供包括HPGGT或其至少一個片段的免疫原性組合物；b) 用所述免疫原性組合物免疫動物，并由此產生抗體；c) 評估所述抗體關于它們對幽門螺旋菌的丫-谷氨酰基轉肽基酶的特 異性活性的抑制作用和它們對淋巴細胞增殖的HPGGT依賴性抑制的消除 作用和d) 選擇合適的免疫原性組合物。
39. 按照權利要求38的方法，其中所述疫苗是針對人中幽門螺旋菌感 染的疫苗。
40. HPGGT的配體制備用于預防和/或疾病的藥物的用途，其中所述配 體顯著抑制HPGGT活性并消除淋巴細胞增殖的HPGGT依賴性抑制。
41. 按照權利要求40的用途，其中所述疾病是由幽門螺旋菌引起的或 與之相關的疾病，更優選地，由幽門螺旋菌感染引起的或與之相關的疾病。
42. 按照權利要求40-41中任一項的用途，其中所述配體是按照權利 要求28或29中任一項的抗體，或按照權利要求31-32中任一項的核酸。
43. 按照權利要求40或42中任一項的用途，其中在淋巴細胞增殖測 定中評估淋巴細胞增殖。 —
44. HPGGT用于制備免疫抑制組合物的用途。
45. 免疫抑制組合物，所述免疫抑制組合物是在容許HPGGT特異性 活性的培養基中培養HPGGT和谷氨酰胺后作為上清液獲得的。
全文摘要
本發明涉及包括氨基酸序列的多肽，其中所述多肽的氨基酸序列與包括對應于SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的HPGGT區域的一段連續氨基酸序列至少80％相同，其中所述區域通過以下各項定義(a)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置150-200，或(b)按照SEQ.ID.No.1的氨基酸序列的氨基酸位置410-480，和其中所述多肽適合于引起能夠抑制HPGGT催化活性的免疫應答。
文檔編號G01N33/50GK101594880SQ200780046762
公開日2009年12月2日 申請日期2007年10月19日 優先權日2006年10月19日
發明者克里斯蒂安·施梅斯, 馬爾庫斯·格哈德 申請人:馬爾庫斯·格哈德