使用吸附于濾紙上的樣品的篩選方法

專利名稱：：使用吸附于濾紙上的樣品的篩選方法使用吸附于濾紙上的樣品的篩選方法發明領域本發明公開了一種診斷試驗和方法，其用于將血液或者另一種生物液(biologicalfluid)或樣品與試驗化合物混合，并將血液點樣在濾紙上以便隨后分析試驗化合物對血液或液體樣品的作用。一般背景血液是主要由血漿和細胞組成的復雜的混合物(1-3)。通過離心和其他技術可將血漿與細胞分離。如果將血漿靜置，它將通過凝固凝結成塊，從而可分離血清與血凝塊。可通過加入不同的抗凝劑(包括EDTA、EGTA、肝素、檸檬酸鹽和其他劑)抑制凝固。血液的細胞包括樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞、紅細胞以及包括造血干細胞的各種干細胞。此外由巨核細胞產生的血小板也大量存在。血漿含有上千種蛋白質，基本上含有人類蛋白質組的任何蛋白(4，5)。其中一些蛋白參與運輸、血液凝塊或免疫防御，而其他的起到血液細胞和組織細胞間信號分子的功能。尤其，免疫系統的細胞(樹突細胞、巨噬細胞、T細胞、B細胞、自然殺傷細胞)的活性通過信號分子(例如，白細胞介素、趨化因子、生長因子)、組織抗原和受體的復雜網絡來調控(3,6-9)。免疫系統細胞的活性和特異性可通過幾種方法和測定來研究和定量。T細胞、B細胞和其他細胞可通過使用細胞表面標記分子的抗體的熒光激活細胞分選術定量(10，11)。特異的T細胞可通過細胞毒性測定、鉻釋放測定和細胞因子釋放測定(例如ELISPOT)(12-16)以及通過使用不同的肽-主要組織相容性復合物(MHC)蛋白構建體(constmct)來測量(17,18)。B細胞的活性可通過測定從B細胞釋放的特異性抗體的水平來測量(19，20)。測量從血液細胞釋放的信號分子中的主要問題是與定量相關的貯藏和運輸的問題。許多血液成分(例如細胞因子)是不穩定并短壽命的，導致其在孵育、貝i藏和運輸期間降解。由于這一原因，比較性分析和診斷試驗必須在中心實驗室的血液收集和孵育后立刻完成。理想地，所有待比較的樣品應使用校準的儀器連續分析。這并不總是可行的，例如，當在偏遠地區采集血液樣品時，當進行體外和體內時間性研究時或當比較來自大量不同個體的樣品時。這一問題的一種解決方法是在運輸和貯藏時冷凍樣品。然而，這一方法不能保證成分的保存，需要巨大的冷凍、運輸和貯藏容量，需要在每次進行分析時解凍、并且容易受到電力供應短缺的損害。由于這一原因，需要血液和生物樣品保存的可靠方法，并且需要采用可靠的樣品保存與樣品處理結合的診斷試驗。使用濾紙進行血液點樣以用于隨后的分析是眾所周知的，例如用于新生兒血液樣品的遺傳代謝疾病分析(21)。這樣的優點是血液成分的良好保存、容易運輸和容易長期lt藏。然而在與試驗化合物孵育后使用濾紙以及類似方法來干燥和貯藏血液樣品以前尚未#皮^使用或描述過，可能因為這被預期為不可能或不可行的。發明概述本發明公開了一種診斷試驗和方法，其用于將血液或另一種生物液與試驗化合物混合，并將血液點樣在濾紙上以便干燥、保存和隨后在此后的任何時間分析試驗化合物對血液的作用。發明的詳細公開內容本發明公開了一種診斷試驗和方法，其包括將血液或另一種生物液樣品與試驗化合物混合，并將血液點樣在濾紙上以便隨后分析試驗化合物對血液的作用。所述生物液可以是腦脊液、腹膜液(peritonealfluid)、嚢液(cystfluid)、羊膜液(amnioticfluid)、灌洗液(lavagefluid)、唾液、細胞提取液或組織提取液。所述化合物在以下中選擇氨基酸、肽、蛋白質、糖、寡糖、多糖、糖蛋白、脂質、脂蛋白、粘多糖、激素、類固醇、維生素、影響血液而導致血液組成改變的低分子量合成或天然化合物，例如毒素、變應原、自身抗原、細菌蛋白或多糖、病毒蛋白、真菌蛋白或多糖、寄生蟲蛋白或多糖、細菌脂多糖或與疾病相關的任何其他化合物。依照本發明的診斷試驗和方法分析樣品的細胞因子、趨化因子和生長因子和/或神經遞質以及其他多肽和蛋白的含量，所述蛋白例如CRP、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、特異性(即抗原特異性)抗體、運鐵蛋白、白蛋白和/或運曱狀腺素蛋白。在診斷試驗中，通過免疫測定、生物測定、質譜分析法、HPLC、GC、GC-MS來分析試驗化合物的作用，這些測定和分析法例如ELTSA測定、FLISA測定、DELFIA測定、Luminex測定、發光測定、電化學發光測定、閃爍親近測定(scintillationproximityassay)、》文射免疫測定、MALDI-MS、ESI-MS和開放式MS(ambient-MS)(例如DESI-MS)。本發明還公開了用于將血液或者另一種生物液或樣品與試驗化合物混合，并將所述混合物點樣在濾紙上以便在隨后分析試驗化合物對所述血液、生物液或樣品的作用之前貯藏、運輸和/或處理的方法。定義分析物意指可通過分析方法檢測或定量的任何化合物。試驗化合物的作用纟皮理解為其和血液或者任何其他生物液或樣品的成分相互作用以導致血液組成的任何種類的變化。干燥意指水的去除。濾紙意指適于收集、干燥并貯藏血液的任何一張紙、布或其他材料。PKU紙意指用于對新生兒的血液樣品進行苯丙酮尿癥篩選的紙/濾紙。點樣意指將血液樣品或者任何其他生物液或提取液或樣品施加在一張適于精確血液采樣的標準化紙上。通過將固定體積的血液施加在一張紙上或通過將血液施加于紙直到已界定的區域辟皮血液覆蓋來進行點樣。接下來，將所述紙完全千燥并在低濕度條件下直接貯藏或運輸至貯藏處以便進行隨后的分析。試^Mt合物意指可與血液或者任何其他生物液或樣品混合或者可被加入其中的任何化學的、生物的或自然界的化合物或物質。試驗樣品意指試驗化合物的任何制劑或混合物。使用了以下的縮寫BCG意指卡介苗(BacillusCalmette-Guerin)BDNF意指腦源性神經營養因子BSA意指牛血清白蛋白CRP意指C反應蛋白DBSS意指干血斑點樣品(driedbloodspotsample)EGF意指表皮生長因子ELISA意指酶聯免疫吸附測定ELISPOT意指酶:f關免疫斑點測定ESI意指電噴霧電離FLISA意指熒光免疫吸附測定(fluorescence-linkedimmunosorbentassay)GC意指氣相色語G-CSF意指粒細胞集落刺激因子GM-CSF意指粒細胞巨噬細胞集落刺激因子HPLC意指高效液相色語IFN意指干擾素Ig意指免疫球蛋白IGF意指胰島素樣生長因子Il意指白細胞介素LPS意指脂多糖MALDI意指基質輔助激光解吸/電離M-CSF意指巨噬細胞集落刺激因子MCP意指單核細胞趨化蛋白MHC意指主要組織相容性復合物MIF意指巨噬細胞移動抑制因子MIP意指巨噬細胞炎性/抑制蛋白MMP意指基質金屬蛋白酶MS意指質譜分析法NT意指神經營養蛋白PBS意指磷酸鹽緩沖鹽水(phoaphate-bufferedsaline)PCR意指聚合酶鏈反應PKU意指苯丙酮尿癥(phenylketoneuria)PPD意指純化蛋白衍生物TGF意指轉化生長因子TNF意指腫瘤壞死因子TREM意指骨髓細胞上表達的觸發受體VEGF意指血管內皮生長因子本發明公開了一種診斷方法，其中起動試驗化合物和血液樣品或者任何其他生物液或樣品之間的反應，使反應持續一定時間，然后通過將試驗樣品在濾紙上點樣和/或干燥結束反應，接著將所述濾紙隨后用于分析試驗化合物對血液、液體或樣品以及它們的^壬何成分的作用。在一個優選的實施方案中，使用標準的抗凝固EDTA、肝素或檸檬酸鹽(citrate)血液容器或玻璃器皿從人抽取血液樣品(例如10ml)。血液樣品被分為兩等4分，并將試驗化合物加入血液的一個等份中，而另一個等份被用作對照參考，其中只加入溶解試驗化合物的緩沖液/溶液。試驗化合物還可作為固體粉末加入，以直接溶解在血液中。伴隨或不伴隨混合或攪拌，將血液樣品于室溫或規定的溫度(例如5°C、20°C、37°C)孵育。于一定時間間隔(例如0、lmin、2min、5min、10min、20min、30min、lh、2h、3h、4h、5h、10h、15h、20h、24h、48h)從血液樣品抽取等份并點樣在濾紙(例如，PKU紙)上，并使其盡快干燥。干燥之后，可將濾紙立即用于分析或貯藏以用于隨后的分析。在一個特定實施方案中，在于實驗室中貯藏或分析前，濾紙可^皮運輸(例如通過平信)一定的距離。如下完成血液的點樣、千燥和貯藏用毛細管、吸液管或類似物將血液在濾紙上點樣成一層，并于室溫(例如在通風良好的櫥內或在開放位置(ambientplace))干燥。為了貯藏，可將濾紙保存在紙信封、塑料袋或類似的容器，優選氣密容器中以保持盡量低的濕度。-20°(:或更低的貯藏溫度是優選的，但只要保持紙千燥，室溫也是可以的。無論如何，只要保持低的濕度以避免樣品的變質，貯藏就可以于室溫或低于0。C的溫度(例如-20"C、-50°C、-80。C、-180。C)下進行。可將樣品保存持久的一段時間(例如幾個月-幾年)。試驗化合物可以是影響血液而導致血液組成產生可測量變化的任何化合物(例如，氨基酸、肽、蛋白質、糖、寡糖、多糖、糖蛋白、脂質、脂蛋白、粘多糖、激素、類固醇、維生素、低分子量的合成或天然化合物)。尤其有用的試驗化合物是毒素、變應原、自身抗原、細菌蛋白和多糖、病毒蛋白、真菌蛋白和多糖、寄生蟲蛋白和多糖、細菌脂多糖和與疾病相關的任何其他化合物。使用這些試驗化合物將得到關于某些化合物如何對細胞以及細胞間的信號起作用的重要知識。在一個實施方案中，所述診斷試驗和方法用于測定有毒化合物對血液的作用，例如作為毒理學試驗程序或臨床前的試驗程序的部分。可通過大量不同的技術(例如免疫測定、生物測定、質譜分析法、HPLC、GC、GC-MS)來進行千血樣品的分析。優選的分析方法是ELISA測定、FLISA測定、DELFIA測定、Luminex測定、發光測定、電化學發光測定、閃爍親近測定、；故射免疫測定、MALDI-MS、ESI-MS、PCR。可通過使用任何適合的緩沖液或溶劑來進行DBSS的提取。在一個優選的實施方案中，從濾紙上的DBSS或標準物中穿孔取出濾紙圓片(例如直徑為3.2mm)，并將其一起放于微量滴定孔中。將或180^1(分別用于兩份或三份測量)提取緩沖液、含有"具有乙二胺四乙酸(EDTA)的完全蛋白酶抑制劑混合物，，(Roche,Germany)的PBS(每25ml測定緩沖液(含有0.5%Tween20和1%BSA的PBS)溶解1片)力。至每個孔，并在設定為600rpm的平板振蕩器上于室溫避光提取分析物60分鐘。在本發明的一個實施方案中，通過Luminex測定如下測量分析物依照制造商的使用說明書進行捕獲抗體對羧基化珠(Luminexcorp.,AustinTexas,US)的偶聯將2.5X106個珠用活化緩沖液(0.1mol/l磷酸鈉，pH6.2)洗滌兩次，重懸于80^1活化緩沖液中，并用聲波處理直到觀察到珠的均一分布。加入均在活化緩沖液中稀釋至50mg/ml的10^1N-羥基硫代琥珀酰亞胺(硫代-NHS，來自Pierce,Rockford,US)溶液和l-乙基-3(3-二曱基氨丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，來自Pierce)以穩定反應并活化珠。混合后，將珠于室溫在黑暗中旋轉孵育20min。隨后將活化的珠用偶聯緩沖液(mmol/12(N-嗎啉代乙磺酸，MES)，pH5.0)洗滌，加入500^1不含疊氮化物的捕獲抗體溶液(lOO^g/ml)并旋轉孵育2小時或過夜。通過于4。C在3升PBS中過夜透析(Slide-A-Lyzer⑧透析卡，MWCO=10000,來自Pierce)從抗體中除去疊氮化物。孵育后，將珠用清洗緩沖液(含有0.05%Tween20的PBS)洗滌并重懸于75pi封閉/貯藏緩沖液(含有1%牛血清白蛋白(BSA)和0.05%疊氮化鈉的PBS)中。用血球計對所述珠進行計數，用封閉/貯藏緩沖液調至20X106個珠/ml的濃度并于2-8'C避光貯藏。如下進行測定程序通過用測定緩沖液(含有0.5%Tween20和1%BSA的PBS)預濕來準備濾板(MultiscreenMABVN1.2pm96-孔，Millipore,BurlingtonUS)。在提取后向每個孔中加入從微量滴定孔中吸出的樣品(lOOpl分為兩等份或150^1分為三等份)和50^1軛合捕獲抗體的珠的懸浮液，在含有1%豚鼠/豬血清(1:1)的測定緩沖液中每種分析物1500個珠。捕獲抗體與它們相應的抗原在r/2小時的孵育期間反應，并經由將》朱通過使用了MultiScreenVacuumManifold(M川ipore)的孔過濾從珠去除未結合的物質。用每孔200jil清洗緩沖液(含有0.5%Tween的PBS)洗滌珠兩次。將目前捕獲的抗原與各以1:1000在測定緩沖液中稀釋的生物素酰化的檢測抗體的混合物(50pl)反應r/2小時。將50pl鏈霉抗生物素-藻紅蛋白于測定緩沖液中20昭/ml的溶液(MolecularProbes,TheNetherlands)加至孔并將孵育再持續30min。最后將珠用200ji1清洗緩沖液洗滌兩次并重懸于清洗緩沖液中。振蕩15min后，依照制造商的使用說明書在Luminex10(FM上分析樣品。在一個優選的實施方案中，分析了樣品的細胞因子、趨化因子和生長因子(侈'J^口，白細月包介素t者^口11-1、11-2、11-3、11-4、11-5、11-6、11-7、11-8、11-9、11-10、11-11、11-12、11-13、11-14、11-15、11-16、11-17、11-18、11-19、11-20、11-21、11-22、11-23、11-24、11-25、11-26、IFN、TNF、MCP、MIP、MMP-9、TREM、M匿CSF、G-CSF、GM-CSF，趨化因子諸如CC、CXC，生長因子諸如TGFa、TGFP、EGF、VEGF、IGFI、IGFII、胰島素，炎癥介質諸如組胺、前列腺素、白三烯、血栓烷)和/或神經遞質的含量。在另一個實施方案中，分析了樣品的標準和特異性臨床參數例如CRP、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、特異性(即抗原特異性)抗體、運鐵蛋白、白蛋白、運甲狀腺素蛋白等。在另一個實施方案中，待分析的生物液是腦脊液、腹膜液、嚢液、羊膜液、灌洗液、唾液、細胞提取液或組織提耳又液。在又一個實施方案中，細胞的來源是細胞系或分離的血液細胞、處理的細胞(manipulatedcell)、轉基因的細胞、轉染的細胞，或者任何細胞類型或者改變或處理的細胞類型。本發明可應用于來自包括轉基因動物的任何物種和類型的動物(例如，人類、猴、小鼠、大鼠、牛、犬、馬、貓、禽類、魚類和任何其他物種)的血液和其他體液和組織提取液。在一個特定的實施方案中，所述試驗化合物被固定在固體表面(例如濾紙)，然后用血液樣品或者生物液或提取液孵育。孵育之后，將濾紙千燥或者將血液點樣在濾紙上并干燥。在本發明的一個特別的用途中，調節血液、生物液或提取液的體積以使其與固定的化合物或在溶液中的化合物反應固定的時間而同時在濾紙上千燥。在本發明的一個用途中，向活體試驗人或患者注入試驗化合物并于一定時間間隔從所述人抽取血液樣品，將血液樣品點樣在濾紙上，干燥并隨后分析。可使用標準的針和裝置從試驗個體中抽取血液樣品并由訓練過的人員完成。但也可使用允許局部個體取樣的設備完成血液的抽取。實施例實施例1.血液的抽取、孵育、點樣、千燥和貯藏使用無菌的針和注射器從試驗人抽取10ml血液放入抗凝試管。使用無菌抗凝試管將血液分為lml的等份。將來自一個樣品的血液樣品直接點樣在紙上直到充滿標記圈(使用的體積為約0.2ml)。向其他試管中，以預定的濃度加入^f寺試^r的樣品并將試管在37。C或室溫下孵育lh。之后將來自每個樣品的0.2ml樣品點樣在濾紙上。用毛細管、吸液管或類似物將血液樣品在濾紙上點樣成一層并于室溫(例如在通風良好的櫥中或在開放位置)干燥。然后將樣品在低濕度下于-20。C或室溫貯藏，以使紙保持干燥。為了這一目的，可使用一般的冷凍設備并且可將紙保存在信封或干燥器內。實施例2.濾紙的提取和分析從濾紙上的DBSS或標準物中穿孔取出兩片濾紙圓片(直徑為3.2mm)，并將其一起^:于微量滴定孔中。將140pl或180^1(分別用于兩份或三份測量)提取緩沖液、含有"具有乙二胺四乙酸(EDTA)的完全蛋白酶抑制劑混合物"(Roche,Germany)的PBS(每25ml測定緩沖液(含有0.5%Tween20和1%BSA的PBS)溶解1片)加至每個孔，并在設定為600rpm的平板振蕩器上于室溫避光提取分析物60分鐘。實施例3.Luminex測定抗體與珠的偶聯依照制造商的使用說明書進行捕獲抗體對羧基化珠(Luminexcorp.,AustinTexas,US)的偶聯將2.5X106個珠用活化緩沖液(0.1mol/1磷酸鈉，pH6.2)洗滌兩次，重懸于80pl活化緩沖液中并用聲波處理直到觀察到珠的均一分布。加入均在活化緩沖液中稀釋至50mg/ml的10^1N-羥基石克代琥珀酰亞胺(硫代-NHS,來自Pierce,Rockford,US)溶液和10pl1-乙基-3(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC，來自Pierce)以穩定反應并活化珠。混合后，將珠于室溫在黑暗中旋轉孵育20min。隨后將活化的珠用偶聯緩沖液(mmol/12(N-嗎啉代乙磺酸，MES),pH5.0)洗滌，加入500^1不含疊氮化物的捕獲抗體溶液(100昭/ml)并旋轉孵育2小時或過夜。通過于4。C在3升PBS中過夜透析(Slide-A-Lyzer⑧透析卡，MWCOIOOOO，來自Pierce)從抗體中除去疊氮化物。孵育后，將珠用清洗緩沖液(含有0.05%Tween20的PBS)洗滌并重懸于75^1封閉/貯藏緩沖液(含有1%牛血清白蛋白(BSA)和0.05%疊氮化鈉的PBS)中。用血球計對所述珠進行計數，用封閉/貯藏緩沖液調至20X106個珠/1111的濃度并于2-8X:避光貯藏。實施例4.測定程序通過用測定緩沖液(含有0.5%Tween20和1%BSA的PBS)預濕來準備濾板(MultiscreenMABVN1.2pm96-孔，Millipore,BurlingtonUS)。在提取后向每個孔中加入50^1從微量滴定孔中吸出的樣品(lOOpl分為兩等份或150nl分為三等份)和50pl軛合捕獲抗體的珠的懸浮液，在含有1%豚鼠/豬血清(1:1)的測定緩沖液中每種分析物1500個珠。捕獲抗體與它們相應的抗原在r/2小時的孵育期間反應，并經由將珠通過使用了用每孔200W清洗i爰沖液(含有0.5%Tween的PBS)洗滌珠兩次。將目前捕獲的抗原與各以1:1000在測定緩沖液中稀釋的生物素酰化的檢測抗體的混合物(50^1)反應"/2小時。將5(^l鏈霉抗生物素-藻紅蛋白于測定緩沖液中20pg/ml的溶液(MolecularProbes,TheNetherlands)加至孔并將孵育再持續30min。最后將珠用200^1清洗緩沖液洗滌兩次并重懸于125pl清洗緩沖液中。振蕩15min后，依照制造商的使用說明書在Luminex100上分析樣品。實施例5.Gc球蛋白、白喉類毒素、破傷風類毒素和脂多糖(LPS)的細胞因子釋放試驗將以下851)lmlEDTA-血液(人X)+30pl批次11的Gc2)lmlEDTA-血液(人X)+30^1批次13的Gc3)lmlEDTA-血液(人Y)+批次11的Gc4)lmlEDTA-血液(人Y)+30^1批次13的Gc5)lmlEDTA-血液(人X)+30^1PBS6)lmlEDTA-血液(人Y)+30^1PBS7)lmlEDTA-血液(人X)+30pl批次11的Gc+50^1來自肺炎克雷白4干菌(X/eZw,'e〃cf/wewmow/ae)的LPS(5mg/ml)8)lmlEDTA-血液(人X)+50|il來自肺炎克雷白桿菌的LPS(5mg/ml)9)lmlEDTA-血液(人Z)+30nl白喉類毒素(5.78mg/ml)10)lmlEDTA-血液(人Z)+30^1破傷風類毒素(993Lf/ml)11)lmlEDTA-血液(人Z)+30[il來自肺炎克雷白桿菌的LPS(5mg/ml)12)lmlEDTA-血液(人Z)+來自鼠傷寒沙門菌(&/附o"e〃a/少p/n'mw/7'wm)的LPS(5mg/ml)13)lmlEDTA-血液(人Z)+30plmilliQ水1min(A)、2h(B)、24h(C)和48h(D)后，將8種溶液中的每一種的180^點樣在濾紙上并千燥。隨后(于-20。C貯藏14天后)使用Luminex技術分析樣品的細胞因子含量(22)。結果示于表l。從表中可以看出LPS引起了IL隱lb、TL-6、IL-8、MIP-la、MIP-lb大量增加，同時可看到其他分析物較小但統計學上顯著的變化。白喉類毒素(diphteriatoxoid)引起了MIP-lb的增力口。MGc球蛋白、白喉類毒素、破傷風類毒素和脂多糖(LPS)的細胞因子釋放試驗(細節見實施例5)。除非另外標明，所有結果以pg/ml為單位。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例6.白喉類毒素、破傷風類毒素、結核菌素PPD和BCG的細胞因子釋放試驗。混合下列6種溶液并于37。C孵育1)1mlEDTA-血液(人Y)+30^1白喉類毒素(5.78mg/ml)2)lmlEDTA-血液(人Y)+30^1破傷風類毒素(993Lf/ml)3)lmlEDTA畫血液(人Y)+30^1BCG(4隱16x106cfu/ml)4)lmlEDTA-血液(人Y)+3(^1結核菌素PPD(0.4(ig/ml)5)lmlEDTA-血液(人Y)+30^1milliQ水6)lmlEDTA-血液(人Y)+30|xlBCG疫苗溶劑(對照)lmin(A)、2h(B)、4h(C)、6h(D)和24h(E)后，將6種溶液中的每一種的180^1點樣在濾紙上并干燥。隨后(于-20"C貯藏30天后)使用Luminex技術分析樣品的細胞因子含量(22)。結果示于表2。從表中可以看出，與對照相比BCG引起了IL-8和MIP-lb大量增加。類似地，白喉類毒素、破傷風類毒素和PPD引起了IL-8和MIP-lb增加，同時可看到其他分析物較小但統計學上顯著的變化。表2.白喉類毒素、破傷風類毒素、結核菌素PPD和BCG的細胞因子釋放試驗(細節見實施例6)。除非另外標明，所有結果以pg/ml為單位。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>參考文獻1.BeckWS(編輯).Hematology(血液學).MITPress1985.2.BloomAL,Thomas,DP(編輯).Haemostasisandthrombosis(癡血和血栓形成).Longman1987.3.JanewayCA,TraversP,WalportM,CapraJD.Immunobiology(免疫生物學).Elsevier1999.4.ThadikkaranL,SiegenthalerMA,CrettazD,QuelozPA,SchneiderP,TissotJD.Recentadvancesinblood-relatedproteomics(血液一目關的蛋白質纟且學的新進展),Proteomics.2005;5:3019-34.5.AndersonNL，AndersonNG.Thehumanplasmaproteome:history,character,anddiagnosticprospects(人類血漿蛋白質組歷史、特征和it斷前景).MolCellProteomics.2002;1:845-67.6.SteinkeJW,BorishL.Cytokinesandchemokines(細月包因子和趨fll因子)JAllergyClinImmunol.2006;117:S441畫5.7.Blach-OlszewskaZ.Innateimmunity:cells,receptors,andsignalingpathways(先天免疫細胞、受體和信號通路).ArchImmunolTherExp.2005;53:245-53.8.LapidotT,PetitI.Currentunderstandingofstemcellmobilization:therolesofchemokines,proteolyticenzymes,adhesionmolecules,cytokines,andstromalcells(千細胞動員的現有理解趨化因子、蛋白水解酶、黏著分子、細胞因子和基質細胞的作用).ExpHematol.2002;30:973-81.9.CravensPD,LipskyPE.Dendriticcells,chemokinereceptorsandautoimmuneinflammatorydiseases(樹突細胞、趨化因子受體和自身免疫性炎性疾病).ImmunolCellBiol.2002;80:497-505.10.VillasBH.Flowcytometry:anoverview(流式細月包術綜述).CellVis.1998;5:56-61.11.StelzerGT,RobinsonJP.Flowcytometricevaluationofleukocytefunction(白細胞功能的流式細胞評價).DiagnClinImmunol.1988;5:223-31.12.JeromeKR,SloanDD,AubertM.MeasurementofCTL-inducedcytotoxicity:thecaspase3assay(CTL誘導的細胞毒性測量胱天蛋白酶3測定)Apoptosis.2003;8:563-7.13.AndersenMH,SchramaD,StratenTP,BeckerJC.CytotoxicTcells(細胞毒性T細胞).JInvestDermatol.2006;126:32-41.14.TrouttAB,MaraskovskyE,RogersLA,PechMH,KelsoA.Quantitativeanalysisoflymphokineexpressioninvivoandinvitro(淋巴因子體內和體外表達的定量分析).ImmunolCellBiol.1992;70:51-7.15.SchmittelA,KeilholzU,ThielE,ScheibenbogenC.Quantificationoftumor-specificTlymphocyteswiththeELISPOTassay(用ELISPOT測定定量腫瘤特異性T淋巴細胞).JImmunother.2000;23:289-95.16.HouseRV.Theoryandpracticeofcytokineassessmentinimmunotoxicology(免疫毒理學中細胞因子評估的理論和實踐).Methods.1999;19:17-27.17.MeidenbauerN,HoffmannTK,DonnenbergAD.Directvisualizationofantigen-specificTcellsusingpeptide-MHC-classItetramericcomplexes(使用肽-I類MHC四聚復合物直4妾顯示抗原特異性T細胞).Methods.2003;31:160-71.18.BoussoP.GenerationofMHC-peptidetetramers:anewopportunityfordissectingT-cellimmuneresponses(畫C-肽四聚物的產生研究T-細胞免疫響應的新機會).MicrobesInfect.2000;2:425-9.19.HogrefeWR.Biomarkersandassessmentofvaccineresponses(疫苗響應的生物標記物和評#").Biomarkers.2005;10:S50-7.20.ManzRA,HauserAE,HiepeF,RadbmchA.Maintenanceofserumantibodylevels(血清抗體水平的維持).AnnuRevImmunol.2005;23:367-86.21.MeiJV,AlexanderJR,AdamBW,HannonWH.Useoffilterpaperforthecollectionandanalysisofhumanwholebloodspecimens(4吏用〉慮纟氏4欠集禾口分析人類全血液標本).JNutr.2001;131:1631S-6S.22.SkogstrandK,ThorsenP,Norgaard-PedersenB，SchendelDE,SorensenLC,HougaardDM.Simultaneousmeasurementof25inflammatorymarkersandneurotrophinsinneonataldriedbloodspotsbyimmunoassaywithxMAPtechnology(通過使用xMAP4支術的免疫測定同時測量新生兒千血斑點中的25個炎癥標記物和神經營養蛋白).ClinChem.2005;51:1854-66.23.Norgaard-PedersenB,SimonsenH.Biologicalspecimenbanksinneonatalscreening(新生兒篩選中的生物標本庫).ActaPaediatrSuppl1999;88:106-9.權利要求1.一種診斷試驗和方法，其包括將血液或另一種生物液樣品與試驗化合物混合，并將所述血液點樣在濾紙上以便隨后分析所述試驗化合物對所述血液的作用。2.根據權利要求1所述的診斷試驗，其中所述生物液是腦脊液、腹膜液、嚢液、羊膜液、灌洗液、唾液、細胞提取液或組織提取液。3.根據權利要求1-2所述的診斷試驗，其中所述試驗化合物在以下中選擇氨基酸、肽、蛋白質、糖、寡糖、多糖、糖蛋白、脂質、脂蛋白、粘多糖、激素、類固醇、維生素、影響血液而導致血液組成改變的低分子量合成化合物。4.根據權利要求1-3所述的診斷試驗，其中所述試驗化合物是毒素、變應原、自身抗原、細菌蛋白或多糖、病毒蛋白、真菌蛋白或多糖、寄生蟲蛋白或多糖、細菌脂多糖或與疾病相關的任何其他化合物。5.根據權利要求1-4所述的診斷試驗，其中分析樣品的細胞因子、趨化因子以及生長因子和/或神經遞質或者其他多肽和蛋白質的含量。6.根據權利要求1-5所述的診斷試驗，其中分析所述樣品的臨床參數例如CRP、IgG、IgA、IgM、IgD、IgE、特異性(即抗原特異性)抗體、運鐵蛋白、白蛋白和/或運甲狀腺素蛋白的含量。7.根據權利要求1-6所述的診斷試驗，其中通過免疫測定、生物測定、質譜分析法、HPLC、GC、GC-MS分析所述試驗化合物的作用。8.根據權利要求7所述的診斷試驗，其中優選的分析方法是ELISA測定、FLISA測定、DELFIA測定、Luminex測定、發光測定、電化學發光測定、閃爍親近測定、放射免疫測定、MALDI-MS、ESI-MS和開放式MS(例如DESI-MS)。9.一種方法，其包括將血液或另一種生物液樣品與試驗化合物混合，生物液或樣品的作用前進行齡藏、運輸和/或處理。全文摘要本發明公開了一種診斷試驗和方法，其包括將血液或另一種生物液樣品與試驗化合物混合，并將血液或生物液點樣在濾紙上以便隨后分析試驗化合物對血液或生物液的作用。所述生物液可以是腦脊液、腹膜液、囊液、羊膜液、灌洗液、唾液、細胞提取液或組織提取液。試驗化合物在以下中選擇氨基酸、肽、蛋白質、糖、寡糖、多糖、糖蛋白、脂質、脂蛋白、粘多糖、激素、類固醇、維生素，影響血液或生物液而導致它們組成改變的低分子量合成或天然化合物，例如毒素、變應原、自身抗原、細菌蛋白或多糖、病毒蛋白、真菌蛋白或多糖、寄生蟲蛋白或多糖、細菌脂多糖或與疾病相關的任何其他化合物。文檔編號G01N33/50GK101542285SQ200780044373公開日2009年9月23日申請日期2007年11月30日優先權日2006年12月1日發明者克里斯汀·斯科哥斯特蘭德,岡納·霍恩,夏洛特·斯瓦克·約根森,大衛·M·霍加德申請人:國立血清研究所