專利名稱：：制備方法
技術領域：
：本發明涉及保存和純化來自全*本的細胞的方法。具體而言，本發明涉及4絲和純化來自全*本的細胞的方法，以使得一群淋巴細#抗原呈遞細月^皮有效穩定化和純化，以供用于體外測量細胞介導免C^答的分析中。
背景技術：
：細胞介導免疫(CMI)應答通常用于確定個體的免疫狀態。通常，在臨床免疫學領域，術語CMI應答涵蓋體內皮試、淋巴細自殖分析以#特異性抗原了用于，、^定化^^制備來自分離的全"本的細胞的改進的方法,以:用、于測量一類CMI應答的分析技術(下文稱作"CMI分析")，所述CMI應答即針對特異性抗原的、基于細胞因子的體外CMI應答。免疫系統的細胞在受到抗原的刺激后能夠產生免疫效應物分子，例如細胞因子。CMI分析包括將細M本與一種抗原""^溫育，并測量免疫效應物^(例如細胞因子)是否存在或者存在的量，以提供個體針對所選抗原產生細胞介導免疫應答的能力的指征。在CMI分析中使用的細|^￡包括分離的淋巴細|^(特別是T細^)和抗原呈遞細胞(APC)群。APC參與抗原的加工，以使得該抗原可以被每個T細J^4面的T細胞受體識另，J。抗原誘導的細胞因子可被員到分析介質中，并通過例如ELISA的方法直接測定，或者對分泌細胞因子的T細胞的頻率佳月ELISP0T方法ii^f于定量。過濾免疫蝕斑分析也稱酶聯免疫斑點分析(ELISPOT)，在開發之初用于對個別的分泌抗體的B細Jf&i^ff^r測和定量。在該技7M皮開發出來時，它為常規的蝕斑形成細胞分析提供了快速的、多用途的替代方案。最近的改進已經提高了ELISP0T的靈M，以致可以^"測到每秒產生低至100個特異性蛋白質分子的細胞。這些分析利用了在緊鄰分泌蛋白質的細胞的環境中的較高深度的給定的蛋白質性細胞產物(例如細胞因子)。這些細胞產物利用高親和性抗體進行捕捉和檢測。ELISPOT分析的綜述可參考CurrentProtocolsinImmunology,Unit6.19pages6.19.1-8。ELISP0T分析通常包括六個步驟(1)在膜支持的微滴定;tUi包被純化的細胞因子特異性抗體；(2)封閉該板，以防止非特異性吸附^^T其他的蛋白質；(3)將分泌細胞因子的細胞與適當的試劑-^溫育；(4)除去細#試劑；(5)加入標記的第二抗細胞因子抗體；以及(6)枱r測膜上的抗體-細胞因子復合物。從全血樣本制備用于CMI分析的細胞的目前的方法包括使用聚糖體(Ficoll)梯度來分離外周血單核細胞(PBMC)。梠^據這些方法，為了有效進行CMI分析，淋巴細胞和APC必須從全械本中盡快純化，糾地ill在從個體采集血液樣本后的8小時內。
發明內容本發明人已經發明了保存和純化來自全jfc^本的細胞，以供在細胞介導免疫分析(CMI分析)，如ELISP0T分析中使用的方法。*明了在^之前處理全j6l^羊本的方法。這些方法可使全jfe^本在CMI分析，例如ELISP0T分析中使用之前^皮保存例如至少6小時，如多至48小時。本發明提供了一種M和純化來自全血樣本的細胞的方法，包括在純化細胞之前和/或^絲該樣本至少6小時，以及純化一群淋巴細胞和APC以供在細胞介導免疫分析(CMI分析)中^J^！,所述純^if過一種引AiL向或負向親和it擇步驟的方法^Mi^f亍。本發明在另一方面提[種處理和M全j6^本的方法，包括使用生長培養基稀釋所述全i^羊本；并且將處理過的全j&^羊本絲至少6小時，其中，在4錄之后，可獲得一群淋巴細胞和APC以供在CMI分析中使用。在M之后，可從稀釋的全*本中分離PBMC或者淋巴細胞和APC的適當的制劑以供在CMI分析，如ELISP0T分析中^Jl。本發明在另一方面^^"種在ELISP0T分析中員來自全血的、分離的T細胞的肽特異性細胞因子應答的方法，包括^f捐正向或負向親和選擇>^^斤述全jM羊本中分離一群包括T細#APC的細胞。本發明在另一方面"R供一種制備適用于ELISP0T分析的淋巴細胞和APC的方法，其中，所述方法包^it過iiy慮除去紅細胞。具體實施例方式本發明提供了一種保存和純化來自全*本的細胞以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用的方法。本發明還提供了一種通過^J^)細胞生長培養基稀釋來處理全jk^羊本、##存該處理的全*本的方法。該方法^f吏得來自所#液樣本的分離的淋巴細#APC的肽特異性細胞因子應答足以在CMI分析，如ELISP0T分析中使用，優逸地用在i貪斷方法中。根據本發明，細^^h導免疫^^斤(CMI分析)是指用于測量4十對特異性抗原的、基于細胞因子的細胞介導免疫應答的體外分析。此類分析^^)從個體中獲得的樣本，其中所述樣本包括免疫系統的細胞。該免疫系統的細胞在受到抗原刺激后能夠產生免疫效應物M，如細胞因子。該分析包括將該樣本與一種抗原""^溫育，并測量免疫效應物^(例如細胞因子)是否存在或者存在的量，以提供個體針對所選抗原產生細胞介導免疫應答的能力的指征。本發明中，CMI分析優選為ELISPOT分析。在CMI分析，如ELISPOT分析中使用的細胞包括分離的淋巴細#APC群，例如一群T細#APC。根據本發明方法制備的分離的淋巴細胞和APC制劑、特別是T細胞和APC制劑可用于CMI分析，如ELISPOT分析，以用于診斷。該制劑產生足以進4tit斷的應答。該應答可被P艮定為高于本底的50%。或者，該應答可被限定為佳月剛剛分離的全jk4羊本所能獲得的最;Ul答的至少50%。例如，在通常的分析中，在ELISP0T分析的每個孔中可使用2.5xl(f個存活的PBMC。在結核病的ELISPOT分析中，陰性對照通常少于5個斑點。在這種情況下，P曰性或M性樣本應比陰性對照多6個或6個以上斑點。如果陰性對照有6個或6個以上斑點，則只有在斑點數量為陰性對照的兩倍以上時才表明^JI性樣本。在本發明方法的一個實施方案中，在*之前或之后，使用正向親和選擇步驟或負向親和選擇步驟來純化來自全*本的細胞。正向親和選擇步驟用于將所需細胞結合至固體支持物上，從而使結合的細胞與^合的細胞分離。純4匕的結合的細胞^t保留，未結合的細l&^:丟棄。另一方面，負向親和選擇步驟用于除去那些在用于CMI分析，如ELISP0T分析的細胞制劑中不需要或不想要的細胞。因而，結合至固體支持物的細胞被丟棄，純化的未結合的細g回收并床留。該方法使淋巴細胞(如T細胞)和APC都得到純化。該純化可包拾淋巴細胞和APC兩者的正向或負向親和選擇，在這種情況下，通常樣本中這兩種細胞類型都得到富集，即，作為實施本發明方法的結果，樣本中T細J^細胞總數的比例和APC對細胞總數的比例都升高。根據本發明的一個方面，在通過包括正向或負向親和選擇步驟的方法對來自全jMf本的細胞進行純^iL前和/或之后，將該全jM羊^i行保存。例如，該全jM羊本可在分離所選細lfe^ML前進行保存。在保存至少6小時、至少8小時、多達IO、12、18、24、36或48小時之后，處理(即進行親和選擇)該全jfa^羊本以分離所選細胞群，然后可用于CMI分析，如ELISPOT分析。或者，該全血樣本在獲得之后不久即進行處理(即進行親和選擇)，例如在獲得之后1小時內、多達6小時或者多達8小時時進行處理以分離所選的細胞群。然后，在用于CMI分析，如ELISP0T分析^^前，將該細J!WM^。優選地，該全J&^羊4^cg在-5X:和40lC之間，通常在2"和8。C之前或者18。C和25。C之間。在特別優選的實施方案中，該全_16^羊4^皮*在室溫下，例如約18。C或20。C或者從18"C至25'C或者從201C至25匸。在一個實施方案中，該樣^本文提及的任何方法的任何階段都不進行冷凍。在一個實施方案中，該樣^^MS^^取的階^g和純化(通it^發明的方法)階段之間不4皮冷凍；并且/或者該樣本在保存和純化階段至在CMI分析中使用的階段之間不被冷凍。在本發明的一個方面中，純化方法包括負向親和選擇步驟以除去全*本中的粒細#^^的紅細胞，以侵Jl得可在ELISPOT分析中使用的淋巴細#APC制劑。因此，根據本發明的一個方面，所提供的方法在一個步驟中從全*本中同時除去粒細胞和紅細胞。才艮據該方法，全jfiM^本與含有抗CD66b和血型糖蛋白A抗體的抗體制劑相接觸。這些抗體用于使紅細J^粒細M集。凝集的紅細胞和粒細胞可通過例如離心從樣本中除去。該樣;^ii可在離心前進行聚糖體梯度。在本發明的另一方面中，負向親和選擇包括使用結合有配體的固體支持物，所述配體結合存在于粒細J^面的細J!fe4面蛋白，而不結合在ELISPOT分析中^JI的淋巴細I^APC表面上存在的細g面蛋白。例如，提供的固體支持物可包括抗CD15配體以結冶^樣本中的CD15+細胞，和/或包括抗CD66b以除去樣本中的CD66b+細胞。根據本發明的這一方面，使全*本，或者經過處理已除去紅細胞的血液樣本在可結合粒細胞的條件下與含有抗CD15配體或抗CD66b配體的固體支持物相接觸。已經除去粒細胞的淋巴細胞或APC制劑可直接獲得，例如通過偉樣本與該固體支持物接觸，并收集^T未結合到該固體支持物的物質。或者，結合有粒細胞或者其他不想要的細胞的固體支持物可與樣本的剩余物分開。例如，該固體支持物可包括#^例如*。一旦,已與樣4^^觸并置于可使粒細胞與固體支持物結合的條件下，微珠即可與該樣本分離以使淋巴細胞和APC制劑中的粒細皿除去。在優選的實施方案中，固體支持物包括可與樣本的剩余物分開的/^:，例如，可通過應用磁場與樣本的剩余物分開。應該理解，可與粒細胞表面的細胞表面標記物結合的M配體，特別是抗體，都可用于負向親和選擇。例如，下述抗體也可用于通it^方法除去粒細胞抗CD16b和/或抗CD88抗體。優選地，根據本發明的這一方面，紅細胞<^^^全*本中除去。這可以在除去表達CD15+的細J!^者粒細fe前、之后或者同時實現。可通過4沐適當的方法除去樣本中的紅細胞。例如，樣本中的紅細胞可通過4吏紅細胞fj^來除去(Simonetal.,Immunol.Commun.1983，Vol.12，pp.301-314)。根據本發明的一個方面，紅細胞可通過it^、除去。根據本發明的這一方面，提供了一種制^^淋巴細胞和APC以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用的方法，包括過濾除去紅細胞。該方法可單獨使用，或者與本發明的一種或多種其他方法結^f^)，例如，與^^J抗CD15+配體的負向親和選^^^f^以除去粒細胞。本申請的過濾方法包括將全jMf本應用至過濾器。選擇過濾器以使紅細胞穿過過濾器而淋巴細胞和APC留在過濾器上。才艮據該方法，帶有淋巴細胞和APC的過濾器可直接在CMI分析，如ELISPOT分析中使用。或者，淋巴細胞和APC可通過例如下述方法收集沖洗過濾器或者反向沖洗過濾器，并收集回收的、淋巴細胞和APC。根據本發明的另一方面，從全*本中純^*巴細#APC制劑是通過包括正向親和步驟的方法實現的，其中優i^屯，該親和選擇步^i^擇所有類型的T細胞(例如，不管是CD4還是CD8，或者不管識別什么表位)。在一個方面，使全iMf本與附著有配體的固體支持物相接觸，所述B己體結合在淋巴細胞和APC表面存在的細胞表面蛋白。該配體可以是抗體。在本發明的一個優選的方面，該配體選自抗CD4、抗CD8、抗CD19、抗CD45、抗CD45RC和抗CD14配體。例如，所提供的固體支持物可結合全jfa^羊本中的CD4+、CD8+CD14+和CD19+細胞，或者其子集，如CD4+、CD8+和CD19+細胞。這些細胞的分離可使淋巴細胞和APC制劑適于在ELISP0T分析中使用。該制劑可包括004+和008+T淋巴細胞、B細胞和單核細胞的混合物。在一個實施方案中，抗CD4和/或抗CD8配體不用于純化步驟中，優選地，抗CD4抗體和/或抗CD8抗不用于純化步驟中。在一個優選的實施方案中，選擇固體支持物上的配體，以使在最終制劑中不想要的細胞(如粒細胞)不保留在固體支持物上。例如，選擇g己體，以使它們對淋巴細胞和APC具有特異性，并且不結合粒細胞。固體支持物上可以大約相同的比率提供抗CD4、抗CD8和抗CD19配體或者其他適當的配體。或者，選擇每種S己體的比率，以例如反映出存在于全血中的每種細胞的比例。或者，可以選擇配體的比率，例如CD4:CD8:CD19S己體，以便以期望的比率(例如特別適合在ELISP0T分析中使用的比率)結^^和分離淋巴細胞和APC。使用結合有配體的固體支持物結合所選蛋白質的親和選擇方法為本領域所7^p。通常，使全j^羊本與含有所需配體的固體支持物相接觸，所述接觸發生在可使細l&iti^目關的細胞表面蛋白與該配體相結合的條件下。該固體支持物可與樣本的剩余物分開以便將結合的細胞與未結合的物質分離。可包括沖洗步驟，例如，從固體支持物上洗去未結合的物質。在本發明的一個優選的方面中，固體支持物包括#。該^Mr容易地，例如通it應用磁場，與樣本分離。若固體支持物以^Ml^^類型賴沐的形式提供，則每個#^上可具有一個酉己體，例如抗CD4S&體。每個只帶一個St體(如抗CD4、抗CD8、抗CD14或抗CD19)的微珠可結合在一^使用，以佳_形成的固體支持物可結合所需的細胞，如CD4+、CD8+、CD14+和CD19+細胞。或者，每個^K上可提供多于一個配體，如抗CD4和抗CD8兩種配體，或者抗CD4和CD19兩種配體，或者所有g己體的結合。在一個特別優選的實施方案中，選擇配體的比率，如抗CD4:抗CD8:抗CD19，使其相關于在ELISP0T分析中^J]的最終制劑中所需的淋巴細J!^APC的比率。也可選擇一定數量的#,以便分離選定數量的細胞，以便有助于進一步處理該制劑以供在ELISP0T分析中使用。結合在固體支持物上的所選細胞的制劑，特別是淋巴細胞和APC制劑可直接在分析中使用。特別是，結合有相關細胞的磁珠可直接在CMI分析，如ELISP0T分析中使用。優選地，結合有細胞的微^被用于分析中之前被洗滌。或者，一旦所選細胞與全*本的剩余物分離，結合在固體支持物上的細胞可以從該固體支持物上解離以在分析中使用。根據本發明的另一方面，全械本^JI細胞生長培養基稀釋處理，并在用于CMI分析，如ELISPOT分析之前進^f亍^M^。稀釋的全jfi^羊本在采集^可保存至少6小時，例如在從個體采集^##至少8小時，>^在采集^*長達IO、12、18、24、36或48小時。才艮據本發明的這一方面，全iM^^M^之前被穩定化或處理。例如，該方法包括^J^細胞生長培養基稀釋全械本，以使當^^斤述*的全械本獲得的全jM羊本或者分萬的t細胞和apc制劑在樣本采集后長達48小時時在ELISP0T分析中^J^1時，仍保持活性應答。根據本發明，全j^羊本可^^細胞生長培養基以^^t適當的比率稀釋。在一個優選的實施方案中，全jfa^羊本與細胞生長培養基的比率為1:1。另夕卜，全械本與細胞生缺養基的比率可以是2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、高達10:1、20:1或30:1。另外，全械本與細胞生長培養基的比率可以是1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10、低至1:15、1:20或1:30。在一個實施方案中，將稀#^養#入全_1&#本中，但不進行振蕩或^攪拌。全j6Mf本優選^"在標準的^:化試管中。優iti也，全*^^^在暗處。本發明中使用的細胞生長培養基可為^f可適當的細胞生長培養基。例如，該培養基可以是市場上購得的培養基，如AIM-V(InvitrogenPaisleyUK)或者RPMI1640(SigmaAldrichCorp,St.Louis,M0，USA)。在一個優選的實施方案中，細胞生長培養基為無血清的培養基，如AIM-V。根據本發明的一個方面，所i^t理的全j6M^本用于CMI分析或者準^^在保存后用于CMI分析。通常，在*后，^y^斤述處理的全jfa^本中純化PBMC制劑或者T淋巴細胞和APC制劑，以供用于CMI分析。任何適當的方法均可用于獲得分離的細胞制劑，以供用于CMI分析，如ELISP0T分析。通常，可使用聚糖,度來分離PBMC。更M地，通過包括親和選擇步驟的方法，從處理過的全jMf本中除去紅細^粒細胞，以例如分離'淋巴細胞和APC制劑。稀釋處理還可用于本發明的另一方面，用以在CMI分析中佳月之前的M該制劑之前處理分離的淋巴細胞和APC制劑。在本發明的另一方面中，將稀釋或未稀釋的全血^M^幾個小時，優選*至少6小時，或者長達12小時，或者12-48小時。可以在2-8。C或者室溫j呆存。保存后，可以通過上述的親和選擇來制備淋巴細胞和APC制劑，并JWii^地，該制劑中T細胞的肽特異性應答可通過CMI分析測定。用這樣的方式，引入CMI分析的T細胞的體外活性被穩定化和儲。因此，該過程減少或者絲了體外T細胞活性的顯著降低，而當血液樣本在分離步驟前保存幾小時，再使用例如標準的聚糖*度從全*本中分離而得的淋巴細胞和APC制劑中，會觀察到體外T細胞活性的顯著I^f氐。本發明還提供了一種^4MfiM^本的試劑盒，包括標準的g化試管和細胞生長培養基。本發明還提供了一種在由本文所述的方g萍和純化的細l&Ji實施ELISPOT分析的試劑盒，其中所述試劑盒包括(i)一種細胞因子特異性抗體，任選地附著于微滴定板，和(ii)本文所述的可用于親和選擇中的一種或多種配體，^fiit地結合于一個固體支持物，和(iii)任選地，進行ELISP0T分析和/或實施*和純化細胞的方法的說明書。另外，本發明還提供了一種用于根據本發明來純化一群淋巴細胞和APC的試劑盒，其中所述試劑盒包括一種或多種本文提及的配體，所述配體<鏈地結合于固體支持物上。該試劑盒還包括用于實施本發明的方法的說明書。在本發明的另一個實施方案中，全jM羊本使用正向或負向親和選擇步驟處理，分離一群T細胞和APC以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用，而無需保存該樣本。在另一個實施方案中，正向或負向親和選擇方法可用于分離細胞制劑以供在CMI分析，如ELISP0T分析中使用，所述細胞來自于已經過稀釋處理和^#的4^Jfe■#本。任何上述實施方案均可在來自于人的樣本上實施，例如被懷疑患有可由ELISP0T診斷的疾病的人。下文中，參照以下實施例，對本發明進行更加詳細的說明。實施例1使用培養^^^#釋處理對總共78個供體中的^個皿進行靜脈穿刺，之后立即采集一管10mlLithiumHeparinVacutainer管(BDBiosciences,Oxford,UK)的全血，并<吏用T一SPOT.7^分才斤試劑盒(OxfordI咖unotec，Abingdon,UK)i^f亍6個月時間的處理。根據該試劑盒隨附的廠商說明書來實施該方法。該方法包括a)用于制備夕卜周血單核細胞(PBMC)的標準的Ficol1方法-參見SampleCollectionandPreparation,Procedure2"alternativebloodcollectionmethods"andNote2.;b)^JI臺盼藍染色排除法(TrypanBlueDyeExclusionmethod,Freshney,R.(1987)CultureofAnimalCells:AManualofBasicTechnique,p.117，AlanR.Liss,Inc.,NewYork)對存活細JJ&it^i十數；c)將細胞使用GIBC0AIM-V(Invitrogen，Paisley,UK)^^釋至250，000細胞/100pi;d)將250，000(100pi)Ficol1提取的細#入每個微滴定板中，所述滴定板已經用抗y干擾素以及下述之一物質很好地包被植物血細皿集素(pha)陽性對照；或者來自結核分枝桿菌(M.tuberculosis)的特異性測試抗原(A板；B板)；或者來自巨細胞病毒/EB病毒/流感病毒(CEF;Mabtech，Sweden),該抗原不在T-SP0T.M試劑盒中提供；e)將該板溫育16至20小時(37X:，5%C02)，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗四次，然后加A^性磷酸酶綴合的第二抗體，并在2-8。C溫育l小時；f)將孔沖洗四次，然后加入5-溴-4-氯-3，吲咮基磷酸酉旨/硝基藍四唑(NitroBlueTetrazoli咖，BCIP/NBT),溫育7^#。出現斑點后，使用蒸餾水終止反應；g)在37X:干燥4小時之后，記錄每個孔中的斑點形成細胞(SFC)it量，并i^f亍^^沖斤。將剩余的M體的血液使用AIM-V以1:1的比例稀釋，在室溫(18-25t:)、暗處it^^M^24小時。在第2天，對保存的血液進行T-SPOT.7S分析，包括制備PBMC的標準的Ficol1方法。然后使用陽性對照(PHA)和空白對照(無抗原)，進行T-SP0T.分析以確定SFC計數。從測"^原孔的SFC計數中減去空白對照。如果任何一個抗原孔含有6個或者更多斑點而空白對照含有零個斑點，則該樣樹于該測試抗原來iJW皮認為是"反應性的，，。下J^示新鮮的和稀釋的和保存的血液之間的關系。顯示了對于每個^H^血液樣本，在室溫(RT)下過夜^M^血液(在用AIM-V以1:1稀釋之后)，使用A板、B板和CEF孔的反應性和非反應性結果。同時顯示了供沐總數的百分比。CEF抗原溶解于AIMV，以5畔/ml的水平存在于該分析中。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>結果顯示86.1%的臨床一致性(敗比空白對照多6個斑點表示^性)。因此，^Ejk液樣本中加入培養基使得在保存24小時后在PBMC中可測得陽性SFC應答，該應答與在采M直接處理的血液中所測得的應答類似。采集并保存24小時而不添加培養基的血液在可測得的CMI應答中顯示顯著性減小(數據未示出)。實施例2正向親和選擇在第1天，并JL^靜脈穿刺的2小時之內，對于九個皿中的每個皿，取兩管10mlLithiumH印arinVacutainer管的全j6a文置^^，一管在室溫(18-25°0下暗處，另一管在冰箱(2-8n)中。在每個時間點，在每個^^靜脈穿刺后的0-2小時(新鮮的)或者24小時(保存的)，取3ml全血使用沖洗緩沖液(PBS/0.1。/4BSA/2mMEDTA)以1:1稀釋，與80pl特異性Dynabead^l的濕/^混合，所M^的"^物即111.45(CD4);111.47(CD8);111.49(CD14);和111.43(CD19)以同等比例混合(Invitrogen)。這些"齡"基于是否存在特異性分化(CD)標記物對細J!feii行正向選擇，所述特異性分化標記物為CD4和CD8為T細胞亞群；CD14(單核細胞)和CD19(B細胞和APC)。將該樣^室溫下混合12min，通過將樣本試管置于磁性顆粒聚焦器(magneticparticleconcentrator,MPC:Invitrogen,Paisley,UK)2分鐘來將^分離。棄去上清液，將:用PBS沖洗兩次，然后再次在MPC中分離。然后將孩沐重新懸浮于lmlAIM-V，使用臺盼藍染色排除法對細胞進^S十數。將細胞佳月AIM-V稀釋至250，000細胞/100jil。作為平行，，在每個時間點，在每個^^靜脈穿刺后0-2小時(新鮮的)或者24小時WW的)，取5ml全血用實施例1中所述的標準的Ficoll方法直接處理。然后將所有處理的樣本^J^T.SPOT.7S分析試劑盒(見實施例l)進行分析，在分析孔中使用抗原CEF(5蹄/ml)，或者PPD(1pg/ml)，或者PPD/CEF(分別為1蹄/ml和5蹄/ml),它們均不在T-SPOT.TB試劑盒中提供；PPD(產品^R^馬RT23)從StatensSerumInstitut(Copenhagen,Denmark)|yf;對于CEF,參見實施例1。PPD和CEF分別用于識別CD4+和CD8+T細胞。下表#了所有供本的結果的平均值，顯示了由ELISPOT測得的選自新鮮的或者M的血液的細胞的SFC計數，該分析佳月CD4、CD8、CD14和CD19綴合的*，并與僅使用Ficoll的分析相對照。在室溫*24小時并用M選擇的血液的結果與"新鮮M"樣本的結^目當，并且比"只^吏用Ficoll"的樣本以及"只佳月Ficoll"和在4X:保存的結果^"好。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>假定只用Ficoll處理的"新鮮"樣本在ELISPOT分析中產生100%的SFC計數，對結果進行標準化。上面三4于顯示平均SFC計數，下面三行顯示標準差。實施例3負向親和選捧從4個供體中的每一個，在靜脈穿刺后立即采集兩個10mlLithiumHeparinVacutainer管全血，時間跨度1個月。對于每個供體的一個樣本，使用MACSi抗CD15/^(MiltenyiBiotech,BergischGladbach，Germany)進行負向選擇步驟。^MM^)前完全重新懸浮，以確保均勻地*。將400nl^M^入15ml錐管中的4ml全血中。將該試管在室溫下佳月MACSimix(MiltenyiBiotech)試管旋轉器以中等ii^(8rpm)溫育15分鐘。將試管置于MACSiMag分離器(MiltenyiBiotech)中2分鐘，以使M粘附于試管壁。將試管留M場中，用移液管移去上清液，置于新試管中。含有上清液的試管重新置于MACSiMag分離器中2分鐘，以使所有殘留的微珠粘附于試管壁上。將試管留在磁場中，將上清液轉移至50ml錐管中。加入16ml新制備的1X紅細胞(RBC)自緩沖液(由10X自緩沖液稀釋而制備1.55MNH4C1，lOOmMKHC03，lOmMEDTA),將試管在室溫溫育5分鐘。將樣本在300xg離心10分鐘。將沉淀的細胞用^J^緩沖液(5ml)沖洗兩次，每次在300xg下離心5分鐘。將細胞用RPMI沖洗一次，在lmlAIM-V中稀釋，以供用于ELISP0T分析。作為本方法的平行#，^^I每個餘沐的第二個樣本，將5ml全血通過實施例1中所述的標準的Ficol1方法處理。然后將純化的PBMC樣本在如實施例1中所述的T.SPOT.7S分析中進行分析，分析中將CEF(5叫/ml)用于供體l、2和4樣本作為抗原；A板和B板抗原(33畔/ml)用于*體3樣本。^J1負向選擇方^^J)MACSi抗CD15^i^制備的PBMC所獲得的SFC計數(如下表所示)顯示了與^^1聚糖>^#度制備的PBMC的高度的等價性。該基于抗體的PBMC分離方法被證實在技術上是可行的，在T-SPOT.M分析中產生高度可重現的結果。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(N.B,為脅3和4，(-)孑L^示沒有^^;(+)孑A示存在PHA(5貼/ml)實施例4負向親和選擇ii-f亍兩項分開的實驗，每項實驗^^I從一組15或11個儉本匯集的全血。對于每項實驗a)在第l天，在靜脈穿刺之后立即將一個10mlLithiumH印arinVacutainer管的從每個供沐匯集的全jM艮據標準的Ficoll方法(見實施例l)進行處理。^^l臺盼藍染色排除法對存活的PBMC進^i十數。將細胞佳月細I^養基(AIM-V)稀釋至250，000細胞/100b)將剩余的血液以未稀釋的狀態、在暗處、在2-8。C的水箱中或者在室溫(18-25。C)保存24小時；c)在第2天，根據標準的Ficoll方法對保存的血液樣4^ii行處理以制備PBMC，如上所述(見本實施例的第一勵對存活的細胞進^i十數^l釋。在每項實驗中處理的平行樣本中，對于每個餘沐，在第l天(新鮮的)和第2天(^#的)，將4.5ml全jkip入到15ml離心管中，然后將225jilRosetteSep(StemCell，Vancouver,BC，Canada)加入^爭個管中，以4吏用含有抗CD66b和血型糖蛋白A的四聚體復絲使RBC和粒細胞結合。將樣錄輕^^，置于室溫下溫育20M。然后將樣本^j^RPMI以1:1稀釋，標準的Ficoll方法(見實施例1)將PBMC從除去粒細胞的細胞中分離，從而將RBC和粒細胞與淋巴細胞和APC分離。然后根據試劑盒隨附的廠商說明書，對淋巴細#APC進行沖^fe^處理-見實施例1。結果在下面顯示。在進行的兩項分開的實驗中，在分析中一項使用CEF(5蹄/ml)作為抗原，另一項使用PPD(l畔/ml)。Ji^:在4t:和室溫以Ficoll和RosetteS印處理的CEF誘導的SFC計數(15個儉f^的平均值)。下表在4。C和室溫以Ficoll和RosetteS印處理的PPDi秀導的SFC計數(ll個儉沐的平均值)。結a明，在4匸保存、然后以抗粒細胞抗體處理、接著用Ficoll純化PBMC獲得的樣本與標準的"新鮮"樣本是等價的，同時其SFC計數高于在室溫下保存然后以抗粒細胞抗體處理的樣本。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>n=ll個供體，32個重復實施例5-過濾在靜脈穿刺后T0和T24小時研究佳JI反向沖洗白細胞濾膜(PALLMedical)的可行性以絲該膜上捕獲的細胞的穩定性。將捕獲的細絲該膜上絲，一個糾的併存在冰箱(2-81C)中，另一個儉沐的絲在室溫(18-251C)。在每個時間點和溫度,在進行標準的Ficol1PBMC分離方法的同時進^S亥膜分離方法。該膜需要按照步驟1-3(見下幻進行*,然后對其^適當的^MNH^和期限。然后將膜^#裝置從保存區域移除，并^M目關時間點進行4-7(見下文)。將Ficoll對照##樣本在室溫、暗處存放，用AIMV細l&^養基以1:1稀釋，直到需要通過標準的Ficoll分離方法進行處理。膜處理過程如下所述步驟1-3包括佳冗轉移注射器將10ml沖洗緩沖液1通過該膜過濾至廢物瓶中。將10ml全*本與50ml沖洗緩沖液1先混合，然后使用轉移注射器通過LK4膜過濾至廢物瓶中。使用#^多注射器，將50ml冷卻的沖洗緩沖液1通過LK4膜過濾至廢物瓶中。步驟4-7包括立即或者在24小時后(根據時間點)將濾膜倒置。使用反向沖洗注射器，將50ml冷卻的移除緩沖液l反向通過該膜過濾到50mlFalcon管中。將細胞懸液以2000rpm在室溫下離心5min，然后重懸于10mlAIMV中。將細胞懸液再次以2000rpm在室溫下離心5min,然后重懸于lmlAIMV培養基中，并根據標準的Ficoll分離方法計數。(沖洗緩沖液l:500mlAIMV培養基，以20mMHEPES和1%[w/v]DextranT40緩沖)(移除緩沖液1:500mlAIMV培養基，以20mMHEPES和0.1%[w/v]DextranT40緩沖)。然后，如實施例l所述，同時根據每個試劑盒附隨的廠商指導說明，進行T-SPOT.7S分析。下表記載了該研究中進行的T-SPOT.7S，結果的總結。顯示了與膜實驗的時間和溫^L有關的CEF斑點計數的對比。這是針對膜性能與在同一天進行的相關Ficoll對照的關系以及它們在TO的關系進行的。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>^MJi^中可以看出，用于新鮮全血、在T0和T24^#在2-8匸和18-25。C(室溫)的膜所提供的PBMC在用于ELISPOT分析時可產生足夠的CEF信號。在ii^已經證實了^^反向沖洗濾膜條的PBMC能夠在ELISPOT分析中誘導應答。實施例6-負向親和選~^前的##時間使用來自15個儉體的^r—個的全i^羊本，進行兩項M的實驗。對于每項實驗a)在第1天，在靜脈穿刺后立即將一個10mlLithiumH印arinVacutainer瓶的來自每個供體的全i^艮據標準的Ficoll方法進行處理("新鮮，，樣本)，以制備PBMC;b)將來自每個儉休的剩余血液以未稀釋的狀態保存在暗處，在2-8t:的水箱中(保存的樣本)保存不同時間(16到72小時)；c)在第2天，#^存的樣本如實施例4所述用RosetteS印(StemCell，Vancouver,BC，Canada)溫育，然后才艮據標準的Ficoll方法進行處理，以制備PBMC。然后對PBMC進^i十數和稀釋，將樣擬艮據實施例4進行處理，除了在進行的兩項分開的實驗中，一項使用CEF(5pg/ml)作為抗原，另一項在分析中使用CEF/PPD(分別為5jig/ml和1蹄/ml)。下面給出的結果^^了，對于所有個體##:#本，在4捐CEF抗原(n=10)或者使用CEF和PPD兩種抗原(n-5)經過不同的處理M后，所記錄的累積SFC計數，該計^bl^于^—處理樣本的三次單獨ELISP0T分析結果的平均值的總和。這些數據表明，在2-8"C保存了16至24小時之間的樣本可隨后在用Ficoll處理之前用抗4立細胞抗體"穩定化"，而斜目同的純化^Ht^^^更長的時間會導致ELISP0T分析中的SFC計it逐漸減少。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>當樣本在室溫下保存了長達48小時，然后被"穩定化"并用Ficoll處理時，獲得了類似的結果。權利要求1.一種保存和純化來自全血樣本的細胞的方法，包括在純化細胞之前和/或之后保存該樣本至少6小時，以及純化一群淋巴細胞和抗原呈遞細胞以供在細胞介導免疫分析(CMI分析)中使用，所述純化通過一種引入正向或負向親和選擇步驟的方法來進行。2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述樣^M^保存至少IO小時。3.根據權利要求2所述的方法，其中，所述樣^^皮M至少12小時。4.根據權利要求3所述的方法，其中，所述樣^^皮保存12至36小時之間、12至48小時或者24至48小時。5.根據上i^K利要求中任一項所述的方法，其中，所述樣4^皮*在2-8。C。6.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中，所述樣4^皮*在18-25"C。7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其中，所述純化方法包括負向親和選擇步驟以除去粒細胞。8.根據權利要求7所述的方法,其中，所述方法包括使該樣本與包括抗CD66b和血型糖蛋白A抗體的抗體制劑相接觸，以使紅細^粒細胞疑集，并且通過離心>^^斤述制劑中除去所述紅細#粒細胞。9.根據權利要求7所述的方法，其中，所述粒細胞的除去是通過使所述樣本與包括抗CD15配體的固體支持物相接觸以從該樣本中除去CD15+細胞來實現的。10.根據權利要求9所述的方法，其中，所述固體支持物包括#,并且其中，該方法包括使該樣本與該^M目接觸以使CD15+細胞與該^K結合，以及從該樣本中分離結合有CD15+細胞的^K。11.根據權利要求9至10中任一項所述的方法，其中，該樣本中的紅細Jf&it過裂解或過濾除去。12.根據上it^L利要求中任一項所述的方法，其中，所述純化導致該樣本中T細胞對總細胞的比例和抗原呈遞細胞對總細胞的比例均升高；和/或其中，該樣^4保存或者純化或者在CMI分析中佳月之前的任何時間都不被冷凍。13.權利要求1至6中任一項所述的方法，它包括對所述細胞的正向親和選擇步驟，其中任選地，該親和選擇步^it擇所有類型的T細胞。14.根據權利要求13所述的方法，其中，所述方法包括將所述樣本與附著有配體的固體支持物接觸，從而分離淋巴細^抗原呈遞細胞制劑，其中所述配體可結合存在于所逸林巴細胞和抗原呈遞細胞的表面的細J!fe^面蛋白。15.根據權利要求14所述的方法，其中，所述固體支持物包括抗CD4、抗CD8、抗CD19和抗CD14配體中的一種或多種，以便將CD4+、CD8+、CD19+和/或CD14+細JJ&^全j6M^本中分離。16.根據權利要求14或15所述的方法，其中，在用于分析之前，將所述淋巴細胞和抗原呈遞細胞制劑從該固體支持物上分離。17.根據權利要求14或15所述的方法，其中，所逸林巴細胞和抗原呈遞細胞制劑被保留在所述固體支持物Ji^分析中^fM。18.根據權利要求14至17中任一項所述的方法，其中，所述固體支持物包括19.才艮據權利要求18所述的方法,其中，每個所述的^Ui結合有一個抗CD4、抗CD8和抗CD19g己體。20.根據權利要求18所述的方法，其中，每個>#^上結合有抗CD4、抗CD8或抗CD19中的一種或多種，并JL^斤ii^Ma^在"^，以4吏該固體支持物能夠結合CD4+、CD8+和CD19+細胞。21.—種處理和絲全械本的方法，包括使用生長培養基稀釋所述全jM羊本；并且將處理過的全jfi^羊本保存至少6小時，其中，在*之后，可獲得一群淋巴細胞和抗原呈遞細胞以供在細胞介導免疫分析(CMI分析)中賴。22.才艮據權利要求21所述的方法，進一步包括在#之后，A^斤述全jk4f23.根據權利要求21或22;斤述的方法，其中，)斤述全JM^本使用細胞生長培養基以l:l的比例辨f釋。24.根據權利要求21、22或23所述的方法，其中，所述的細胞生長培養基為AIM-V。25.—種進行ELISP0T分析的方法，包括##權利要求1至20或22中任一項所述的方法來^#4^62##純化一群淋巴細#抗原呈遞細胞，以;S^ELISP0T分析中^^1該淋巴細#抗原呈遞細胞制劑。26.—種在ELISP0T分析中,來自全血的、分離的T細胞的肽特異性細胞因子應答的方法，包括^^正向或負向親和選擇A^斤述全J6^本中分離一群包括T細胞和抗原呈遞細胞的細胞。27.根據權利要求26所述的方法，其中-T細胞和抗原呈遞細胞群通it^利要求7至26中4壬一項限定的方法從全血中分離；和/或-其中，在進行親和選擇之前，所述樣本保存至少10小時、至少12小時，或者在12至36小時之間、12至48小時之間或者24至48小時之間；和/或-其中，在進行親和選擇之前，所述樣本M在2-8t:之間或者18-25'C之間。28.—種制備適用于ELISPOT分析的淋巴細胞和抗原呈遞細胞的方法，其中，所述方法包^it過過濾除去紅細胞,其中所述方'^fii^包括使所述全血樣^it過一個過濾器，允許紅細胞穿過該過濾器，151^從該過濾器收集淋巴細胞和抗原呈遞細胞。29.根據權利要求28所述的方法，其中反向沖J5^斤述it^慮器以回Jl^斤ii^巴細胞和抗原呈遞細胞。30.根據上a利要求中任一項所述的方法，該方法在來自人體的樣本上進行，任選地該樣本在CMI分析中使用以診斷疾病。31.—種用于實;^K利要求25的方法的試劑盒，包括(i)一種細胞因子特異性抗體，^i^附著于微滴定板，和(ii)權利要求9和15中^—項限定的配體/抗體中的一種或多種，<鏈地結合于一個固體支持物，和(iii)任選地，實施M和純化細胞的方法和/或進行ELISP0T分析的說明書。32.—種用于根據權利要求1至20、26和27中^~~項來純化一群淋巴細齡抗原呈遞細胞的試劑盒，其中，該試劑盒包括(i)權利要求9和15中P艮定的配體/M中的一種或多種，^i^結合于一個固體支持物，和(iiMii^地，用于實施該純化的說明書。全文摘要一種保存和純化來自全血樣本的細胞的方法，包括在純化細胞之前和/或之后保存該樣本至少6小時，以及純化一群淋巴細胞和抗原呈遞細胞以供在細胞介導免疫分析(CMI分析)中使用，所述純化通過一種引入正向或負向親和選擇步驟的方法來進行。文檔編號G01N1/34GK101529221SQ200780037140公開日2009年9月9日申請日期2007年10月5日優先權日2006年10月6日發明者A·奧基夫,I·杜蘭特,M·班普頓,T·戴申請人:牛津免疫科技有限公司