天然形式人自分泌運動因子特異的抗體、其篩選方法、以及通過測定自分泌運動因子而檢...的制作方法

專利名稱：：天然形式人自分泌運動因子特異的抗體、其篩選方法、以及通過測定自分泌運動因子而檢...的制作方法
技術領域：
：本發明涉及特異性識別并結合天然形式人自分泌運動因子(autotaxin)的抗體、其篩選方法、以及通過測定人樣品中的自分泌運動因子濃度而檢測惡性淋巴瘤的方法和檢測試劑。
背景技術：
：人自分泌運動因子是具有約125kDa分子量的糖蛋白，該蛋白質在1992年首次由M.L.Stracke等從A2058人黑素瘤細胞的培養基中作為誘導細胞運動性的物質分離(J.Biol.Chem.，256，2524，1992)。隨后，1994年,J.Murata等使用cDNA克隆分析其結構，明確了該蛋白質在氨基末端側具有單一跨膜部分，在胞外結構域中包含2個生長調節素B區、I型磷酸二酯酶活性區、和EF手型的環區，具有磷酸二酯酶活性(J.Biol.Chem"269,30479,1994)。然而，仍沒有獲得任何明確的涉及自分泌運動因子誘導細胞運動性的功能的證據。2002年，在人(A.Tokumura等，J.Biol.Chem.，277，39436，2002)和牛血清(M.Umezu-Goto等，J.CellBiol"158，227，2002)中鑒定到新的溶血磷脂酶D，從而首次證實由這種酶活性所產生的溶血磷脂酸誘導細胞運動性。基于自分泌運動因子運動性誘導功能的推斷，Stracke等在美國專利號5,499,753(1995)中描述使用自分泌運動因子作為人癌侵潤能力的標志物。此外，Stracke等也在美國專利號5，731，167(1998)中提出通過施用與毒素結合的抗自分泌運動因子抗體的癌癥療法。這樣就需要特異性識別人自分泌運動因子的抗體，但由于自分泌運動因子相對大量地以多種形式含于動物血清中，故認為極難獲得針對通常存在于血清中的沒有經歷突變的自分泌運動因子(天然形式的自分泌運動因子)具有特異性和強大結合力的抗體。實際上，沒有用于定量自分泌運動因子本身的方法，并且目前通過評價其具有的溶血磷脂酶D活性間接地定量自分泌運動因子。用于測定這種酶的活性的方法是復雜的并且通常需要幾個小時與底物的孵育時間以使此酶發揮酶活性。此外，還存在千擾性因素，如可能在人樣品中存在與自分泌運動因子不同的具有溶血磷脂酶D活性的其它酶、在人樣品中存在因酶活性測定期間溶血磷脂酰膽堿底物分解而產生的溶血磷脂酸和膽堿。這些內在因素至少對酶活性測定中人自分泌運動因子的特異性定量產生一些影響，不是用于定量人自分泌運動因子的高精度方法。實際上，膽堿以約數十mM的濃度含于人精漿中，并且若沒有進行膽堿去除的預處理，則難以基于使用溶血磷脂酰膽堿作為底物所生成的膽堿量而測定精漿中的活性。為數眾多的單克隆抗體已經由幾個研究組(包括我們的研究組)通過用大腸桿菌(^^/^Wc/"'flco/Z)表達人自分泌運動因子的合成的部分肽或部分序列、免疫可溶性人自分泌運動因子而建立(JournalofBiologicalChemistry,269，30479-30484，1994，FEBSLetters,571，197-204，2004)。然而，盡管人自分泌運動因子可以通過使用這些抗體的蛋白質印跡法檢測，然而這些抗體對人樣品中存在的天然形式人自分泌運動因子不表現任何反應性或僅表現極低水平的反應性。因此，極難將這些抗體應用于以人樣品為對象的ELISA測定法等免疫學測定法中，并且它們仍沒有實際使用。根據本發明，可以極高效地建立與人樣品中天然形式的人自分泌運動因子特異性反應的單克隆抗體。也就是說，在通過抗原免疫、細胞融合而制備單克隆抗體時的篩選方法中，通過選擇以與溶液中存在的天然形式抗原的反應性作為指標的抗體，可以建立基于通用方法如ELISA的人自分泌運動因子定量測定體系。此外，由所述方法獲得的抗體是高性能抗體，其通過能夠高效結合并捕獲含于血液等中的人自分泌運動因子，不僅能夠自樣品除去抗原，還能夠純化抗原。發明公開盡管已有教導自分泌運動因子在人組織或體液中存在的濃度因各種疾病而變動的報道，由于迄今不存在用于定量自分泌運動因子的方法，故沒有對其開展詳細分析。盡管已經對在變性條件下如在還原劑存在下的自分泌運動因子的有無和存在比等實施了定性分析，由于仍沒有能夠高效識別并結合以保留其結構和功能的形式而通常存在于身體中的天然形式人自分泌運動因子的抗體，仍沒有建立用于定量人自分泌運動因子的通用方法。此外，雖然通過以自分泌運動因子所具有的溶血磷脂酶D活性作為指標而測定該酶活性，將溶血磷脂酶D活性的變化與疾病之間的因果關系進行了分析，但是由于在這樣的酶活性測定中獲得的測定值包括除人樣品中所含自分泌運動因子的溶血磷脂酶D活性以外的其它的溶血磷脂酶D活性，并且在活性測定時使用的溶血磷脂酰膽堿底物以及在酶活性測定時形成的膽堿內在地含于樣品中等等，因此將所迷方法用作特異性定量自分泌運動因子的標準方法沒有足夠的可靠性。我們找到了用于高效獲得針對天然形式人自分泌運動因子的抗體的方法，并且使用以這種方法所獲得的針對天然形式人自分泌運動因子的抗體成功地提供了能夠精確定量人自分泌運動因子的測定方法和定量試劑，其中所述的測定方法和定量試劑不受活性測定時成為問題的內在物質影響、并且不需要致使樣本變性如通過用還原處理法變性或使用蛋白質變性劑如鹽酸胍或脲變性的預處理。具體地，本申請包括以下發明(1)特異性識別未受到變性的、在生物體內的存在狀態中的天然形式人自分泌運動因子的抗體的篩選方法，該方法包括以下步驟將能夠捕獲該抗體的候選抗體的結合因子結合在固相上；將該抗體的候選抗體與所述結合因子結合；使天然形式人自分泌運動因子在已經使所述候選抗體作用的體系中作用；和以天然形式人自分泌運動因子對所述抗體的結合力作為指標，選擇特異性識別該天然形式人自分泌運動因子的抗體。(2)(1)的方法，其中所述結合因子是抗體；(3)(1)或(2)的方法，其中所述天然形式人自分泌運動因子是具有多聚組氨酸標簽的重組人自分泌運動因子抗原；(4)(3)的方法，其中所述天然形式人自分泌運動因子對所述抗體的結合力通過利用特異性結合具有多聚組氨酸標簽的所述重組人自分泌運動因子抗原的經標記的抗多聚組氨酸抗體而測定；(5)(4)的方法，其中所述經標記的抗多聚組氛酸抗體是酶標記的抗多聚組氨酸抗體。(6)特異性識別未受到變性的、在生物體內的存在狀態中的天然形式人自分泌運動因子的抗體，所述抗體能夠通過包括以下步驟的方法取得將能夠捕獲該抗體的候選抗體的結合因子結合在固相上；將該抗體的候選抗體與所述結合因子結合；使天然形式人自分泌運動因子在已經使所述候選抗體作用的體系中作用；和以天然形式人自分泌運動因子對所述抗體的結合力作為指標，選擇特異性識別該天然形式人自分泌運動因子的抗體。(7)(6)的抗體，其中所述結合因子是抗體。(8)(6)或(7)抗體，其中所述天然形式人自分泌運動因子是具有多聚組氨酸標簽的重組人自分泌運動因子抗原；(9)(8)的抗體，其中所述天然形式人自分泌運動因子對所述抗體的結合力通過利用特異性結合具有多聚組氨酸標簽的所述重組人自分泌運動因子抗原的經標記的抗多聚組氨酸抗體而測定。(10)(9)的抗體，其中所述經標記的抗多聚組氨酸抗體是酶標記的抗多聚組氨酸抗體。根據如上所述的本發明，可以高效地獲得能夠特異性識別并結合天然形式人自分泌運動因子的單克隆抗體，并且可以建立能夠使用這種抗體定量無需預處理等的人樣品中自分泌運動因子的測定方法。使用根據前述發明獲得的天然形式人自分泌運動因子的測定試劑測定人血清則能夠診斷癌癥或診斷慢性肝病。此外，根據前述方法，可以提供能夠這樣的定量人自分泌運動因子的方法和檢測試劑，所述方法和檢測試劑允許在短時間內實施定量并且不受在基于溶血磷脂酶D酶活性而估計自分泌運動因子量中總是造成問題的內在性干擾測定因素或竟爭性酶的影響。此外，本發明的發明人也發現含于血液等中的人自分泌運動因子可以通過使用通用性人自分泌運動因子定量測定體系如ELISA，使用與人樣品中的天然形式人自分泌運動因子特異性反應的單克隆抗體而容易地且短時間內定量。而且，使用這種測定體系進行了深入的研究，發現在淋巴瘤患者并且尤其是在濾泡性淋巴瘤患者中，血清中的自分泌運動因子濃度顯示為高值。惡性淋巴瘤大致地分成由霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤這兩種類型，并且在日本大約90。/。的淋巴瘤分類為非霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤基于形態學特征(病理學的分類)、細胞性狀的特征(B細胞樣、T細胞樣或NK細胞樣)、染色體信息和/或遺傳學信息進行分類，并且根據WHO分類分成非常多樣的分類。據報道作為非霍奇金淋巴瘤的分類之一的濾泡性淋巴瘤在日本占10-15%惡性淋巴瘤，并且已經證實近年來該數字具有遞增趨勢。惡性淋巴瘤的診斷通過淋巴結活組織檢查法、胸部X線檢查法、計算機化斷層顯像術(CT)、核磁共振成像檢查法(MRI)、鎵(Ga)閃爍照相術或正電子成像術(PET)等評估該疾病的進展而進行。雖然也使用血液檢查法，如測定乳糖脫氫酶(LDH)、C反應蛋白(CRP)或可溶性白介素-2(IL-2)受體，不過這些物質均不是對惡性淋巴瘤特異的診斷標志物，因而需要對惡性淋巴瘤特異的診斷標志物。盡管已經存在說明自分泌運動因子在人組織或體液中存在的濃度因各種疾病而變動的報道，但沒有對人自分泌運動因子與多種疾病的因果關系進行詳細分析，原因是不存在對人自分泌運動因子定量的方法。根據本發明，血清等的人樣本中自分泌運動因子的濃度能夠容易地在短時間內且以高可靠性定量。這種測定方法通過使用測定試劑而有可能確定迄今仍未確定的自分泌運動因子濃度與各種疾病之間的關系。此外，由于使用這種測定體系進行反復深入研究，發現也已經有可能檢測惡性淋巴瘤并且尤其檢測濾泡性淋巴瘤，其中對所述的惡性淋巴瘤和濾泡性淋巴瘤的診斷在以往因缺乏血清標志物是復雜且困難的。本發明的發明人通過建立使用針對人自分泌運動因子的抗體的免疫化學測定方法，使得不受在酶活性測定時造成問題的內在物質影響、且不需要樣品預處理而能夠精確定量人自分泌運動因子。由于使用這種測定試劑進行反復深入研究，發現在惡性淋巴瘤患者并且尤其在濾泡性淋巴瘤患者中血清中的自分泌運動因子濃度顯示為高值，因而可能提供能夠檢查或輔助檢查濾泡性淋巴瘤的試劑。此外，這種試劑也能夠通過測定自分泌運動因子所具有的溶血磷脂酶D酶活性而檢查或輔助檢查濾泡性淋巴瘤，盡管所述測定在復雜性和精度方面略次。因此，本申請還包括以下發明(n)用于檢查惡性淋巴瘤的方法，包括測定人樣品中的自分泌運動因子的濃度并且在所述測定值顯示比由正常健康受試者的測定值組成的正常值顯著更高值的情況下判定是惡性淋巴瘤。(12)(ll)的方法，其中所述的惡性淋巴瘤是濾泡性淋巴瘤。(13)(11)或(12)的方法，其中(ll)的自分泌運動因子是全長自分泌運動因子、部分切割的自分泌運動因子或部分基因突變的自分泌運動因子。(14)(11)-(13)任一項中所述的方法，其中(ll)的樣品是全血、血細胞、血清、血漿等的人血液成分、或人細胞或組織的提取液；(15)(11)-(14)任一項中所述的方法，其中(ll)的用于測定自分泌運動因子濃度的方法是使用抗體的免疫化學測定法；(16)(11)-(15)任一項中所述的方法，其中(15)的抗體是單克隆抗體；(17)(11)-(16)任一項中所述的方法，其中自分泌運動因子在所述樣品中的濃度通過使(15)的抗體與該樣品接觸并且檢測與該樣品結合或不結合的抗體而測定。(18)(11)-(16)任一項中所述的方法，其中自分泌運動因子在所述樣品中的濃度通過使(14)的抗體與該樣品接觸并且檢測與該抗體結合或不結合的自分泌運動因子而測定。(19)(11)-(18)任一項中所述的方法，其中(15)-(18)任一項所述的方法是使用酶標記物、同位素標記物或熒光標記物等的竟爭性方法、使用夾心法或熒光偏振法等的均相測定方法或使用表面等離子體共振分析法(surfaceplasmonresonanceanalysismethod)的結合測定方法等。(20)惡性淋巴瘤檢測試劑，使用(11)-(19)任一項中所述的測定方法作為其原理。(21)檢測方法，包括使用(11)-(14)任一項中所述的方法測定自分泌運動因子所具有的溶血磷脂酶D活性、并且在所述測定值顯示比由正常健康受試者的測定值組成的正常值顯著更高的值情況下判定是惡性淋巴瘤。(22)用于檢查惡性淋巴瘤的方法，其特征在于以(21)的檢測方法作為原理。根據前述發明，惡性淋巴瘤并且尤其濾泡性淋巴瘤可以通過用定量試劑定量人樣品中自分泌運動因子的濃度而檢測，無需預處理人樣品中的自分泌運動因子等，其中所述的定量試劑使用對人自分泌運動因子特異的單克隆抗體。使用這種免疫學定量試劑有可能提供這樣的檢測試劑，其能夠在短時間內定量人自分泌運動因子并且不受含于樣品中的妨礙測定的內在因素或竟爭性酶影響。此外，盡管通過上述發明測定溶血磷脂酶D酶活性對所述免疫化學的定量方法就復雜性和精度而言略次，然而也能夠判斷惡性淋巴瘤，并且能夠提供用于該目的的檢測試劑。附圖簡述圖1顯示多聚組氨酸標簽標記的人自分泌運動因子純化產物的SDS-PAGE、和使用抗自分泌運動因子肽抗體的蛋白質印跡的結果。圖2顯示使人自分泌運動因子直接結合至免疫板時的抗體的反應性。圖3顯示通過抗大鼠IgG抗體結合至免疫板的抗人自分泌運動因子抗體與溶液中存在的人自分泌運動因子的反應性。圖4顯示由抗體所致的對血清中人自分泌運動因子的溶血磷脂酶D活性的吸收性能。圖5顯示由抗體所致的對動物血清中自分泌運動因子的溶血磷脂酶D活性的吸收性能。圖6顯示全長人自分泌運動因子純化產物的SDS-PAGE、和使用抗自分泌運動因子肽抗體的蛋白質印跡結果。圖7顯示使用雙抗體夾心法，抗人自分泌運動因子單克隆抗體與人自分泌運動因子的反應性。圖8顯示使用獲得的抗人自分泌運動因子抗體群，通過組合評價在夾心ELISA測定體系中的反應性。圖9是顯示用兩步驟雙抗體夾心ELISA法測定具有已知濃度的人自分泌運動因子(O、0.34、0.675、1.35、2，70和5.40ftg/mL)的6個標準品時，在450nm處的吸光度與自分泌運動因子濃度之間關系的圖。圖10顯示通過兩步驟雙抗體夾心ELISA法在42份人血清樣品中所測定的人自分泌運動因子濃度與溶血磷脂酶D活性之間的相關性。圖11是顯示用一步驟雙抗體夾心ELISA法測定具有已知濃度的人自分泌運動因子(O、0.34、0.675、1.35、2.70和5.40ng/mL)的6個標準品時，在450nm處的吸光度與自分泌運動因子濃度之間關系的圖。圖12顯示通過一步驟雙抗體夾心ELISA法在42份人血清樣品中所測定的人自分泌運動因子濃度與溶血磷脂酶D活性之間的相關性。圖13顯示使用一步驟雙抗體夾心ELISA法，使用PSA、CA19-9、CA153和CA125測定值超過截止值(cut-off)的樣品，檢測相對于正常健康受試者的自分泌運動因子濃度的結果。任一樣品組相對于正常健康受試者均顯示為顯著性差異P〈0.001。圖14顯示使用一步驟雙抗體夾心ELISA法測定慢性肝病患者和正常健康受試者的血清中人自分泌運動因子濃度的結果。圖15顯示測定精漿中溶血磷脂酶D活性的結果。圖16顯示使用6個濃度標準品時所獲得的校準曲線。回歸方程表述為Log(速率)=aLog(濃度)3十bLog(濃度)2+cLog(濃度)+d,并且所示標準曲線的相應常數為a=-0.12278770、b=-0.30068255、c=1.26861618和d=1.56201600。速率表示單位時間生成的4-曱基傘形酮的量(nmol/L.秒)。圖17顯示測定男性的血清自分泌運動因子濃度并根據白血病和惡性淋巴瘤類型作出分類的結果。縱軸表示自分泌運動因子(ATX)濃度、橫軸表示每種疾病的分類。NHS表示正常健康受試者，AL表示急性白血病，CL表示慢性白血病，HD表示霍奇金淋巴瘤，NHL表示非霍奇金淋巴瘤，其它表示其它白血病和淋巴瘤。圖18顯示測定女性血清的自分泌運動因子濃度并根據白血病和惡性淋巴瘤類型作出分類的結果。縱軸表示自分泌運動因子(ATX)濃度、橫軸表示每種疾病的分類。NHS表示正常健康受試者，AL表示急性白血病，CL表示慢性白血病，HD表示霍奇金淋巴瘤，NHL表示非霍奇金淋巴瘤，其它表示其它白血病和淋巴瘤。圖19顯示測定男性血清的自分泌運動因子濃度并根據非霍奇金淋巴瘤類型作出分類的結果。縱軸表示自分泌運動因子(ATX)濃度、橫軸表示每種型的非霍奇金淋巴瘤。NHS表示正常健康受試者，Burkitt表示伯基特淋巴瘤，LBL表示淋巴母細胞性淋巴瘤，NHL(MCL)表示套細胞淋巴瘤，NHL(DLBC)表示彌漫性大B細胞淋巴瘤并且NHL(FL)表示濾泡性淋巴瘤。圖20顯示測定女性血清的自分泌運動因子濃度并根據非霍奇金淋巴瘤類型作出分類的結果。縱軸表示自分泌運動因子(ATX)濃度、橫軸表示每種型的非霍奇金淋巴瘤。NHS表示正常健康受試者，Burkitt表示伯基特淋巴瘤，LBL表示淋巴母細胞性淋巴瘤，NHL(MCL)表示套細胞淋巴瘤，NHL(DLBC)表示彌漫性大B細胞淋巴瘤并且NHL(FL)表示濾泡性淋巴瘤。圖21顯示自分泌運動因子(ATX)濃度與溶血磷脂酸(LPA)濃度之間相關性試驗的結果。實施本發明的最佳方案為了制備免疫抗原，基于人自分泌運動因子的基因信息，通過使用多核苷酸探針篩選cDNA文庫或基因組文庫而獲得編碼人自分泌運動因子基因的核酸分子。cDNA文庫可以容易地通過使用已知方法從組織中分離RNA而制備，或可以使用市售cDNA文庫。使用所得的人自分泌運動因子cDNA通過重組入表達載體中，可以在多種表達系統中表達抗原。此外，導入通常使用的標記標簽如多聚組氨酸標簽或Myc標簽至人自分泌運動因子基因的末端也有效地用于簡化后續抗原純化操作。盡管蛋白質表達系統可以是大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或動物細胞等，優選昆蟲細胞-桿狀病毒系統，因為該系統能夠大規模地表達并且表達出與天然形式人自分泌運動因子具有相似結構(如糖鏈添加)的蛋白質。在表達具有多聚組氨酸標簽的自分泌運動因子的情況下，所述自分泌運動因子可以容易地用金屬螯合柱等純化。此外，c-myc標簽等允許以抗c-myc抗體親和柱純化。這些方法是其技術已經充分建立的標準方法。可以采用任何方法進行本發明中所用的抗原免疫以產生抗體，如通過用純化抗原免疫動物，只要所述方法的技術已經建立。對所用動物沒有特別的限制，只要它具有抗體產生能力即可。所述動物的實例包括通常使用的哺乳動物如小鼠、大鼠或兔等，使用雞等也可以。例如，在使用小鼠的情況下，通過施用純化的人自分泌運動因子抗原和弗氏完全佐劑形成的乳劑至皮下、至足墊或至腹腔而實施免疫。有時還存在根據需要通過用純化抗原和弗氏不完全佐劑反復追加免疫以提高抗體滴度的情況。在細胞融合前數日，作為最終免疫，僅對動物施用抗原，而不施用佐劑和形成乳劑。雖然所施用的抗原量可以在約0.4jig/g動物體重的級別上，然而只要該抗原量是不發生由抗原不足或過量引起的免疫耐受的量就沒有問題。可以采用任意方法制備本發明中所用的雜交瘤細胞，只要所述方法的技術已經被建立，并且融合方法可以是使用電融合法或使用聚乙二醇等試劑的任何方法。下對經免疫動物的B細胞和骨髓瘤細胞實施細胞融合，隨后從HAT培養基中選出抗體產生細胞。所選的雜交瘤細胞可以用來通過使用有限稀釋法進行單克隆化而建立產生單克隆抗體的雜交瘤細胞。用于選擇本發明中所用雜交瘤的方法以不實施在常規ELISA法中所開展的選擇為特征，其中在常規ELISA法中將免疫抗原結合至固相并且隨后基于與該固相的表面所結合的抗原的反應性開展選擇。其原因在于雖然使用其中抗原結合在固相上的ELISA的篩選方法可以獲得具有反應性的眾多抗體，然而所有這些抗體幾乎都不能夠高效地捕獲血清中存在的人自分泌運動因子。在本發明中所用的抗體篩選方法中，將能夠捕獲雜交瘤細胞培養上清液中所含抗體的1次抗體或其它抗體結合因子如蛋白A或蛋白C與免疫板結合。例如，在目的是獲得大鼠抗體的情況下，將抗大鼠免疫球蛋白抗體與免疫板結合。在實施封閉處理以防止非特異性結合，如通過用牛血清白蛋白等處理其中1次抗體等所結合的所述免疫板表面后，添加通過細胞融合獲得的雜交瘤細胞的培養上清液至免疫板以捕獲1次抗體。用緩沖液如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌該免疫板以除去未反應的物質后，添加具有多聚組氨酸標簽的重組人自分泌運動因子抗原(帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子)。所述帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子已經證實優選地具有溶血磷脂酶D活性。通過使反應持續一定時間量，這種帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子被雜交瘤培養上清液中的抗體捕獲。此態，其以如身體內的相同方式維持溶液中的天然形式，并且雜交瘤培養上清液中因這種反應而能捕獲帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子的抗體預期能夠捕獲人樣品中的人自分泌運動因子。繼而，對抗體捕獲的帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子的檢測用針對所捕獲的帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子中多聚組氨酸標簽的酶標記抗多聚組氨酸抗體或形式為His探針-HRP(PierceBiotechnology,Inc.目錄號15165)的酶標記探針實施。最終檢測可以利用所述酶的顯色底物、熒光底物或化學發光底物顯像而實施，并且例如，可以通過使用作為過氧化物酶底物的四曱基聯苯胺(TMB)，通過450nm波長處的吸光度而檢測發色。用這種方法獲得的全部抗體群在人自分泌運動因子與免疫板直接結合的常規ELISA法中幾乎均不顯示反應性。此外，不能構建出使用對結合抗原直接顯示反應性的抗體的雙抗體夾心免疫測定體系。也就是說，這表明通過其中人自分泌運動因子與免疫板直接結合的常規ELISA法極難獲得能夠有效捕獲天然形式人自分泌運動因子的抗體。對本發明中所用的抗體純化方法沒有特別的限制，只要它是其技術已經建立的方法。例如，在選擇產生目的抗體的雜交瘤后，通過有限稀釋法建立產生單克隆抗體的雜交瘤，隨后回收細胞培養上清液。在根據需要通過硫酸銨沉淀法濃縮抗體后，此單克隆抗體可以使用固定有蛋白A或蛋白G的固相支持物，通過親和層析法純化。此外，純化的抗體可以通過以生物素或酶如堿性磷酸酶標記而用來驗證人自分泌運動因子雙抗體夾心免疫測定體系的建立。這些方法是其技術已經充分建立的標準方法。用于測定本發明中公開的天然形式人自分泌運動因子的方法可以是任何方法，只要它允許特異性地捕獲天然形式人自分泌運動因子并且其結果是能夠檢測純化抗體-天然形式人自分泌運動因子的復合物。所述方法優選地是如免疫測定法通常使用的利用標記抗原和天然形式人自分泌運動因子竟爭抗體的竟爭法，或使用不同表位的兩種抗體與天然形式人自分泌運動因子之間形成三組分復合物的夾心法，原因是這些方法簡單并且容易廣泛使用。在抗體結合于支持物的情況下，對支持物沒有特別的限制，只要它用在免疫測定法中，支持物的實例包括免疫板、乳膠粒子、磁性微粒子、硝酸纖維素膜、PVDF膜。在使用支持物的情況下，可以通過這樣的方法檢測人自分泌運動因子，所述的方法是包括檢測由固定于該支持物上的抗體捕獲的人自分泌運動因子的酶活性的方法，或使樣品與已經在其表面固定有抗體的芯片接觸，隨后檢測天然形式人自分泌運動因子結合依賴性信號的方法，如表面等離子體共振法。此外，人自分泌運動因子也可以用均相測定法如通過檢測因熒光標記抗體與天然形式人自分泌運動因子之間結合所產生的熒光進行定量。已經充分建立了用于這些試劑和裝置的1技術。在前述測定方法中，就特異性、靈敏度和通用性而言，使用不同表位的雙抗體夾心免疫測定方法是優異的。通過使用純化的抗體群和標記抗體群，驗證是否可以建立以重組人自分泌運動因子作為樣品的夾心測定體系，從而選擇測定體系的能夠構建抗人自分泌運動因子單克隆抗體的組合。具體地，將純化的非標記的抗天然形式人自分泌運動因子單克隆抗體與免疫板結合，隨后用牛血清白蛋白等在免疫板的表面實施封閉處理。隨后將重組人自分泌運動因子添加至該免疫板并用固相抗體捕獲。用緩沖液如PBS洗滌該免疫板以除去未反應的物質后，使針對標記的天然形式人自分泌運動因子的抗體反應以形成天然形式人自分泌運動因子與兩種類型抗體的夾心復合物。用緩沖液如PBS洗滌該免疫板以除去未反應的物質后，在已經對抗體實施酶標記的情況下添加底物，并且在需要其它反應如生物素標記的情況下，促使酶標記的鏈霉抗生物素蛋白等反應。使用針對所述標記酶的顯色底物、焚光底物或化學發光底物實施對重組人自分泌運動因子的檢測，其中所述的重組人自分泌運動因子被兩種抗天然形式人自分泌運動因子抗體捕獲。同樣地在不含重組人自分泌運動因子的緩沖液中實施上述實驗，用作背景值。不使用重組人自分泌運動因子的測定值是背景低值，且以測定值顯著高的組合作為人自分泌運動因子免疫測定體系候選物。定體系候選物的可靠性，制備重組人自分泌運動因子和人血清的連續稀釋樣品，并且驗證這些樣品是否顯示稀釋倍數依賴的反應性。在對抗體組合已經觀察到這種依賴性的情況下，通過使用具有已知溶血磷脂酶D酶活性的人血清樣品定量人自分泌運動因子而進一步實施-驗證。也就是說，如此選擇免疫測定體系作為用于測定天然形式人自分泌運動因子的方法，即通過驗證溶血磷脂酶D酶活性與人自分泌運動因子濃度之間的相關性，并且選擇其中觀察到溶血磷脂酶D酶活性與人自分泌運動因子濃度之間相關性的免疫測定體系。使用所選的兩種抗體組合制備天然形式人自分泌運動因子的測定試劑。在兩步驟夾心測定試劑的情況下，將兩種抗體之一與能夠B/F分離的支持物如免疫板或磁粒子結合。結合方法可以是利用疏水鍵的物理結合法或使用能夠使兩種物質間交聯的接頭試劑等的化學結合法。使用牛血清白蛋白、脫脂乳或市售的免疫測定封閉劑等在該支持物的表面上實施旨在避免非特異性結合的封閉處理以獲得第一試劑。隨后制備含有識別不同表位的另一種抗體的溶液，其中所述的另一種抗體已經被標記用作第二試劑。抗體標記物優選地例如是酶如過氧化物酶或堿性磷酸酶、可檢測物質如熒光物質、化學發光物質或放射性同位素、或存在特異的結合配偶體(如生物素或抗生物素蛋白)的物質。此外，所述第二試劑溶液優選地是其中可以有利實施抗原-抗體反應的緩沖液，如磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。對實際樣品的測定包括使第一試劑與樣品在恒定溫度上接觸持續恒定時間。反應條件優選地包括在溫度4至40。C反應5分鐘至3小時。未反應的物質通過B/F分離除去，接下來與第二試劑在恒定溫度上接觸持續恒定時間，形成夾心復合體。反應條件優選地包括在溫度4至40。C反應5分鐘至3小時。未反應的物質通過B/F分離除去，隨后從使用人自分泌運動因子已知濃度作為標準所制備的校準曲線中定量標記抗體的標記物并定量樣品中人自分泌運動因子的濃度。在一步驟夾心測定試劑的情況下，制備這樣的試劑，其中以與兩步驟夾心測定試劑相同的方式進行抗體與支持物結合、封閉處理。將含有標記抗體的緩沖溶液添加至已固定有抗體的固相支持物以獲得試劑。根據需要，該試劑也可以是凍干產物形式。在一步驟試劑的情況下，存在因4艮據一步驟試劑中所用抗原量與抗體量之間平衡造成抗原或抗體過剩或短缺發生而難以構建測定體系的眾多情況。在本發明中，在ELISA法的情況下，通過96孔免疫板中每孔使用5至500ng并優選100ng抗體結合的支持物以及1至100ng并優選10ng標記抗體而獲得良好的結果。雖然用于測定的人樣品可以是血清、血漿、尿、精漿或腦脊液等，所用樣品的稀釋倍數優選地是O(未稀釋)-IOO,并且在血清或血漿的情況下通過使用五倍稀釋的100nL樣品并且在精漿的情況下使用未稀釋的100jiL樣品獲得良好結果。通過本發明的測定試劑定量的樣品中人自分泌運動因子濃度與自分泌運動因子所具有的溶血磷脂酶D活性顯示良好相關性。子而診斷癌癥。在樣品的自分泌運動因子濃度之間的比較中，前列腺癌標志物PSA、消化器癌標志物CA19-9、乳腺癌標志物CA153、卵巢癌標志物CA125測定值超過截止值的自分泌運動因子濃度，特別地與不呈現臨床癥狀的正常健康受試者的自分泌運動因子濃度比較，任一癌癥患者樣品相對于正常健康受試者組顯示顯著差異p〈0,001，因而證實這樣的結果，其說明診斷癌癥或輔助診斷癌癥的可能性。尤其在乳腺癌和卵巢癌中，相對于正常健康受試者顯示顯著高的值，并且獲得了表明這種測定試劑有效用于診斷癌癥或輔助診斷癌癥的結果。尤其，可以通過使用這種測定試劑測定患者樣品中的人自分泌運動因子而檢測出惡性淋巴瘤并且尤其濾泡性淋巴瘤。比較在診斷患有白血病或惡性淋巴瘤的患者樣品中的自分泌運動因子濃度與無任何特殊臨床癥狀的正常健康受試者中的自分泌運動因子濃度，表明非霍奇金淋巴瘤患者顯示顯著較高的值，此外，濾泡性淋巴瘤尤其顯示顯著高的值，并且獲得這樣的結果，其表明這種測定試劑有效用于檢測癌癥或輔助檢測惡性淋巴瘤、尤其非霍奇金淋巴瘤并且更具體地是濾泡性淋巴瘤。也可以通過使用本發明的測定試劑測定慢性肝病患者的血清中的人自分泌運動因子而診斷慢性肝病。測定了慢性肝病患者樣品和正常健康受試者中的人自分泌運動因子濃度，獲得這樣的結果，其表明自分泌運動因子濃度在慢性肝病患者的血清中高，顯著性差異p<0.0001，因此表明這種測定試劑可用于診斷或輔助診斷慢性肝病。此外，作為驗證人自分泌運動因子濃度與其它慢性肝病標志物之間相關性的結果，觀察到人自分泌運動因子濃度與透明質酸濃度、血清白蛋白濃度、總膽紅素濃度、血小板計數及凝血酶原時間之間的相關性，并且反映了慢性肝病的程度，因此表明對人自分泌運動因子血清濃度的測定極其有效地用于診斷慢性肝病。實施例盡管下文給出了本發明的實施例，不過本發明不限于這些實施例。實施例1:重組人自分泌運動因子的表達根據常用方法，使用RT-PCR從人肝cDNA文庫中克隆自分泌運動因子-t(GenBank登錄號L46720)的第1-2589位核苷酸(SEQIDNO:1)。將此cDNA插入桿狀病毒轉移載體pFASTBac-l(Invitrogen)，并且使用Bac-to-Bac系統(Invitrogen)，根據操作手冊制備用于表達全長人自分泌運動因子的桿狀病毒。將終止密碼子(TAA，核苷酸序列第25卯-2592位)從克隆的全長人自分泌運動因子cDNA中除去，隨后根據操作手冊添加6個組氨酸殘基以制備用于表達具有多聚組氨酸的多聚組氨酸標簽化人自分泌運動因子的桿狀病毒。含有已表達的全長人自分泌運動因子和帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子的培養上清液能夠通過使用這些桿狀病毒，根據常用方法感染sf9或sf21等進行制備。實施例2:帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子的純化1升昆蟲細胞系sf21細胞(5xl()5個細胞/mL)以用于表達帶多聚組氨酸標簽的自分泌運動因子的桿狀病毒感染，隨后在28。C培養4日。培養結束后，將細胞通過離心分離法(10分鐘，3000轉/分鐘)分離，隨后用0.45jim濾器除去細胞碎片等沉淀物。回收的培養上清液用TBS(Tris-緩沖鹽水10mMTris-HCl)，150mMNaCl，pH7.4)透析后，使用BD-TALON金屬親和樹脂(BDBiosciences,目錄號63501)裝填的金屬螯合柱，根據所提供的手冊進行純化。具體地，將該柱用5mL體積的樹脂裝填。添加50mL的50mMCoCl2溶液至該柱以結合鈷。用含有300mMNaCl的水溶洗滌該柱后，用50mM磷酸鈉和300mMNaCl的pH7.7水溶液(洗滌緩沖液)平衡所述柱。隨后添加含有帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子的50mL樣品。用100mL洗滌緩沖液從該柱中洗去未結合的物質，并且證實通過該柱的溶液在280nm處的吸光度變為0.01或更小。用約15mL含有10mM咪唑的洗滌緩沖液、并隨后用含有100mM咪唑的洗滌緩沖液從該柱中洗脫目的物質。以1mL級分回收洗脫的樣品，并且通過SDS-PAGE驗證帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子在每個級分中的純度。不回收初始級分，因其含有多的雜質，回收并混合那些主要含有目的的帶多聚組氨酸標的人自分泌運動因子抗原。圖1顯示帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子純化產物的SDS-PAGE圖像、和使用抗自分泌運動因子肽抗體的蛋白質印跡的結果。泳道M表示分子量標記。泳道1顯示在還原條件下以1網/泳道對純化抗原實施SDS-PAGE，隨后用CBB染色的結果。泳道2-5顯示蛋白質印跡法的結果。在還原條件下以0.25jig/泳道對純化抗原實施SDS-PAGE后，將蛋白質轉移至PVDF膜，此后對所述PVDF膜以含有3%脫脂乳的TBS封閉處理過夜。用TBS洗滌后，將此膜浸泡在含有1%BlockAce(大日本制藥公司制)和0.05%吐溫20的TBS中。添加l^g/mL大鼠抗自分泌運動因子肽的單克隆抗體(識別氨基酸序列第49-59位(SEQIDNO:2))至泳道2，同時添加lpg/mL兔抗自分泌運動因子肽的多克隆抗體(識別氨基酸序列第671-686位(SEQIDNO:3))至泳道4，隨后使其反應2小時。(對泳道3和泳道5的樣品不添加抗體)。用含有0.05%吐溫20的TBS(TBST)洗滌后，添加含有0.3fig/mL堿性辨酸酶標記的抗大鼠IgG抗體(AmericanQualex,目錄號A103AT)和1%BlockAce的TBST至泳道2和泳道3的樣品，而添加含有0.3pg/inL堿性磷酸酶標記的抗兔IgG抗體(Zymed)和1%BlockAce的TBST至泳道4和泳道5的樣品。使其反應后2小時后，將此膜用TBST充分洗滌并且使用CDP-STAR(PerkinElmer),以感光膠片檢測化學發光。如泳道l中所示，在CBB染色后顯示單一條帶。此外，根據使用抗肽抗體的蛋白質印跡法的結果，由于使用識別氨基酸序列笫49-59位(SEQIDNO:2)和氨基酸序列第652-666位(SEQIDNO:3)的兩種抗體檢測純化的抗原，故證實該抗原是作為目的的帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子。在蛋白質印跡法中檢測到兩條帶，能夠獲得說明糖鏈差異和在培養或純化步驟中存在分解的結果。實施例3:制備單克隆抗體7周齡雌性Wistar-Lewis大鼠在醚麻醉下用與弗氏完全佐劑混合的250jig抗原對后足免疫。1個月后，從大鼠中取下腹股溝淋巴結和髂淋巴結，隨后回收B細胞。細胞融合根據常規方法在聚乙二醇存在下以小鼠骨髓瘤細胞系PAI實施，使用HAT培養基實施選擇約10日，并且目的抗體通過實施例4的抗體產生性雜交瘤篩選法而選出。在篩選呈陽性的那些孔中的細胞通過使用有限稀釋法的單克隆過程而確立作為雜交瘤。在使用HT培養基培養約IO日后，培養過程最終用雜交瘤培養基繼續進行，并且回收上清液以回收抗體。使用在500mlGIT培養基(大日本住友制藥)中添加有經過濾除菌的27.5mLNCTC-109培養基(Invitrogen)、5.5mL非必需氨基酸(Invitrogen)、5.5mL青霉素/鏈霉素/谷氨酸(Invitrogen)的培養基作為雜交瘤細胞培養用培養基。使用向該培養基中添加HAT(Sigma-AldrichCo.，HYBRYMAX，目錄號H0262)的培養基作為HAT培養基，而使用向其中添加HT(Sigma-AldrichCo.,HYBRYMAX，目錄號H0137)的培養基作為HT培養基。實施例4:雜交瘤篩選法將抗大鼠免疫球蛋白抗體(AmericanQualex，目錄號A1(K3UT)以250ng/孑L包被到96孔免疫板上(MaxiSorp;Nalge，NUNCInternational,目錄號430341)。更具體地，抗大鼠免疫球蛋白抗體用TBS稀釋以制備5ng/mL溶液。隨后以50fiL/孔添加這種溶液至所述免疫板并在4。C過夜保存。繼而，用TBS洗滌3次后，以250pL/孔添加含有3。/。牛血清白蛋白(BSA)的TBS溶液至各孔，隨后使其在室溫放置2小時。用TBS洗滌3次后，以50^iL/孔添加雜交瘤細胞的培養上清液并且使其在室溫放置2小時。用TBST洗滌6次后，以50pL/孔添加含有0.6|ig/mL帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子、0.1%吐溫20和1%BSA的TBS并且在室溫i文置2小時。用TBST洗滌6次后，以50nL/孔添加含有ljig/mLHis探針-HRP(PierceBiotechnologyInc.，目錄號15165)、0.1%吐溫20和1%BSA的TBS，隨后^f吏其在室溫;故置30分鐘，用TBST洗滌6次后，以50jiL/孔添加TMB底物(Kirkegaard&PerryLaboratories,Inc.,目錄號50-76-00)并iU吏其在室溫放置30分鐘。用IN磷酸終止反應，隨后測定在OD450處的吸光度。此時，獲得作為對照數據的除不含帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子外，同時實施相同過程的結果用作背景。選擇在帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子存在下相對于對照數據顯示出反應性的那些克隆作為陽性克隆，并且通過有限稀釋法建立產生單克隆抗體的細胞系。實施例5:抗體純化和生物素標記回收單克隆化的抗體產生細胞的培養上清液并且用HiTrap蛋白GHP(GEHealthcareBioscienceInc.,目錄號17-0405-01)進行抗體純化。對用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，10mM磷酸，150mMNaCl，pH7.4)進行了緩沖液替換的前述柱，使此培養上清液以流速20mL/分鐘通過。該柱用體積等于5倍或更多倍數柱體積的PBS充分洗滌以除去未結合的蛋白質。此時，可以通過證實已經通過該柱的緩沖液在OD280處的吸光度為0.01或更小而證實未結合的蛋白質不再殘留。在洗滌該柱后，結合的抗體用100mM甘氨酸，pH2.5的洗脫液洗脫。迅速添加洗脫的抗體至pH8的1/10體積1MTris以中和，并迅速用TBS透析。利用評價抗體的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-LC-biotion(PierceBiotechnology,Inc.,目錄號21338)，對一部分純化的抗體用生物素進行標記。實施例6:評價單克隆抗體針對人自分泌運動因子的反應性使用兩種方法驗證根據實施例5所純化的單克隆抗體針對人自分泌運動因子的反應性，其中所述的方法包括評價在用人自分泌運動因子直接包首先說明用人自分泌運動因子包被免疫板的實施例。以50ng/孔(lng/mL溶液，50fiL/孔)添加純化的重組全長人自分泌運動因子至96孔免疫板(MaxiSorp，NalgeNUNCInternational,目錄號430341)，隨后在4。CS&存過夜以包被該免疫板。然后，用TBS洗滌3次后，以250nL/孔添加含有3%BSA的TBS溶液至各孔并且使其在室溫;故置2小時以實施封閉。用TBS洗滌3次后，以50fiL/孔添加含有l照/mL純化抗體和1%BSA的TBST并且使其在室溫;故置2小時。用TBST洗滌6次后，以50^L/孔添加含有0.3pg/mLHRP-標記的山羊抗大鼠IgG抗體和1%BSA的TBST并且使其在室溫i丈置2小時。用TBST洗滌6次后，以50jiL/孔添加TMB底物，隨后使其在室溫;故置30分鐘。用1N磷酸終止反應，并且測定的在OD450處吸光度的結果示于圖2。縱軸表示單克隆抗體的種類，橫軸表示OD450nm處的吸光度。隨后，顯示以實施例4的方式驗證對溶液中人自分泌運動因子的反應性的結果。抗大鼠免疫球蛋白抗體以250ng/孔包被96孔免疫板(MaxiSorp)上。用TBS洗滌3次后，以250^L/孔添加含有3%BSA的TBS溶液至各孔，隨后4吏其在室溫;改置2小時以進4亍封閉。用TBS洗滌3次后，以50jiL/孔添加具有濃度10fig/mL的純化抗體并且使其在室溫放置2小時。用TBST洗滌6次后，以50nL/孔添加含有0.6ng/mL帶多聚組氨酸標簽的人自分泌運動因子、0.1%吐溫20和1%BSA的TBS并且^f吏其在室溫;故置2小時。用TBST洗滌6次后，以50nL/孔添加含有lpg/mlHis探針-HRP、0.1%吐溫20和1%BSA的TBS并且使其在室溫放置30分鐘。用TBST洗滌6次后，以50jiL/孔添加TMB底物，隨后使其在室溫放置30分鐘。用1N磷酸終止反應，并且測定的在OD450處吸光度的結果示于圖3。縱軸表示單克隆抗體的種類，橫軸表示OD450nm處的吸光度。此外，顯示不含抗人自分泌運動因子抗體的緩沖液的反應性用作背景。圖2和圖3的結果說明，在制備單克隆抗體時所用的常規篩選方法為使抗原結合的ELISA法，在該方法中，極難獲得能夠高效捕獲所得到的血清中存在的天然形式人自分泌運動因子的抗體群。實施例7:由單克隆抗體所致的對血清溶血磷脂酶D活性的吸收通過血清溶血磷脂酶D活性的吸收驗證由抗體所致的對血清中人自分泌運動因子的吸收。添加10fig純化的抗人自分泌運動因子抗體至50jiL(50%懸液)固定有抗大鼠IgG抗體的磁性微粒子BioMag山羊抗大鼠IgGFc(Qiagen，目錄號310144)，制備抗人自分泌運動因子固定化磁性微粒子。用TBST洗掉未反應的抗體后，添加200pL用TBST四倍稀釋的人血清并且使其反應2小時。在反應后，用磁石除去所述磁性微粒子，隨后測定上清液中的溶血磷脂酶D活性。在圖4中顯示了相對于使用未添加抗人自分泌運動因子抗體的抗大鼠IgG抗體固定化磁性微粒子處理后的人血清中溶血磷脂酶D活性而言，驗證活性抑制率的結果。縱軸表示單克隆抗體的種類，橫軸表示活性抑制率(吸收率)。活性吸收率表示相對于不含抗人自分泌運動因子抗體的緩沖液中殘留活性的抑制活性。使用對FEBSLetters,571，197-204，2004中所述方法進行了若干改變的方法實施對溶血磷脂酶I)活性的測定。更具體地，將20jiL樣品與含有2mM溶血磷脂酰膽堿(14:0-溶血磷脂酰膽堿)，100mMTris-HCl，500mMNaCl,5mMMgCl2和0.05%TritonX-100(pH9.0)的20jiL底物溶液混合，隨后允許在37。C反應6小時至過夜。隨后，為了定量這種酶反應形成的膽堿，添加包含0.5mMTOOS(N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺)，10單位/mL辣根過氧化物酶，0.01%TritonX-100和100mMTris國HCl(pH8.0)的150jiLRl溶液，5分鐘后，添加包含1mM4-氨基安替比林，10單位/mL膽堿氧化酶，0.01%TritonX-100和100mMTris-HCl(pH8.0)的50pLR2溶液。30分鐘后，基于已知濃度的氯化膽堿測定在550nm處的吸光度并將該吸光度用作活性值。證實除抗體R10.30和抗體R10.31外的所有抗體均發揮吸收性能(absorbanceperformance)并且顯示反映使用實施例6中的His探針的天然形式人自分泌運動因子在溶液中的結合性能，同時，該結果不反映抗原與免疫板直接結合的結果。在抗體R1(U0和R10.31的情況下，推測來自血清的吸收性能與使用His探針-HRP所獲得的測定值之間的差是因重組人式差異所致，從而導致這些抗體不能夠識別血清中的人自分泌運動因子。實施例8:確認單克隆抗體對其它動物物種的自分泌運動因子的反應性通過血清溶血磷脂酶D活性的吸收驗證實施例5所純化的代表性抗體針對動物血清中自分泌運動因子的反應性。添加10照在實施例5中制備的生物素標記的抗人自分泌運動因子抗體至20jiL固定有鏈霉抗生物素蛋白的磁性微粒子BioMag鏈霉抗生物素蛋白(Qiagen，目錄號311711)(50%懸液)以制備固定有抗人自分泌運動因子的磁性微粒子。用TBST洗掉未反應的抗體后，添加用TBST稀釋2.5倍的125fiL動物血清并且使其反應2小時。在反應后，用磁石除去所述磁性微粒子，隨后測定上清液中的溶血磷脂酶D活性。在圖5和表1中顯示相對于用未添加抗人自分泌運動因子抗體的固定有鏈霉抗生物素蛋白的磁性微粒處理的動物血清的溶血磷脂酶D活性驗證活性抑制率的結果。縱軸表示動物血清的種類，而橫軸表示活性抑制率(吸收率)。活性吸收率顯示了對不含抗人自分泌運動因子抗體的緩沖液中殘留活性的抑制活性。如抗體R10.23所例舉，能夠從針對人自叉反應性的多樣性豐富的抗體群。盡管已經嘗試了使用在大腸桿菌中表達自分泌運動因子片段而獲得的抗原來詳細分析表位的位置，幾乎沒有任何抗體顯示與可溶性自分泌運動因子片段的反應性，因而妨礙了表位的鑒定。然而，因為預計所獲得的單克隆抗體由識別人自分泌運動因子上不同表位的抗體群構成，故所得結果提示有可能使用兩種抗體來建立夾心免疫測定法。表l顯示了抗體所致的對動物血清中自分泌運動因子的溶血磷脂酶D活性的吸收性能；小于10%表示為-、10-50%表示為+、大于50%表示為++<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>實施例9:人自分泌運動因子標準品的制備使用實施例5中純化的抗體制備固定有抗體的支持物，隨后純化抗原并制備其中已經從人血清中除去抗原的人自分泌運動因子零濃度血清。使用這些材料制備在人自分泌運動因子免疫測定中使用的標準品(人自分泌運動因子濃度已知的樣品)。具體地，將根據實施例5純化的25mg單克隆抗體R10.23與HiTrap-NHS-活化的5mL柱(GEHealthcareBioscienceInc.,目錄號17-0717-01)根據手冊進行結合。使用這種R10.23結合的柱，用0.8nm濾器除去雜質的200mL人血清以流速1mL/分鐘通過該柱，隨后回收洗脫物級分。證實這種洗脫物級分中的人自分泌運動因子在實施例6中所述的ELISA測定法中不顯示反應性。這種產物隨后用作制備標準品的基本血清并且還用作零濃度標準品。通過使用昆蟲細胞-桿狀病毒系統中表達的全長人自分泌運動因子作為原材料，實施純化抗原的制備。使lL培養上清液以流速1mL/分鐘通過R10.23結合的柱子，隨后以PBS洗掉未結合的蛋白質。證實通過該柱的PBS在280nm處的吸光度是0.01或更小后，使用具有pH3.5的lOOmM甘氨酸緩沖液洗脫結合的蛋白質。通過添加1/10體積的1MTris(pH8.0)中和該洗脫液后，用TBS迅速透析該洗脫液。圖6顯示全長人自分泌運動因子純化產物的SDS-PAGE圖像和使用抗自分泌運動因子肽抗體進行蛋白質印跡的結果。在該圖中，泳道M表示分子量標記。泳道1顯示在還原條件下對純化抗原以lug/泳道實施SDS-PAGE，隨后用CBB染色的結果。泳道2-5顯示蛋白質印跡法的結果。也就是說，在還原條件下對純化抗原以0.25照/泳道實施SDS-PAGE后，將蛋白質轉移至PVDF膜，在封閉處理后，泳道2為大鼠抗自分泌運動因子肽的單克隆抗體(識別氨基酸序列第49-59位(SEQIDNO:2))，泳道4為兔抗自分泌運動因子肽的多克隆抗體(識別氨基酸序列第671-686位(SEQIDNO:2))并且泳道3和泳道5被檢測為背景，以檢測不含抗人自分泌運動因子的非特異性結合。作為CBB染色法的結果，證實兩條帶是純化的抗原，并且以與實施例2相同的方式在使用抗肽抗體的蛋白質印跡法中檢測到分子量105kDa附近的兩條或兩條以上的條帶。因此，獲得這樣的結果，其說明糖鏈差異或在培養或純化步驟中存在分解。用BCA蛋白定量試劑盒(PierceBiotechnology,Inc.，目錄號23225)測定純化的全長人自分泌運動因子的濃度，并且使用這種濃度作為人自分泌運動因子濃度。隨后添加這種純化的人自分泌運動因子抗原至上述不含人自分泌運動因子的人血清以制備濃度已知的標準品。實施例10:選擇用于夾心ELISA測定體系的抗體組合使用純化的抗原和生物素標記的抗體評價能夠建立夾心ELISA測定體系的抗體組合。以50jiL/孔添加含有2ng/mL純化抗體的TBS溶液至96孔免疫板(Nunc)以使純化的抗體與該板在4。C結合過夜。用TBS洗滌3次后，根據實施例9純化的重組全長人自分泌運動因子用ELISA測定緩沖液(含有3%BSA，10mMMgCl2和0.1%吐溫20的TBS)稀釋至100ng/mL純化的人自分泌運動因子并且以50jiL/孔添加。在使其在室溫放置2小時后，將板用TBST洗滌四次，隨后以50nL/孔添加含有0.8ng/mL生物素標記抗體的ELISA測定緩沖液。在使其在室溫放置2小時后，將板用TBST洗滌四次，隨后以50nL/孔添加稀釋1000倍的含有HRP標記的鏈霉抗生物素蛋白(Zymed)的ELISA測定緩沖液。使其在室溫放置1小時后，將板用TBST洗滌6次，隨后以50jiL/孔添加TMB底物。4吏其在室溫放置10分鐘，用1N磷酸終止反應，隨后測定在OD450處的吸光度。在圖7中顯示了代表性結果。在抗體R10.21和R10.23的情況下，在本圖的上半部分顯示這樣的結果，即，將每種抗體包被在免疫板上作為1次抗體，隨后使其與人自分泌運動因子反應并且隨后使用其它的抗體群通過雙抗體夾心ELISA檢測反應性(當包被R10.21時，在該上半部分的左邊顯示結果，并且當包被R10.23時，在該上半部分的右邊顯示結果)。此外，在本圖的下半部分顯示將獲得的抗體群類似地包被在免疫板上作為1次抗體，隨后使用R10.21和R10.23作為2次抗體而檢測反應性的結果(當使用R10.21作為檢測用2次抗體時，在下半部分的左邊顯示結果，并且當使用R10.23作為檢測用2次抗體時，在下半部分的右邊顯示結果)。在本圖中，橫軸表示所用的抗體(上半部分2次抗體；下半部分1次抗體)，同時縱軸表示通過OD450nm處的吸光度而確定的反應性。作為比較該圖上半部分和下半部分的結果，證實存在這樣的情況，其中根據使用1次抗體和2次抗體的方式，反應性展現或未展現，即便對于相同的抗體組合也是如此。圖8顯示在使用所獲得的抗人自分泌運動因子單克隆抗體進行夾心ELISA中的反應性總覽。根據這些結果，那些不顯示反應性的抗體組合表示不能用來構建夾心ELISA體系的組合，而那些顯示反應性的組合表示這些組合可以用來構建這種體系。在水平方向上標出的是與免疫板結合的l次抗體的名稱，而在垂直方向上標出的是2次抗體的名稱。此外，表中的數值表示在450nm處的吸光度，而符號"-"表示0，5或更低的吸光度。在評價的總計529個組合中，存在16個顯示0.5或更高反應性的組合，占總數約3%。此外，使用三種單克隆抗體R10.16、R10.48或R10.49的組合不能構建夾心ELISA體系，其中所述的三種單克隆抗體在與實施例6相關的圖2中所示的將人自分泌運動因子直接結合免疫板的ELISA中顯示反應性。也就是獲得的抗體不能構建夾心ELISA體系或極難構建這種體系，因而表示根據本發明技術的抗體篩選方法是極有效的技術。實施例11:通過兩步驟夾心ELISA測定法定量人自分泌運動因子使用在實施例9中顯示反應性的抗人自分泌運動因子抗體組合構建用于通過兩步驟雙抗體夾心ELISA法測定血清中人自分泌運動因子的體系。使用R10.23作為固相抗體和R10.21作為2次抗體驗證該測定體系。R10.23固相抗體在此抗體通過胃蛋白酶消化轉化成F(ab)2后使用。使用與實施例9相同的方法，將2pg/mL濃度的R10.23以50^L/孔添加至96孔免疫板(Nunc)，隨后使該抗體與此板在4。C結合過夜。用TBS洗滌3次后，以250pL/孔添加含有3%BSA的TBS，隨后封閉處理2小時。用TBS洗滌3次后，用ELISA測定緩沖液分別l:5稀釋在實施例10中制備的標準品和自分泌運動因子濃度未知的人血清并且以50jiL/孔添加至該板。在室溫使其反應2小時后，該板用TBST洗滌四次，隨后以50jiL/孔添加含有0.8jig/mL生物素標記的R10.21的ELISA測定緩沖液。在使其在室溫放置2小時，將板用TBST洗滌四次，隨后以50jiL/孔添加含有1000倍稀釋的HRP標記的鏈霉抗生物素蛋白(Zymed)的ELISA測定緩沖液。使其在室溫放置1小時后，將板用TBST洗滌6次，隨后以50^L/孔添加TMB底物。在使其在室溫》文置30分鐘后，用1N磷酸終止反應，隨后測定在450nm處的吸光度。圖9顯示了使用具有已知濃度的人自分泌運動因子標準品的6個濃度(0、0.34、0.675、1.35、2.70和5.40fig/mL)所制備的校準曲線。通過三階回歸法進行校準曲線的回歸。證實在450nm處的吸光度根據人自分泌運動因子濃度而增加。根據使用這種校準曲線從具有未知自分泌運動因子濃度的人血清中獲得的在OD450nm處的吸光度，計算樣品中人自分泌運動因子的濃度。此外，根據實施例7確定用于測定的人血清中的溶血磷脂酶D活性，并且驗證其與人自分泌運動因子濃度的相關性。圖10顯示42份人血清樣品的結果。橫軸表示溶血磷脂酶D活性，而縱軸表示人自分泌運動因子濃度。證實了人自分泌運動因子血清濃度和溶血磷脂酶D酶活性的良好相關性，相關系數r-0.8934，因而表明血清中的自分泌運動因子濃度可以通過前述夾心ELISA法定量。實施例12:通過一步驟夾心ELISA測定法定量人自分泌運動因子使用在實施例10中顯示反應性的抗人自分泌運動因子抗體組合構建用于通過一步驟雙抗體夾心ELISA法測定血清中人自分泌運動因子的體系。使用R10.23作為固相抗體和R10.21作為2次抗體驗證該測定體系。R10.23固相抗體在此抗體轉化成F(ab)2后使用。作為2次抗體的R10.21使用堿性磷酸酶和磺基-SMCC進行酶標記。使用與實施例9相同的方法，將2ng/mLR10.23添加至96孔免疫板(Nunc)，隨后使該抗體與此板在4°C結合過夜。用TBS洗滌3次后，以250pL/孔添加含有3%BSA的TBS，隨后封閉處理2小時。以50jiL/孔添加含有0.57ng/mL堿性磷酸酶標記的R10.21的ELISA測定緩沖液并將其迅速冷凍至-40。C。通過使之在減壓下放置過夜而獲得凍干產物以制備一步驟夾心ELISA測定試劑。通過添加以0.125%吐溫20水溶液1/5倍稀釋的在實施例10中制備的標準品和具有未知自分泌運動因子濃度的人血清并以50jiL/孔添加而實施測定。在室溫使其反應后2小時后，將板用TBST洗涂四次，隨后以50pL/孔添加TMB底物。在使其在室溫放置30分鐘后，反應用1N磷酸終止，隨后測定在450nm處的吸光度。圖11顯示了使用具有已知濃度的人自分泌運動因子標準品的6個濃度(0、0.34、0.675、1.35、2.70和5.40fig/mL)所制備的校準曲線。通過三階回歸法進行4交準曲線的回歸。證實在450nm處的吸光度根據人自分泌運動因子濃度而增加。根據使用這種校準曲線從具有未知自分泌運動因子濃度的人血清中獲得的在OD450nm處的吸光度，計算樣品中人自分泌運動因子的濃度。此外，根據實施例7確定用于測定的人血清中的溶血磷脂酶D活性，并且驗證其與人自分泌運動因子濃度的相關性。圖12顯示橫軸表示的溶血磷脂酶D活性、縱軸表示的人自分泌運動因子濃度。血清中的人自分泌運動因子濃度和溶血磷脂酶D酶活性證實有良好的相關性，相關系數r-0.9185，因而表明血清中的自分泌運動因子濃度可以通過前述夾心ELISA法定量。實施例13:通過一步驟夾心ELSIA測定法定量和診斷癌癥患者樣品中的人自分泌運動因子定量來自正常健康受試者和癌癥患者的血清樣品中的人自分泌運動因子濃度，隨后驗證與正常健康受試者相比的顯著性差異。對于癌癥患者血清，使用其中前列腺癌標志物PSA(前列腺特異性抗原)、消化器癌標志物CA19-9、乳腺癌標志物CA153和卵巢癌標志物CA125的測定值超過截止水平(cut-off)的樣品，并且根據實施例12實施一步驟夾心ELISA。使用全自動酶免疫測試裝置AIA-600II(TosohCorp.)，采用已經獲得制造商批準用作體外診斷劑的相應的標志物測定試劑測定每種癌標志物的水平，對癌癥患者血清的陽性判斷確定為PSA大于10ng/mL，CA19-9大于38ng/mL，CA153大于23ng/mL，CA125大于32ng/mL。結果示于圖13和表2。證實在每種癌樣品組中的血清自分泌運動因子濃度是比正常健康受試者的血清自分泌運動因子濃度顯著更高的值(pO.OOl)。基于這些結果，表明對血清中自分泌運動因子濃度的定量有效用于診斷癌癥。表2使用PSA、CA19-9、CA153和CA125測定值超過截止值的樣品，利用一步驟雙抗體夾心ELISA法驗證相對于正常健康受試者的自分泌運動因子濃度的結果。對每個樣品組在下表中顯示測定數目、平均測定值和標準偏差。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例14:通過一步驟夾心ELSIA測定法對慢性肝病患者樣品中人自分泌運動因子的定量和診斷定量來自正常健康受試者的146份樣品和來自慢性肝病(CLD)患者的29份血清樣品中的人自分泌運動因子濃度，隨后驗證與正常健康受試者相比的顯著性差異。根據實施例12實施一步驟夾心ELISA。結果示于圖14。正常健康受試者(149份樣品)和慢性肝病組(27份樣品)的平均測定值士標準偏差分別是0.756±0.045和0.1866±1.244ng/mL，并且觀察到顯著差異(pO.OOOl)。使用來自慢性肝病患者的17份樣品，在表3中顯示自分泌運動因子濃度與將已知肝病標志物的透明質酸、血清白蛋白、總膽紅素濃度、血小板計數及凝血酶原時間作為測定值之間的關系。證實人自分泌運動因子濃度與所述已知標志物具有相關性。根據這些結果，表明對血清中自分泌運動因子濃度的定量有效用于診斷或輔助診斷慢性肝病，同時反映該疾病的程度。表3測定17位慢性肝病患者中透明質酸濃度、血清白蛋白濃度、總膽紅素濃度、血小板計數、和凝血酶原時間的結果，以及與每種樣品的人自分泌運動因子濃度的比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>實施例15:對人精漿的測定在正常健康受試者中實施自分泌運動因子的定量和溶血磷脂酶D活性的測定。<吏用全自動酶免疫測定裝置AIA-600II(批準文號13B3X90002000003)實施自分泌運動因子的定量。一步驟雙抗體夾心測定試劑與實施例12同樣地使用1.2jig轉化成F(ab)2后用作固相抗體的R10.23、0.57ng用作2次抗體的堿性磷酸酶標記的R10.21，將含有5%明膠和10mMMgCl2的50pLELISA測定緩沖液添加至測定杯中，隨后凍干過夜。使用這些測定試劑，以自動化裝置實施測定。測定條件包括分配20jiL樣品和130jiL的0.1%TritonX-100溶液至測定杯中并在37。C使其反應IO分鐘。在使其反應并用琥珀酸緩沖液洗滌后，添加4-甲基傘形酮酰磷酸鹽(4-methylumbelliferylphosphate),隨后通過堿性磷酸酶分解并且測定每單位時間形成的4-甲基傘形酮的濃度以實施對自分泌運動因子的定量。使用具有已知濃度的人自分泌運動因子標準品的6個濃度(O、0.34、0.675、1.35、2.70和5.40ng/mL)所制備的校準曲線時，正常健康受試者的自分泌運動因子濃度是(U64ng/mL。另一方面，作為實施例7測定精漿中溶血磷脂酶D活性的結果，如圖15的左側圖中所示，未觀察到在底物溶血磷酯酰膽堿存在或不存在下所形成的膽堿量之間存在大的差異，并且甚至在稀釋10倍的精漿中顯示極高的值。因為在底物不存在下顯示高值，故推定測定了內在的膽堿。因為正常健康受試者精漿中的膽堿濃度基于這些測定值是極高的，約40mM,并且因為底物濃度在根據實施例7的溶血磷脂酶D活性測定時是2mM，故為了排除所述膽堿濃度，需要稀釋此精漿樣品約1000倍來實施測定。因為自分泌運動因子由于這種稀釋方法的實施而同時被稀釋，預計需要長時間來測定酶活性。為了證實精漿中溶血磷脂酶D活性的高水平是內在的膽堿所致，通過用TBS充分透析精漿樣品8小時而除去低分子量物質后，溶血磷脂酶D活性在圖15的中間圖中顯示。作為透析的結果，作為顯示為高值的溶血磷脂酶D活性的膽堿生成量下降至先前水平的約1/100。此外，作為透析后測定精漿中溶血磷脂酶D活性的結果，如在圖15的右圖中顯示，能夠相對于底物不存在下而證實在底物存在下的酶活性。在底物不存在下，酶活性值等于通過終止并控制反應溫度在4°C的酶反應所獲得的測定值。根據這些結果，因為極高濃度的膽堿存在于精漿中，故難以利用膽堿的形成作為溶血磷脂酶D活性的指標并且這些結果證實僅通過使用本發明的免疫測定法才可能進行這種測定。實施例16:自分泌運動因子測定試劑的制備將抗人自分泌運動因子單克隆抗體(R10.23)在37。C物理地過夜吸附于非水溶性支持物(內部摻入有鐵氧體的粒徑約1.5mm的乙烯-乙烯醇支持物)至抗體濃度100ng/支持物，隨后在40。C用含有1%BSA的lOOmMTris緩沖液(pH8.0)封閉4小時，以獲得固定有抗體的支持物。如此制備標記抗體，即通過胃蛋白酶處理而將抗人自分泌運動因子單克隆抗體(R10.21)轉化成F(ab)2，隨后使用SPDP(N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶二硫基)丙酸S旨)結合堿性磷酸酶以獲得酶標記的抗體。將12個固定有抗體的支持物置于可透磁的容器內(容量1.2mL)，隨后添加含有ljig/mL標記抗體的50pL緩沖液(含有3%BSA的Tris緩沖液，pH8.0)至該容器并且凍千以獲得自分泌運動因子測定試劑。此自分泌運動因子測定試劑在該容器充氮氣后被密封并貯存在4。C直至測定。實施例17:人自分泌運動因子標準品的制備使用抗人自分泌運動因子單克隆抗體(R10.23)制備固定有抗體的支持濃度血清。使用這些材料制備在人自分泌運動因子免疫測定中使用的標準品(人自分泌運動因子濃度已知的樣品)。具體地，將25mg單克隆抗體R10.23與HiTrap國NHS畫活化5mL柱(GEHealthcareBioscienceInc.,目錄號17-0717-01)根據該柱附帶的說明書進行結合。使用這種R10.23結合的柱，以0.8nm濾器除去雜質的200mL人血清以流速1mL/分鐘通過該柱，隨后回收洗脫物級分。證實在這種洗脫物級分中的人自分泌運動因子與實施例16中所述的測定試劑不顯示反應性。這種產物隨后用作制備標準品的基本血清并且還用作零濃度標準品。通過使用昆蟲細胞-桿狀病毒系統中表達的全長人自分泌運動因子作為原材料，實施純化抗原的制備。使1L培養上清液以流速lmL/分鐘通過R10.23-結合的柱子，隨后以PBS洗掉未結合的蛋白質。在證實通過該柱的PBS在280nm處的吸光度是0.01或更小后，使用具有pH3.5的lOOmM甘氨酸緩沖液洗脫結合的蛋白質。在通過添加1/10體積1MTris(pH8.0)中和該洗脫物后，用TBS迅速透析該洗脫物。用BCA蛋白定量試劑盒(PierceBiotechnology,Inc.，目錄號23225)測定純化的全長人自分泌運動因子的濃度，并且使用這種濃度作為人自分泌運動因子濃度。隨后添加這種純化的人自分泌運動因子抗原至不含前述人自分泌運動因子的人血清以制備濃度已知的標準，.品<實施例18:對自分泌運動因子測定試劑的評估使用實施例16中制備的自分泌運動因子測定試劑和實施例17中制備的標準品評價試劑性能。作為評價用裝置，使用全自動酶免疫測定裝置AIA-1800(東曹林式會社制，制造出售編號13B3X90002000002)以評價該設備。使用具有O、0.313、0.625、1.25、2.5和5.0jig/mL濃度的標準品的6個濃度。全自動酶免疫測定裝置AIA-1800的測定原理包括自動分配20fiL標準品或人血清樣品和含有表面活性劑的130jiL稀釋劑至實施例16中制備的自分泌運動因子測定試劑的容器內。在37°C恒溫進行抗原抗體反應10分鐘并且用含有表面活性劑的緩沖液洗滌8次后，添加4-曱基傘形酮酰磷酸鹽旨在獲得每單位時間形成的4-曱基傘形酮濃度的測定值(nmol/L.秒)。當測定所述標準品時，在表4中顯示測定值，而在圖16中顯示使用這些測定值的校準曲線。此外，從校準曲線和零濃度標準品的(平均值+2x標準偏差)計算出的最小可檢測濃度是110ng/mL。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>實施例19:自分泌運動因子測定試劑的再現性試驗為了驗證用自分泌運動因子測定試劑所獲得結果的再現性，使用實施例18中制備的校準曲線，以3個對照樣品實施再現性試驗。通過反復測定所述樣品10次，隨后計算變異系數(％(:￥=標準偏差/平均值xlOO)評估同時再現性。結果示于表5。此外，所述樣品還隔數日進行測定，隨后計算自第0日所獲得的測定值的變動以及全部測定值的變異系數。這些結果示于表6。表5同時再現性試驗結果Qig/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>因為全部變異系數均是10%以下，故證實用所述自分泌運動因子測定試劑獲得的結果是可靠的。實施例20:對白血病樣品和惡性淋巴瘤樣品的測定使用全自動酶免疫測定裝置AIA-600II,用自分泌運動因子測定試劑測定來自120位正常健康受試者和215位白血病和惡性淋巴瘤患者的血清樣品。結果示于表7。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>NHS:正常健康受試者AL:急性白血病CL:'l"曼性白血病HD:霍奇金淋巴瘤NHL:非霍奇金淋巴瘤其它其它白血病和惡性淋巴瘤74例正常健康男性的測定值產生平均值0.656ng/mL，標準偏差0.121ng/mL，最小值0.401jig/mL，最大值1.088jig/mL。此外，46例正常健康女性的測定值產生平均值0.852ng/mL，標準偏差0.184ng/mL，最小值0.621ng/mL，最大值1.590照/mL。對215位白血病患者和惡性淋巴瘤患者實施測定。對象樣品包括正常健康受試者、急性白血病(急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病)、慢性白血病(慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、幼淋巴細胞性白血病)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(彌漫性大B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、淋巴母細胞性淋巴瘤)和其它白血病和惡性淋巴瘤(慢性活動性EBV感染、骨髓增生異常綜合征、多發性骨髓瘤)，分別的樣品數示于表7。測定結果如圖17和圖18中所示，并且對于非霍奇金淋巴瘤，證實男性和女性均是高值，顯著性差異PO.Ol。實施例21:對非霍奇金淋巴瘤的詳細評價在更詳細地分類后，評價在實施例20中測定的非霍奇金淋巴瘤。結果示于表8及圖19和圖20中。對于濾泡性淋巴瘤，證實男性和女性均是高值，顯著性差異分另U是p0.05和p<0.01。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>NHS:正常健康受試者Burkitt:伯基特'淋巴瘤LBL:淋巴母細胞性淋巴瘤MCL:套細胞淋巴瘤DLBCL:彌漫性大B細胞'淋巴瘤FL:濾泡性、淋巴瘤實施例22:自分泌運動因子濃度和溶血磷脂酸濃度的相關性試驗已經明白了自分泌運動因子通過產生生理活性脂類的溶血磷脂酸(LPA)而參與癌浸潤和轉移。因此，測定血清中的自分泌運動因子濃度來評估它們與LPA濃度的相關性。根據Clin.Chim.Acta.,333，59-67，2003測定LPA。具體地，制備含有以下組分的100mMHEPES緩沖液(pH7.6)用作測定試劑。(測定試劑的組分)20kU/L溶血磷脂酶(EC3.1.1.5)1.3kU/L過氧化物酶100kU/L甘油-3-磷酸氧化酶(G3PO:EC1.1.3.21)10kU/L甘油-3-磷酸脫氫酶(G3PDH:EC1.1.1.8)10kU/La-羥基類固醇脫氫酶(HSD:EC1.1.1.50)lOjiM煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)1mM膽酸0.5mMTOOS1mM4-氨基安替比林0.01%TritonX-100如此實施測定，即通過將9jiL血清和具有已知LPA濃度的標準品與240nL前述測定試劑混合，隨后在37。C孵育并且在7分鐘和9分鐘后測定在570nm處的吸光度。計算測定值從7分鐘至9分鐘的增加量(速率值=吸光度/分鐘)，并且使用校準曲線計算血清樣品中的LPA濃度，其中所述的校準曲線通過測定所述標準品所獲得的值制備。作為驗證所測定樣品中的自分泌運動因子抗原濃度與LPA濃度之間相關性的結果，觀察到具有相關系數r-0.621的良好相關性，如圖21中所示。(此外，一般來講，相關系數r=0.5或更高則能夠判定指示極高相關性)。LPA濃度的現有測定因LPA本身的不穩定性以及因樣品收集后在血清中自發形成，所以在臨床上的測定是困難的，但是根據本發明對分泌運動因子的測定是容易的，并且獲得與LPA濃度的良好相關。工業可利用性本發明涉及針對人樣品中所含天然形式人自分泌運動因子的抗體、使用這種抗體的人自分泌運動因子定量方法和定量試劑。使用它們有可能診斷癌癥和肝病。此外，通過免疫學定量方法測定人樣品中所含人自分泌運動因子的濃度，本發明可以檢測或輔助檢測至今尚無明確的血清診斷標志物的惡性淋巴瘤、尤其是日本人占多數的非霍奇金淋巴瘤、進一步地濾泡性'淋巴瘤。權利要求1.特異性識別未受到變性的、在生物體內的存在狀態中的天然形式人自分泌運動因子的抗體的篩選方法，該方法包括以下步驟將能夠捕獲該抗體的候選抗體的結合因子結合在固相上；將該抗體的候選抗體與所述結合因子結合；使天然形式人自分泌運動因子在已經使所述候選抗體作用的體系中作用；和以天然形式人自分泌運動因子對所述抗體的結合力作為指標，選擇特異性識別該天然形式人自分泌運動因子的抗體。2.根據權利要求l所述的方法，其中所述結合因子是抗體。3.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述天然形式人自分泌運動因子是具有多聚組氨酸標簽的重組人自分泌運動因子抗原。4.根據權利要求3所述的方法，其中所述天然形式人自分泌運動因子對所述抗體的結合力通過利用特異性結合具有多聚組氨酸標簽的所述重組人自分泌運動因子抗原的經標記的抗多聚組氨酸抗體而測定。5.根據權利要求4所述的方法，其中所述經標記的抗多聚組氨酸抗體是酶標記的抗多聚組氨酸抗體。6.特異性識別未受到變性的、在生物體內的存在狀態中的天然形式人自分泌運動因子的抗體，所述抗體能夠通過包括以下步驟的方法取得將能夠捕獲該抗體的候選抗體的結合因子結合在固相上；將該抗體的候選抗體與所述結合因子結合；使天然形式人自分泌運動因子在已經使所述候選抗體作用的體系中作用；和以天然形式人自分泌運動因子對所述抗體的結合力作為指標，選擇特異性識別該天然形式人自分泌運動因子的抗體。7.根據權利要求6所述的抗體，其中所述結合因子是抗體。8.根據權利要求6或7所述的抗體，其中所述天然形式人自分泌運動因子是具有多聚組氨酸標簽的重組人自分泌運動因子抗原。9.根據權利要求8所述的抗體，其中所述天然形式人自分泌運動因子對所述抗體的結合力通過利用特異性結合具有多聚組氨酸標簽的所述重組人自分泌運動因子抗原的經標記的抗多聚組氨酸抗體而測定。10.根據權利要求9所述的抗體，其中所述經標記的抗多聚組氨酸抗體是酶標記的抗多聚組氨酸抗體。11.用于惡性淋巴瘤的檢查方法，包括測定人樣品中自分泌運動因子的濃度并且在所述測定值顯示比由源自正常健康受試者的測定值組成的正常值顯著更高值的情況下判定是惡性淋巴瘤。12.權利要求ll所述的檢查方法，其中所述的惡性淋巴瘤是濾泡性淋巴瘤。13.權利要求11或12所述的檢查方法，其中根據權利要求11的自分泌運動因子是全長自分泌運動因子、部分切割的自分泌運動因子或部分基因突變的自分泌運動因子。14.根據權利要求11-13任一項中所述的檢查方法，其中根據權利要求ll的樣品是全血、血細胞、血清、血漿等的人血液成分、或人細胞或組織的提取液。15.根據權利要求11-14任一項中所述的檢查方法，其中根據權利要求11的用于測定自分泌運動因子濃度的方法是^f吏用抗體的免疫化學測定法。16.根據權利要求11-15任一項中所述的檢查方法，其中根據權利要求15的抗體是單克隆抗體。17.根據權利要求11-16任一項中所述的檢查方法，其中自分泌運動因子在所述樣品中的濃度通過使權利要求15的抗體與該樣品接觸并且檢測與該樣品結合或不結合的抗體而測定。18.根據權利要求11-16任一項中所述的檢查方法，其中自分泌運動因子在所述樣品中的濃度通過使權利要求14的抗體與該樣品接觸并且檢測與該抗體結合或不結合的自分泌運動因子而測定。19.根據權利要求11-18任一項中所述的檢查方法，其中根據權利要求15-18任一項所述的方法是利用酶標記物、同位素標記物、熒光標記物等的竟爭性方法、利用夾心法或熒光偏振法等的均相測定方法或利用表面等離子體共振分析法的結合作用測定方法。20.惡性淋巴瘤檢測試劑，使用根據權利要求11-19任一項中所述的方法作為其原理。21.檢測方法，包括使用根據權利要求11-14任一項中所述的方法測定自分泌運動因子所具有的溶血磷脂酶D活性、并且在所述測定值顯示比由正常健康受試者的測定值組成的正常值顯著更高值的情況下判定是惡性'淋巴瘤。22.用于檢查惡性淋巴瘤的試劑，其特征在于以根據權利要求21的檢測方法作為原理。全文摘要本發明提供了特異性識別未受到變性的、在生物體內的存在狀態中的天然形式人自分泌運動因子的抗體的篩選方法，該方法包括以下步驟將能夠捕獲該抗體的候選抗體的結合因子結合在固相上；將該抗體的候選抗體與所述結合因子結合；使天然形式人自分泌運動因子在已經使所述候選抗體作用的體系中作用；和以天然形式人自分泌運動因子對所述抗體的結合力作為指標，選擇特異性識別該天然形式人自分泌運動因子的抗體。本發明還提供了惡性淋巴瘤的檢測方法，其包括測定人樣品中自分泌運動因子的濃度并且在所述測定值顯示比由源自正常健康受試者的測定值組成的正常值顯著更高值的情況下判定是惡性淋巴瘤。文檔編號G01N33/53GK101523213SQ200780036898公開日2009年9月2日申請日期2007年8月2日優先權日2006年8月3日發明者中村和宏,五十嵐浩二,井手和史,新井洋由,池田均,矢冨裕,青木淳賢申請人:國立大學法人東京大學;東曹株式會社