專利名稱：：黑素瘤抑制性活性蛋白(mia)作為在黑素瘤治療性反應中的早期指示物的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)在罹患黑素瘤的哺乳動物受試者中作為響應黑素瘤腫瘤細胞抑制劑治療的早期指示物的應用。
背景技術(shù)：
：黑素瘤在美國男性和女性中的總發(fā)病率在增加(參見例如，EdwardsB.K.等人，《/Omcer/wW,97:1407-1427(2005))。自從1981年，每年的增長率約為3%。根據(jù)美國癌癥協(xié)會的估算，2005年美國約有59，580起黑素瘤的新病例，并且約7,700人死于此疾病(AmericanCancerSocietyCancerFactsandFigures2005，j附w.Omce"0c.2005:1-62)。FDA批準用于轉(zhuǎn)移性黑素瘤的治療包括達卡巴嗪、干擾素-oc和白細胞介素-2。然而，在美國，具有彌散性疾病的患者的預后仍舊很差，5年存活率為16%或更低。由于當前治療的有限效力，對于新型療法的需要尤其急切。目前正在開發(fā)諸如抗血管發(fā)生劑、Raf激酶抑制劑和疫苗的新型治療并且它們可向患有這一疾病的患者提供改善的存活(MandaraM.等人，￡bc/7CZfev.顛/畫cwrto.6:121-130(2006))?？紤]到黑素瘤的高發(fā)病率及當前治療的有限效力，需要黑素瘤生物標記及用于黑素瘤生物標記的檢測法，該生物標記可用作在哺乳動物受試者中治療性反應的精確的早期指示物來測量候選黑素瘤抑制劑的效率。發(fā)明概述根據(jù)前述，一方面，提供一種確定具有黑素瘤腫瘤細胞的哺乳動物受試者對黑素瘤抑制劑治療的反應的方法。該方法包括(a)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始前，取自哺乳動物受試者的第一生物樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始后，自該哺乳動物受試者所取的第二生物樣品中MIA的第二濃度；(c)比較MIA的第一和第二濃度，其中在第二生物樣品中測量的MIA的第二濃度相比于在第一生物樣品中測量的MIA的第一濃度的降低指示對黑素瘤抑制劑治療的正反應。另一方面，本發(fā)明提供一種評估黑素瘤抑制劑在治療具有黑素瘤的哺乳動物受試者中的黑素瘤的效力的方法。該方法包括(a)確定用黑素瘤抑制劑治療開始前，取自哺乳動物受試者的第一生物樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始后，自該哺乳動物受試者所取的第二生物樣品中MIA的第二濃度；和(c)比較MIA的第一和第二濃度，其中在第二生物樣品中測量的MIA的第二濃度相比于在第一生物樣品中測量的MIA的第一濃度的降低指示抑制劑對治療黑素瘤有效力。另一方面，本發(fā)明提供一種確定患者是否應該繼續(xù)接受黑素瘤抑制劑治療的方法。該方法包括(a)確定用黑素瘤抑制劑治療開始前，取自哺乳動物受試者的第一生物樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始后，自該哺乳動物受試者所取的第二生物樣品中MIA的第二濃度；(c)比較MIA的所述第一和第二濃度；和(d)如果MIA的第二濃度相比于MIA的第一濃度降低至少20%，則確定應該繼續(xù)用黑素瘤抑制劑治療該患者。又一方面，本發(fā)明提供一種鑒定對黑素瘤治療具有效力的藥劑的方法。該方法包括(a)確定向黑素瘤哺乳動物細胞系施用藥劑前，取自培養(yǎng)的黑素瘤哺乳動物細胞系的第一樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定向黑素瘤哺乳動物細胞系施用藥劑后，取自該黑素瘤哺乳動物細胞系的第二樣品中MIA的第二濃度；(c)比較MIA的第一和第二濃度；和(d)如果MIA的第二濃度相比于MIA的第一濃度降低至少20%，則確定該藥劑對黑素瘤治療具有效力。附圖簡述結(jié)合附圖，通過參考下面的詳細說明，本發(fā)明的前述方面和許多隨附優(yōu)點將更容易被理解。圖1A提供分離自多種哺乳動物和非哺乳動物物種的MIA蛋白的M酸序列比對；圖1B提供分離自靈長類動物的MIA蛋白的氨基,列比對；圖2圖示說明MIAEL1SA檢測法的結(jié)果，其證明MIA由黑素瘤細胞系而非結(jié)腸癌細胞系分泌到培養(yǎng)基中，如實施例1所述；圖3圖示說明MIAELISA檢測法在未處理的非荷腫瘤小鼠(n=4)和植入了A375M人黑素瘤細胞、腫瘤體積接近250mm3的無胸腺棵鼠(n=10)中檢測的結(jié)果，如實施例2所述；圖4A圖示說明A375M人黑素瘤異種移植小鼠模型中，MIA血漿濃度響應于由口服給藥CHIR-265所誘導的腫瘤生長抑制而降低，如實施例2所述；圖4B圖示說明MEXF276人黑素瘤異種移植小鼠模型中，MIA血漿濃度響應于由口服給藥CHIR-265和索拉非尼所誘導的腫瘤生長抑制而降低，如實施例2所述；圖4C圖示說明MEXF1341人黑素瘤異種移植小鼠才莫型中，MIA血漿濃度響應于由口服給藥CHIR-265和索拉非尼所誘導的腫瘤生長抑制而降低，如實施例2所述；圖5A圖示說明A375M人黑素瘤異種移植小鼠模型中，MIA血漿濃度響應于CHIR-258和CHIR-265治療的早期變化，如實施例3所述；圖5B示出在給藥(第0天)前和用CHIR-258或CHIR-265治療后第3、8和13天，荷A375M人黑素瘤腫瘤的小鼠與用載體對照處理的小鼠比較的腫瘤體積，如實施例3所述；圖6A示出在給藥(第0天)前和用CHIR-258(30mg/kg和80mg/kg)治療后第8和22天，荷CHL-1人黑素瘤腫瘤的小鼠與栽體對照處理的小鼠比較的腫瘤體積，如實施例4所述；和圖6B圖示說明CHL-1人黑素瘤異種移植小鼠模型中，MIA血漿濃度響應于CHIR-258(30mg/kg和80mg/kg)治療的早期變化，如實施例4所述。優(yōu)選實施方式的詳細i兌明除非本文特別限定，否則本文所用的所有術(shù)語具有與對本發(fā)明的^L術(shù)領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員而言所理解的含義相同的含義。提供下面的定義以便提供如說明書和權(quán)利要求中使用的術(shù)語的清楚定義，以描述本發(fā)明。如本文所使用，術(shù)語"在哺乳動物受試者中對治療的正反應，，指在用黑素瘤抑制劑治療后腫瘤體積的減小和/或腫瘤生長的抑制。一方面，提供確定具有黑素瘤腫瘤細胞的哺乳動物受試者對黑素瘤抑制劑治療的反應的方法。該方法包括(a)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始前，取自哺乳動物受試者的第一生物樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始后，自該哺乳動物受試者所取的第二生物樣品中MIA的第二濃度；和(c)比較MIA的第一和第二濃度，其中在第二生物樣品中測量的MIA的第二濃度相比于在第一生物樣品中測量的MIA的第一濃度的降低指示對黑素瘤抑制劑治療有正反應。如本文所使用，術(shù)語"黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)"指在GenBank數(shù)據(jù)庫中，以登錄號NP—006524為^^眾可知的12-kDa可溶蛋白質(zhì)(其由GenBank登錄號NM—006533所列的cDNA編碼)，以及哺乳動物同源物或其包括MIA蛋白至少IO個連續(xù)殘基的片段。已經(jīng)顯示MIA通過結(jié)合纖粘連蛋白和層粘連蛋白分子參與黑素瘤細胞自胞外基質(zhì)的分離，從而防止細胞-基質(zhì)相互作用(BrockezL.等人，/Z)w附flto/."3:256-268(2000))。MIA起初分離自人HTZ-19黑素瘤細胞系的上清液(BogdahnU.等人，Oi證尸紐W:5358-5363(1989))。如圖1A所示，人MIA蛋白有131個氣基酸，其中開始的24個氨基酸包括引導M1A分泌到胞外空間的信號序列。成熟的、分泌的人MIA是107個氨基酸。如圖1A進一步所示，已經(jīng)在多種哺乳動物和非哺乳動物物種中鑒定了MIA蛋白同源物，該動物包括例如大鼠(r)、小鼠(m)、黑猩猩(chimp)、獼猴(rh)、狗(d)、牛(bov)、倉鼠(ham)及河豚(pf)。如在2006年7月20日檢索，人MIA^J^餅列以Genbank號NP—006524提供；小鼠MIA蛋白以Genbank號NP—062267提供；大鼠MIA蛋白以Genbank號NP—110479提供；倉鼠MIA蛋白以Genbank號AAF76220提供；牛MIA蛋白以Genbank號NP—776361提供；獼猴MIA蛋白以Genbank號XP001098600提供；狗MIA蛋白以Genbank號XP541610提供；黑猩猩MIA蛋白以Genbank號XP—512675提供以及河豚MIA蛋白以Genbank號AAL26991提供，其每個都通過引用作為參考。一個實施方式中，用于實踐本發(fā)明的MIA蛋白與如圖1A所示，以Genbank號NP—006524提供的人MIA蛋白#^紗列至少70%相同(例如至少80%相同、或至少90%相同、至少95%相同、至少99%相同)，或其包括MIA蛋白至少IO個連續(xù)殘基的片段。術(shù)語"百分數(shù)同一性"或"百分數(shù)相同的"當與MIA蛋白一起使用時，定義為在將候選序列和目的序列比對以獲得最大百分數(shù)同一性后，候選蛋白質(zhì)序列中與目的蛋白質(zhì)序列相同的M酸殘基的百分數(shù)。例如，兩蛋白質(zhì)序列之間的百分數(shù)同一性可以通過在美國國立醫(yī)學圖書館，8600RockvillePike,Bethesda,Md.20894，U.S.A的生物信息國家中心(NCBI)的網(wǎng)站中使用W2s叫界面對兩序列進行配對比較而確定。bl2s叫界面允i午4吏用由TatianaA.等人，"Blast2S叫uences-ANewToolforComparingProteinandNucleotideSequences",Ff7V/5"Af/cn>6/6>//>汰〃(247-250，1999所述的BLAST工具進行序列比對。-使用下面的比對參數(shù)矩陣=BLOSUM62;空位罰分=11;空位延伸罰hl;空位延伸最小值(Gapx—dropff)=50;期望值=10.0;序列長度=3;以及過濾=關(guān)閉(off)。圖1A提供示例性MIA同源物的M紗列比對。下表1中提供了圖1A所示的多種MIA同源物的百分數(shù)同一性。如圖1B和表1所示，靈長類MIAtt^列極其高度保守，人和黑猩猩具有相同的序歹'J。表1:MIA百分數(shù)同一性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>MIA是分泌的蛋白質(zhì)，因此其可以在可獲得的組織中被檢測到，可獲得的組織例如包括血液(包括血漿和血清)、尿液的生物體液和諸如黑素瘤腫瘤活檢樣品的組織樣品。因此，在治療前后所測量的MIA的在或濃度可用于確定哺乳動物受試者對用黑素瘤抑制劑治療的反應，如實施例1-2所述及圖2-4所示。也已經(jīng)證明在用候選黑素瘤抑制劑治療后所測量的MIA濃度相比于治療前MIA濃度的降低用作治療哺乳動物受試者黑素瘤所用藥劑的效力的早期及準確的指示物，如實施例3-4所述及圖4-5B所示。根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法，在用黑素瘤抑制劑治療開始前，從哺乳動物受試者取第一生物樣品以及在用黑素瘤抑制劑治療開始后，從哺乳動物受試者取第二生物樣品至少一次。一些實施方式中，在著手開始用黑素瘤抑制劑治療后，在定期時間間隔期間從受試者(例如，在臨床前試驗的受試者)取多個經(jīng)治療的生物樣品。如本文所使用，術(shù)語"治療"指施用一或多種黑素瘤抑制劑以減輕與黑素瘤相關(guān)的癥狀，或停止那些癥狀的進一步M或惡化，或預防黑素瘤。例如，成功的治療可包括癥狀減輕或疾病停止發(fā)展，如通過肺瘤生長速率降低、肺瘤生長停止、腫瘤尺寸減小、黑素瘤部分或全部減退或存活率增加或臨床獲益而測得。術(shù)語"治療開始，，指開始施用黑素瘤抑制劑的時間點。例如，可在治療開始后每日自受治療的受試者取生物樣品，或在著手開始用黑素瘤抑制劑治療后的至少3天至至少3個月或更長時間內(nèi)以定期方式取生物樣品。一些實施方式中，在治療開始前自受治療的受試者取生物樣品以及在治療開始后3天至3個月(例如1周內(nèi)、2周內(nèi)、l個月內(nèi)、2個月內(nèi)或3個月內(nèi))期間取樣至少一次。本文考慮的黑素瘤抑制劑的治療方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，但非限制地，可每日向有需要的患者施用黑素瘤抑制劑，持續(xù)7、14、21或28天，而后7或14天不施用該化合物。一些實施方式中，治療周期包括每日施用(持續(xù)7天)黑素瘤抑制劑的量，而后7天不施用該化合物。一個治療周期可重復一或多次以提供一個療程。此外，在治療周期的給藥階段可每日給予黑素瘤抑制劑一次、兩次、三次或四次。其它實施方式中，該方法還包括在一個療程中每日或每隔一天一次、兩次、三次或四次施用黑素瘤抑制劑的量。一些實施方式中，治療方案還包括施用黑素瘤抑制劑作為治療周期的一部分。治療周期包括給藥階段和間歇期，在給藥階段定期向受試者給予黑素瘤抑制劑而在間歇期不給予該化合物。例如，治療周期可包括每日施用黑素瘤抑制劑的量，持續(xù)7、14、21或28天，而后7或14天不施用該藥劑。一些實施方式中，治療周期包括每日施用黑素瘤抑制劑的量，持續(xù)7天，而后7天不施用該藥劑。一個治療周期可重復一或多次以提供一個療程。此外，在治療周期的給藥階段可每日施用黑素瘤抑制劑一次、兩次、三次或四次。其它實施方式中，該方法還包括在一個療程中每日或每隔一天一次、兩次、三次或四次施用黑素瘤抑制劑的量。療程指受試者接受本發(fā)明方法對癌癥進行治療的時間段。因此，療程可擴展為一或多個治療周期或療程指受試者接受每日或間歇施用黑素瘤抑制劑的時間段。生物樣品可能是來自哺乳動物受試者的組織樣品或流體樣品，例如血液或尿液樣品，或臨床樣品如黑素瘤活檢樣品。一些實施方式中，生物樣品是血樣。血樣可能是任何適于測量MIA蛋白存在或濃度的血樣類型。例如，全血；血漿(例如由離心機分離的)；或來自血漿的血清(例如通過凝血或血清分離器試管獲得)可用于實踐本發(fā)明的方法。本發(fā)明的方法可在任何具有黑素瘤腫瘤細胞的哺乳動物受試者中實踐，例如人、獼猴、黑猩猩、小鼠、大鼠、狗、牛、兔、豚鼠、倉鼠、山羊、綿羊或馬?？墒褂萌魏文軌驒z測和/或測量MIA蛋白的量的檢測法確定取自哺乳動物受試者的第一生物樣品的MIA蛋白的存在或濃度。例如可使用免疫熒光染色、流式細胞術(shù)、質(zhì)譜、免疫細胞化學、免疫組化、免疫印跡或ELISA確定MIA蛋白的存在或濃度。一個實施方式中，使用與MIA特異性結(jié)合的抗體來測量哺乳動物受試者的生物樣品中MIA蛋白的濃度，例如ELISA檢測法或Western印跡。實施例1描述了檢測血樣中M1A濃度的示例性ELISA檢測法。另一實施方式中，如實施例l所示，4吏用Western印跡分析測量生物樣品中MIA蛋白的濃度。另一實施方式中，使用免疫組化方法測量生物樣品中MIA蛋白的濃度。例如，生物樣品(如石蠟包埋的人黑素瘤細胞團，黑素瘤異種移植物以及分離自患者的黑素瘤及正常皮膚組織)可用于通過免疫組化的方法來評估MIA表達的水平?？?吏用本領(lǐng)域4支術(shù)人員已知的方法進行該免疫組化操作，例如，可使用針對抗原提取的細胞條件1標準方法在VentanaDiscoveryAutostaiiier(VentanaMedicalSystems,Inc.,Tucson,AZ)上實現(xiàn)MIA檢測。將組織切片與l-20照/ml人MIA的抗體和免疫前IgG對照(NovartisAG,Emeryville,CA)不加熱培養(yǎng)30-120min。向該組織切片加入VentataUniversal二抗(VentanaMedicalSystems,Inc.)并培養(yǎng)10-60min，隨后通過VentanaDABMap(VentanaMedicalSystems,Inc)檢觀'J?？墒褂肰entana蘇木精和BluingReagent(VentanaMedicalSystems,Inc.)作為復染劑。切片在梯度乙醇中脫水、二甲苯中洗滌并使用合成的固定介質(zhì)進行蓋玻片覆蓋。根據(jù)本發(fā)明這一方面的方法，在用黑素瘤抑制劑治療開始后，取自受試者的第二生物樣品中測量的MIA第二濃度相比于在治療開始前在取自受試者的第一生物樣品中測量的MIA第一濃度(或相比于預確定的參照水平)降^f氐，則表明該受試者對用該抑制劑治療有正反應。如實施例3和4所示，相比于具有黑素瘤腫瘤細胞且未接受抑制劑治療的哺乳動物受試者，在用黑素瘤抑制劑治療后的哺乳動物受試者的生物樣品中X!l察到MIA濃度統(tǒng)計學上顯著的降低與哺乳動物受試者中黑素瘤胂瘤負荷的相應降低的相關(guān)性。該方法的一些實施方式中，在用黑素瘤抑制劑治療后的早期時間點(例如開始治療后第3至8天)所取生物樣品中MIA濃度的降低是該受治療的哺乳動物受試者中腫瘤負荷降低的早期指示物(例如預示)。一些實施方式中，腫瘤負荷的降^f氐是由于腫瘤體積相比于治療開始時的腫瘤體積的消退，從而表明該抑制劑對于黑素瘤癌細胞是細胞毒性的。其它實施方式中，腫瘤負荷的降低是由于與未接受黑素瘤抑制劑的對照哺乳動物受試者相比的腫瘤生長的抑制，從而表明該抑制劑對于黑素瘤癌細胞是抑制細胞的。一些實施方式中，取自治療后3個月內(nèi)的哺乳動物受試者的生物樣品相比于取自未治療的受試者的生物樣品所測量的MIA濃度的至少20%降^4明對黑素瘤抑制劑是正反應。一些實施方式中，取自治療后3天的哺乳動物受試者的生物樣品相比于取自未治療的受試者的生物樣品所測量的MIA濃度至少20%的降^^明對黑素瘤抑制劑是正反應?？蓪嵺`本發(fā)明這一方面的方法以確定哺乳動物受試者對用任何黑素瘤抑制劑例如小分子、蛋白質(zhì)治療物、抗體、核酸分子治療的反應。如本文所使用，黑素瘤抑制劑是任何在體外培養(yǎng)的細胞中和/或在哺乳動物受試者體內(nèi)造成黑素瘤細胞生長抑制的藥劑。用于實踐本發(fā)明的黑素瘤抑制劑的實例包括但不限于CHIR-265、索拉非尼、CHIR-258、達卡巴溱(DTIC，DTIC-Dome)、替莫唑胺(Temodar)、卡莫司汀(BCNU，BiCNU)、洛莫司汀(CeeNU)、IL-2(Proleukin)和干擾素oc-2b(IntonA)。一個實施方式中，如實施例2-4中更詳細地描述，本發(fā)明的方法用于確定具有黑素瘤肺瘤細胞的哺乳動物受試者對選自CHIR-265、索拉非尼和CHIR-258的黑素瘤抑制劑的治療的反應。CHIR-265,目前稱作RFB-265,是化合物{1-甲基-5-[2-(5-三氟甲基-lH-咪唑-2-基)-吡啶-4-基氧基卜111-苯并咪唑-2-基}-(4-三氟曱基-苯基)-胺，其具有下述結(jié)構(gòu)CHIR-265是一種新型Raf/VEGFR抑制劑，其描述見于VenetsanakosE,等人，iVoc.」膨r.i^s.2006:47:摘要4854;AmiriP.等人，尸亂Ca,r紐.2006:47:摘要4855;和StuartD.等人，戶nc./im化Omcw/d2006:47:摘要4856，其全部在此通過引用作為參考。CHIR-258，目前稱作TKI258,是化合物4-氨基-5-氟-3-15-(4-甲基哌喚小基)—1H-笨并咪唑-2-基l喹啉-2(1H)-酮，其描述于美國專利No.6,774,237。CHIR-258是多耙標化的RTK抑制劑，其描述于LopesdeMenezesDE等人，C7/rt.CVmc"紐2005:11:5281-5291和LeeSH等人，a/w.Omcw/M.2005:11:3633-3641，其全部在此通過引用作為參考。索拉非尼(也稱作"BAY43-卯06")是Raf及受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑，其描述于WilhelmS.M.等人，CWicw64:7099-7109(2004)，其通過引用作為參考。一個實施方式中，本發(fā)明的方法用于確定具有黑素瘤腫瘤細胞的哺乳動物受試者對CHIR-265治療的反應。根據(jù)這一實施方式，在獲自每隔一天口服100mg/kg的CHIR-265的荷黑素瘤胂瘤動物的生物樣品中已經(jīng)，見察到MIA濃度的快速降低。如圖5A所示及實施例3所述，在用CHIR-265(10()mg/kg)治療的動物中，第3天時，MIA濃度(起始平均濃度為27.8ng/ml)降低至平均濃度10.4ng/ml(降低62%)，這與在第3天測量的29%的腫瘤消退相關(guān)(參見圖5B)。另一實施方式中，本發(fā)明的方法用于確定具有黑素瘤腫瘤細胞的哺乳動物受試者對CHIR-258治療的反應。4艮據(jù)這一實施方式，在獲自于13天內(nèi)口服10劑60mg/kgCHIR-258的荷黑素瘤腫瘤動物的生物樣品中已經(jīng)觀察到MIA濃度降低。如圖4A所示，在用CHIR-258(60mg/kg)治療的動物中，于第3天觀察到MIA統(tǒng)計學上顯著的降低，這與在第8天測量的腫瘤生長抑制相關(guān)(參見圖5B)。一些實施方式中，相比于獲自治療前人受試者的第一生物樣品中MIA濃度，獲自治療后人受試者的第二生物樣品(例如血清)中MIA濃度的降低用作早期效力端點來預測黑素瘤抑制劑在降低參與臨床試驗的受試者中腫瘤負荷的效力。本發(fā)明的方法可用于確定哺乳動物受試者對通過任何適合的給藥途徑施用黑素瘤抑制劑進行治療的反應。黑素瘤抑制劑可以藥物組合物施用。醫(yī)藥領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的常規(guī)方法可以通過標準方法經(jīng)常規(guī)途徑(例如口服、皮下、肺內(nèi)、經(jīng)粘膜、^M內(nèi)、子宮內(nèi)、舌下、鞘內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑)用于向哺乳動物受試者施用藥物組合物。例如，黑素瘤抑制劑可與藥學可接受介栽體、栽體或稀釋劑組合或一起施用，其根據(jù)給藥所需的制劑的形式可采用廣范的形式。例如，可使用任何常規(guī)藥學介質(zhì)，例如水、乙二醇、油類、醇類等配制口服劑量形式的組合物。本發(fā)明的方法可用于確定給予哺乳動物受試者的黑素瘤抑制劑的有效量。有效量指通常足以給正在接受治療的哺乳動物受試者帶來期望的治療效果的量或劑量。黑素瘤抑制劑的有效量或劑量可通過常規(guī)方法例如建模、劑量遞增研究或臨床試驗，以及通過考慮常規(guī)因素例如給藥或藥物遞送模式或途徑、藥劑的藥物動力學、黑素瘤的嚴重程度和病程、受試者之前或正在進行的治療、受試者的健康狀況和對藥物的反應來確定。示例性劑量為每天每千克受試者體重約O.OOlmg至約200mg，優(yōu)選約0.05mg/kg/天至10()mg/kg/天，或約lmg/kg/天至35mg/kg/天?；蛘撸梢远ㄆ诜绞绞┯脛┝?，例如每隔一天一次(例如每隔一天0.05mg/kg至100mg/kg)。另一方面，本發(fā)明提供確定哺乳動物受試者是否需要繼續(xù)接受黑素瘤抑制劑的治療的方法。本發(fā)明這一方面的方法包括(a)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始前，取自哺乳動物受試者的第一生物樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始后，自該哺乳動物受試者所取的第二生物樣品中MIA的第二濃度；(c)比較MIA的所述第一和第二濃度，和(d)如果MIA的第二濃度相比于MIA的第一濃度降低至少20%，則確定應繼續(xù)用黑素瘤抑制劑治療該患者?？墒褂萌魏魏谒亓鲆种苿ū疚乃瞿切﹣韺嵺`才艮據(jù)本發(fā)明這一方面的方法。一些實施方式中，在治療開始前從受試者取第二生物樣品，以及在開始治療后的3天至3個月(例如1周內(nèi)、兩周內(nèi)、一個月內(nèi)、兩個月內(nèi)或3個月內(nèi))期間內(nèi)至少一次取^^。另一方面，本發(fā)明提供評估黑素瘤抑制劑在治療具有黑素瘤的哺乳動物受試者中的黑素瘤的效力的方法。該方法包括(a)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始前，取自哺乳動物受試者的第一生物樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始后，自該哺乳動物受試者所取的第二生物樣品中MIA的第二濃度；和(c)比較MIA的第一和第二濃度，其中在第二生物樣品中測量的MIA第二濃度相比于在第一生物樣品中測量的MIA第一濃度的降低表明該抑制劑對治療黑素瘤有效力。一些實施方式中，本發(fā)明這一方面的方法還包括在用抑制劑治療前測量哺乳動物受試者中至少一個黑素瘤腫瘤的體積；和在施用抑制劑后至少測量一次黑素瘤肺瘤的體積并比較在治療開始前和治療后所取的胂瘤體積測量值以確定腫瘤體積是否降低。本發(fā)明這一方面的一些實施方式中，在檢測到腫瘤體積可檢測的減小前，MIA的血清濃度的降低與治療黑素瘤的抑制劑的效力正相關(guān)。例如，如實施例3所述，觀察到用黑素瘤抑制劑CHIR-258(60mg/kg)治療的黑素瘤異種移植物小鼠模型在第3天導致MIA血漿濃度的統(tǒng)計學上顯著的降低，其領(lǐng)先于在第8天相比于栽體治療的受試者而檢測到的腫瘤負荷的統(tǒng)計學顯著降低，且其是腫瘤負荷的統(tǒng)計學顯著降低的預示(參見圖5A和5B)。此外，因用不同的黑素瘤抑制劑治療而導致的肺瘤減少程度與MIA血漿濃度相關(guān)，例如CHIR-265治療(MIA低于3ng/ml的檢測水平，>97%的腫瘤生長抑制)；索拉非尼治療(MIA為28.9ng/ml，69%的腫瘤生長抑制)?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域認可的方法測量哺乳動物受試者中的腫瘤體積。例如，可使用卡尺測量，用下述等式估算腫瘤體積(axb2)x0.5，其中"a"是最大直徑而"b"是垂直于直徑的長度，如實施例2所述。其它檢測哺乳動物受試者(例如人)中腫瘤收縮的有用技術(shù)包括影像技術(shù)，例如電腦斷層(CT)掃描、磁共振成像(MRI)掃描。結(jié)合影像技術(shù)的腫瘤收縮通常使用JourNatl.CancerInstit.92:205-216(2000)中所述的實體瘤療效反應的評價(ResponseEvaluationCriteriaInSolidTumors)(RECIST)標準來評估，其在此通過引用作為參考。其它技術(shù)可用于評估體內(nèi)腫瘤的代謝活動，包括正電子成像術(shù)(PET)、氟脫氧葡萄糖(FDG-PET)，以及可使用氟脫氧胸腺嘧啶(FLT-PET)評估DNA合成。對于臨床前模型，可使用其它技術(shù)，其包括使用由標記基因(例如熒光素酶基因)遺傳修飾的黑素瘤腫瘤細胞。本發(fā)明的方法可用于評估一或多種候選黑素瘤抑制劑在動物^t型中的效力，例如在臨床前試驗中。例如，使用人黑素瘤異種移植物腫瘤模型的本發(fā)明方法的實施方式的實踐描述于下面實施例2中。又一方面，本發(fā)明提供鑒定對治療黑素瘤具有效力的藥劑的方法。該方法包括(a)確定給予黑素瘤哺乳動物細胞系藥劑前，取自培養(yǎng)的黑素瘤哺乳動物細胞系的第一樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定給予黑素瘤哺乳動物細胞系藥劑后，取自黑素瘤哺乳動物細胞系的第二樣品中MIA的第二濃度；(c)比較MIA的第一和第二濃度；和(d)如果MIA的第二濃度相比于MIA的第一濃度降低至少20%,則確定該藥劑對治療黑素瘤具有效力?？墒褂迷谥委燁净己谒亓龅牟溉閯游锸茉囌咧泻蜻x的治療應用的黑素瘤抑制劑的任何藥劑類型來實踐本發(fā)明這一方面的方法。例如，該藥劑可能是小分子、蛋白質(zhì)治療劑、抗體或核酸分子。一些實施方式中，實踐該方法以從多種藥劑(例如小分子的組合文庫)中鑒定一或多種藥劑。以任何適于藥劑類型的方式，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，可將藥劑給予培養(yǎng)的黑素瘤哺乳動物細胞。一些實施方式中，可用陽性對照黑素瘤抑制劑，例如如本文所述的CHIR-265、索拉非尼或CHIR-258實踐該方法。可使用任何黑素瘤哺乳動物細胞系實踐該方法，例如，選自G361、SKMEL-28、A375M和CHL-1的人黑素瘤哺乳動物細胞系，如進一步描述于實施例1。盡管已經(jīng)說明并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應理解可以在其中進行多種改變而不背離本發(fā)明的精神和范圍。實施例1本實施例闡述了MIA由人黑素瘤細胞系表達并分泌而不在人結(jié)腸癌細胞系中表達。方法獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)的人黑素瘤細胞系G361、SKMEL-28和CHL-1;以及結(jié)腸癌細胞系HCT-116。獲自德克薩斯大學M.D.安德森癌癥中心(Houston,TX)的人黑素瘤細胞系A375M和人結(jié)腸癌細胞系HT-29P。將G361、A375M和HT-29P細胞系在McCoy氏5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)；SKMF丄-28細胞系保持在極限必須培養(yǎng)基(MEM)中；在Dulbecco氏改良的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中生長CHL-1細胞系；和在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)HCT-116細胞系。所有細胞培養(yǎng)基均補充10。/。胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、lmM丙酮酸鈉、1XMEM維生素、IXMEM氨基酸和IXMEM非必需氮基酸。所有細胞系都在5%C02濕潤大氣下，于37°C保持。,他/ti伊遽》浙將人黑素瘤細胞系(A375M、G361、SKMEL-28和CHL-1)以AA結(jié)腸癌細胞系(HT-29P和HCT-116)在磷酸鹽緩沖液(PBS，Mediatech，Inc.,Herndon，VA)中沖洗兩次并在含有新鮮的1mM苯曱磺酰氟、完全迷你型蛋白酶抑制劑混合劑片劑(2片/25ml的裂解緩沖液)(RocheDiagnosticsGmbH,Mannheim,德國)和IX磷酸酶抑制劑混合劑II(Sigma-Aldrich,St,Louis,MO)的RIPA緩沖液(50mMTrisHC1，pH7.4，150mMNaCl，1mMEDTA,1mMEGTA，2mM原釩酸鈉，20mM焦磷酸鹽，1%TritonX-IOO，"/。脫氧膽酸鈉和0.1。/oSDS)于水上裂解20min。于離心管中收集裂解物，于4°C以14KRPM離心20min并過濾通過QIAshredder管(QIAGEN,Inc.,Valencia,CA)。按照說明書的方法(Pierce,Rockford，IL)使用BCA檢測法確定蛋白濃度。通過標準方法使用Novex18%Tris-甘氨酸^M(Invitrogen，Carlsbad,CA)操作樣品用于Western印跡。用在含有5%奶粉的TBST(含0.1%Tween20的Tris緩沖液,FisherScientific,Hampton,NH)中以1:1000稀釋的山羊多克隆抗體(R&DSystems,Minneapolis,MN)于4°C過夜孵育而檢測MIA。二抗為以1:5000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的抗山羊抗體(VectorLaboratories,Burlingame,CA)。使用增強型化學發(fā)光(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)可視蛋白質(zhì)條帶。用(3-肌動蛋白檢測(Sigma-Aldrich,StLouis,MO)來確認等量上樣和轉(zhuǎn)移。使用兩種商用人重組MIA蛋白(MW12-kDa)作為陽性對照(Axxora，LLC,SanDiego,CA和ProSpec-TanyTechnoGene,LTD,Rehovot，以色歹寸)。將等量人黑素瘤和結(jié)腸癌細胞(每種細胞系-250,000個細胞)接種于組織培養(yǎng)板中并在48h后收集每種細胞系的培養(yǎng)基。使用商品化一步F丄ISA試劑盒(羅氏i貪斷z^司，印第安納波利斯，IN)按照^沈明書的方法來測量培養(yǎng)基或血漿中的MIA濃度。使用3-37ng/ml范圍內(nèi)的標準曲線計算測試樣品中的MIA濃度。當MIA濃度超過最大標準濃度時，以1:5稀釋樣品并再次檢測以使得結(jié)果落在標準曲線的線性范圍內(nèi)。使用Student"檢驗(雙尾分布，兩樣本不等方差)評估數(shù)據(jù)，用戶《0.05作為顯著性標準。結(jié)果在Western印跡中觀察到所有檢測的人黑素瘤細胞系(A375M、G361、SKMEL-28和CHL-1)中可檢測出的MIA蛋白濃度，而在人結(jié)腸癌細胞系(HT-29P和HCT-116)中未檢測到(數(shù)據(jù)未示出)。在黑素瘤細胞系中觀察到的MIA蛋白與陽性對照重組MIA蛋白(MW12kDa)共遷移。用卩-肌動蛋白檢測(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)來確認等量上樣和轉(zhuǎn)移。圖2示出測量MIA從黑素瘤和結(jié)腸癌細胞系分泌到培養(yǎng)基中的ELISA檢測法的結(jié)果。如圖2所示，在黑素瘤細胞系A375M、G361SKMEL-28和CHL-1中檢測到MIA分泌而在結(jié)腸癌細胞系HT-29P和HCT-116中沒有檢測到MIA分泌。虛線(——)表示檢測法的檢測極限(3ng/ml)。這些結(jié)果證明MIA是由黑素瘤細胞系而非結(jié)腸癌細胞系所表達和分泌。實施例2這一實施例闡述了MIA可用作荷人黑素瘤腫瘤小鼠中腫瘤負荷的替代性標記。方法用購自CharlesRiver實驗室(Wilmington,MA)的雌性無胸腺小鼠(8-12周齡)進行A375人黑素瘤異種移植物研究。將近2.5乂106個細胞皮下(s.c.)植入小鼠后肋腹區(qū)。當腫瘤達到平均尺寸為250mm3時收集血漿樣品(n=10)并在MIA分析前于-80。C儲存。通常當腫瘤達到平均尺寸250mm3時開始給藥。也收集來自非荷瘤(未處理)小鼠(n=4)的血漿樣品用于比較，如圖3所示。每周進行兩次卡尺測量以使用下述等式估算腫瘤體積(axb2)x0.5，其中"a"是最大直徑而"b"是垂直于直徑的長度。按下述進行MEXF276人黑素瘤腫瘤外植體異種移植物研究和MEXF1341人黑素瘤腫瘤外植體異種移植物研究。MEXF276人黑素瘤腫瘤細胞和MEXF1341人黑素瘤胂瘤外植體細胞最初源自分離自不同黑素瘤患者(獲自OncotestGmbH,InstituteforExperimentalOncology,Frieburg,德國)的外科標本并在棵鼠中增殖為異種移植物。從供體小鼠取出肺瘤后，將樣品切成片斷(直徑l-2mm)并置于RPMI1640培養(yǎng)基，隨后皮下植入受體雄性NMRI小鼠(6-8周齡)。通常當腫瘤直徑達到平均尺寸6-8mm時開始給藥。在潔凈室的條件下，于無菌的濾蓋(filter-top)籠中飼養(yǎng)動物并且該動物可隨意接觸無菌的嚙齒類動物食物和水。治^浙在Chiron公司(Emeryville,CA)合成小分子化合物CHIR-265、索拉非尼和CHIR-258。在PEG400緩沖液中配制CHIR-265和索拉非尼；將CHIR-258溶解在水中。CHIR-265是新型Raf/VEGFR抑制劑(參見VenetsanakosE.等人，尸度.CVm(^7d2006:47:摘要4854;AmiriP.等人，P/w./4膨r.^teoc.CVmcer2006:47:摘要4855;和StuartD.等人，尸艦j附".A脆柚2006:47:摘要4856)。CHIR-258是多靶標化RTK抑制劑(參見LopesdeMenezesDE等人，C7/"./仏2005:11:5281-5291;LeeSH等人，C7/".2005:11:3633-3641)。索拉非尼是Raf和受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑(參見WilhelmS.M.等人，Ca/d":7099-7109(2004))。^治^浙的治^:第一實驗中，將荷A375M人黑素瘤肺瘤小鼠(n=5)隨機分組并用100mg/kg的CHIR-265(n=5)或載體(n=5)口月良給藥，每隔一天一次。單獨用PEG400緩沖液治療的荷腫瘤動物用作栽體對照。以100x[1-(平均腫瘤體積經(jīng)躲治賴/平均腫瘤體積經(jīng)載體治^)]計算藥物治療后腫瘤生長抑制(TGI)百分數(shù)。第四次給藥后48h收集血漿樣品以用ELISA進行MIA分析。圖4A示出MIAELISA檢測法的結(jié)果。第二實驗中，將荷MEXF276人黑素瘤腫瘤小鼠隨機分組并且每組用CHIR-265(100或10mg/kg)或索拉非尼(100mg/kg)口服給藥(n=4/組)。將給藥第一天指定為第0天。如此，CHIR-265(10mg/kg)的給藥計劃表為第0、2、4、6、14、16和20天各10mg/kg。CHIR-265(100mg/kg)的給藥計劃表為第O、2、14、16和20天各100mg/kg。最后，第0-20天期間索拉非尼和PEG400載體的給藥計劃表為每天100mg/kg。每周測量肺瘤體積兩次并按上述確定肺瘤生長抑制百分數(shù)。表2示出腫瘤體積測量值。第20天最后一次給藥后4小時收集血漿樣品并在MIA分析前于-80。C儲存。按實施例1所述進行ELISA檢測來確定MIA血漿濃度。圖4B示出MIAELISA檢測法的結(jié)果。第三實驗中，將荷MEXF1341人黑素瘤腫瘤小鼠隨機分組并且每組用CHIR-265(100或10mg/kg)或索拉非尼(100mg/kg)口服給藥(n=4/組)。將給藥第一天指定為第0天。如此，CHIR-265(10mg/kg)的給藥計劃表為第0、2、4、6、14、16和20天各10mg/kg。CHIR-265(100mg/kg)的給藥計劃表為第O、2、14、16和20天各100mg/kg。最后，第0-20天期間索拉非尼和PEG400載體的給藥計劃表為每天100mg/kg。每周測量肺瘤體積兩次并按上述確定腫瘤生長抑制百分數(shù)。表2示出腫瘤體積測量值。第20天最后一次給藥后4小時收集血漿樣品并在MIA分析前于-80。C儲存。按實施例1所述進行ELISA檢測來確定MIA血漿濃度。圖4C示出MIAELISA檢測法的結(jié)果。結(jié)果圖3示出對未處理非荷腫瘤小鼠(n=4)和植入A375M人黑素瘤細胞(腫瘤體積約250mm3)的無胸腺棵鼠(n=10)的MIAELISA檢測結(jié)果。如圖3所示，在荷黑素瘤腫瘤小鼠中檢測到MIA血漿濃度為16-48ng/ml(平均=31ng/ml)。相反，對未處理動物的MIAELISA檢測獲得的數(shù)值低于該檢測的檢測極限(如圖3虛線所示的3ng/ml)。這些結(jié)果證明MIA在荷人黑素瘤細胞的小鼠體內(nèi)分泌并且可以通過ELISA在血漿中檢測到。表2:用黑素瘤腫瘤抑制劑治療后的胂瘤體積:<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>圖4A圖解說明A375M黑素瘤異種移植物小鼠模型中，MIA血漿濃度降低來響應由口服給藥CHIR-265所誘導的腫瘤生長抑制。圖表上的每個點表示來自單個動物的數(shù)據(jù)。在載體與CHIR-265治療的比較中，由Student氏t-檢驗確定的MIA血漿濃度的戶$0.05。圖表中的虛線表示該檢測法的檢測極限(3ng/ml)。如上面表2所示，載體和CHIR-265治療組在第10天的平均腫瘤體積分別為436±69.5和133士14.1mm3(±SE)(P<0.02)。因此，每隔一天口服給藥100mg/kg的CHIR-265造成在四次劑量后，相比于開始的腫瘤體積(250mm3)，近50%的顯著腫瘤消退。這在與載體治療相比時，相當于70。/。腫瘤生長抑制(p<0.02)。如圖4A所示，M1A血漿濃度的顯著降低與這一腫瘤消退相關(guān)。在CHIR-265四個劑量后，所有經(jīng)藥物治療的動物的MIA濃度都接近于檢測的下限(4ng/ml)。相反，載體治療的小鼠具有平均MIA濃度為69.2ng/ml(范圍為21ng/ml至119ng/ml)，這比經(jīng)CHIR-265治療的小鼠高17倍(n-5/組)(PS0.05)。圖4B圖解說明MEXF276黑素瘤異種移植物小鼠模型中，MIA血漿濃度降低來響應由口服給藥CHIR-265和索拉非尼所誘導的腫瘤生長抑制。如上面表2所示，在第20天測量的平均腫瘤體積為對于載體為2卯2士374mm，對于100mg/kg的CHIR-265為19士2.9mm，對于10mg/kg的CHIR-265為58士15.2mm3和對于索拉非尼為887土196mm3(±SE)(所有藥物治療組對于載體組，P<0.007)。因此，在MEXF276黑素瘤才莫型中觀察到CHIR-265和索拉非尼治療都造成顯著的腫瘤生長抑制，兩種劑量的CHIR-265導致>97%的腫瘤生長抑制而索拉非尼治療導致69%的肺瘤生長抑制。如圖4B所示，這些腫瘤抑制反應與受治療的動物中MIA血漿濃度的顯著降低相關(guān)。栽體治療組的平均血漿MIA濃度為113.5ng/ml，相比之下，索拉非尼治療組為28.9ng/ml。來自CHIR-265治療組的MIA血漿濃度低于檢測極限(所有藥物治療組對栽體治療組，戶<0.04)。此外，由不同治療產(chǎn)生的肺瘤減少程度與MIA血漿濃度相關(guān)，例如CHIR-265治療(MIA未檢測到，>97%的肺瘤生長抑制)；索拉非尼治療(MIA為28.9ng/ml，69%的腫瘤生長抑制)。圖4C圖解表明MEXF1341黑素瘤異種移植物小鼠才莫型中，MIA血漿濃度降低來響應由口服給藥CHIR-265和索拉非尼所誘導的腫瘤生長抑制。如上面表2所示，在第20天測量的平均腫瘤體積為對于栽體為1895士535mm3，對于100mg/kg的CHIR-265為575士214mm3,對于10mg/kg的CHIR-265為1190士291mm3和索拉非尼為1338士264mm3(±SE)(所有藥物治療組對于載體治療組，P>0.08)。因此，在MEXF276黑素瘤模型中觀察到CHIR-265和索拉非尼治療未造成顯著的腫瘤生長抑制，兩種劑量的CHIR-265導致37%至70%的腫瘤生長抑制。如圖4C所示，盡管MEXF1341異種移植物中J^出血漿MIA濃度比MEXF276中低，但檢測到MIA的顯著(2倍)降低以響應兩種CHIR-265治療(PO.02)。索拉非尼治療也降低血漿MIA濃度(P>0.17)。與在A375M和MEXF276異種移植物模型中所觀察到的結(jié)果一致，MEXF1341異種移植物模型中由不同治療產(chǎn)生的腫瘤減少程度與血漿MIA濃度相關(guān)。MEXF276和MEXF1341異種移植物模型中的結(jié)果用于預測人腫瘤，因為該腫瘤細胞分離自人黑素瘤患者且在棵鼠中連續(xù)傳代。由于這些腫瘤細胞并未在培養(yǎng)基中生長，所以它們與人受試者中的原始腫瘤特性更相似。這些結(jié)果表明MIA血漿濃度用作荷黑素瘤肺瘤的動物中腫瘤負荷以及對黑素瘤抑制劑治療的反應的敏感的替代性標記。實施例3這一實施例闡述了MIA是臨床前黑素瘤模型中用于抗肺瘤藥的活性的早期及精確指示物。方法按下述調(diào)查藥物治療后血漿中MIA濃度的動力學。荷A375M肺瘤小鼠口服給藥CHIR-265(100mg/kg)、CHIR-258(60mg/kg)或栽體(n=10/組)。開始給藥前收集血漿樣品并且在第3、8和13天再次收集。在相同的時間點-使用實施例2所述的方法測量腫瘤體積。結(jié)果圖5A圖示表明A375M人黑素瘤異種移植物模型中，響應于用CHIR-258和CHIR-265治療的MIA血漿濃度的早期及顯著變化。對于所有相對于載體的比較，*尸<0.05。誤差條表示標準差(SE)。虛線表示該檢測的檢測極限。圖5B示出荷A375M人黑素瘤肺瘤小鼠中用CHIR-258或CHIR-265治療后第3、8、13天相比于栽體對照的腫瘤體積。對于CHIR-265對栽體，YpO.Ol,對于CHIR-258對載體，巾尸<0.005。誤差條表示標準差(SE)。圖5A和5B的結(jié)果示出在第3天，CHIR-258和CHIR-265都造成MIA血漿濃度的統(tǒng)計學上顯著的降低，而該濃度在治療期間持續(xù)降低(P<0.05)。第0天測量的MIA濃度基線為27.8ng/kg。相比于導致肺瘤抑制卻不消退的CHIR-258治療，導致腫瘤消退的CHIR-265治療^f吏得MIA血漿濃度降低更明顯。用CHIR-265治療后，MIA濃度在第3天降低至10.4ng/ml，為MIA濃度62%的降低，而這與29%的肺瘤消退相關(guān)(圖5A)。第13天，在CHIR-265治療組中檢測不到MIA濃度。CHIR-258治療導致腫瘤生長抑制，然而并未XRL察到消退。然而，第3天，相比于載體，CHIR-258治療導致MIA濃度降至統(tǒng)計學上顯著更低的水平而在第13天，相比于基線，降低63%。這些數(shù)據(jù)證明MIA是藥物活性的早期指示物，且ELISA檢測到的循環(huán)中MIA濃度的變化早于在肺瘤負荷中可觀察到的體積變化。用化合物CHIR-265和CHIR-258的治療導致不同程度的胂瘤生長抑制和/或肺瘤消退，并且伴隨對肺瘤負荷的這些作用，MIA血漿濃度存在顯著且相關(guān)的降低。例如，CHIR-265治療導致腫瘤消退并伴隨MIA濃度快速且顯著地降低，而CHIR-258治療導致肺瘤生長抑制，伴隨較不顯著的MIA濃度減少。另一明顯觀察為MIA濃度降低比肺瘤體積減小更早且幅度更大。這以在給藥計劃表中早期時間點的MIA.濃度的顯著降低為證。即使當腫瘤體積穩(wěn)定時，如在用CHIR-258治療時所觀察的，MIA濃度仍繼續(xù)降低。雖然不希望受任何理論的局限，這一作用可能歸因于壞死的及瀕死細胞的存在，它們對胂瘤體積有作用但卻不再分泌MIA。根據(jù)這些臨床前結(jié)果，對人類的臨床研究可顯示在腫瘤反應前可以測量降低的MIA濃度，從而提供在人受試者中存在對黑素瘤抑制劑響應的正反應的早期指示。此外，本文描述的數(shù)據(jù)提示M1A可用于抑制細胞的藥劑以及細胞毒性的藥劑的人類臨床試驗。實施例4這一實施例闡述了MIA可用作荷CHL-1人黑素瘤腫瘤的小鼠中腫瘤負荷的替代性標記。方法動##費用購自CharlesRiver實驗室(Wilmington,MA)的雌性無胸腺ww/ww小鼠(8-12周齡)進行CHL-1人黑素瘤異種移植物研究。將MatrigelTM中的近5乂106個肺瘤細胞皮下(s.c.)植入小鼠后肋腹區(qū)。當腫瘤達到平均尺寸為200mm3時開始給藥。每周進行兩次卡尺測量以使用下述等式估算肺瘤體積(axb2)x0.5，其中'V，是最大直徑而"b"是垂直于直徑的長度。按實施例2所述制備小分子化合物CHIR-258。^治^浙的治^:將荷CHL-1人黑素瘤腫瘤小鼠隨機分組并且每組用30mg/kg和80mg/kg的CHIR-258(n-10/組)口服給藥，每日一次。將給藥第一天指定為第0天。在給藥前以及給藥第8和第22天收集血漿樣品。載體對照組也用于該研究(n=10)。賴圖6A圖示i兌明在CHIR-258或載體對照治療后，荷CHL-1人黑素瘤腫瘤細胞小鼠中的腫瘤體積。對于兩種CHIR-258治療對載體的治療，*尸<0.03。誤差條表示標準差(SE)。如圖6A所示，在第8天，相比于載體治療，以30mg/kg或80mg/kg的CHIR-258每日給藥一次的治療造成顯著的腫瘤生長抑制(/><0.03)。圖6B圖示說明CHIR-258治療對MIA血漿濃度的作用。對于所有對于栽體的比較，*P<0.05。誤差條表示標準差(SE)。虛線表示該檢測的檢測極限。如圖6B所示，當以30mg/kg和80mg/kg的劑量給藥時，CHIR-258都顯著抑制M1A分泌。如圖6B進一步所示，在給藥前，所有小鼠組中的血漿MIA濃度接近或低于該檢測的檢測極限。引起注意的是，CHL-1異種移植物在給藥前的MIA濃度(2.6ng/ml)低于A375M人黑素瘤異種移植物小鼠中的MIA濃度(如實施例2所述的31ng/ml)，盡管給藥前的平均初始腫瘤體積在相似的范圍(分別是200mm3對250mm3)內(nèi)。第8天，CHL-1異種移植^研究的對照組中的平均血漿MIA濃度接近7.7ng/ml，而在第8天及隨后的時間點，在用CHIR-258治療的兩組中均未檢測到血漿MIA濃度(參見圖6B)。這些結(jié)果表明盡管用CHIR-258治療造成腫瘤生長抑制而不造成消退，但該藥物對顯著降低血漿MIA濃度是有效的。這些結(jié)果與如實施例2所述的在A375M黑素瘤異種移植物模型中的結(jié)果一致。雖然不希望受任何理論的局限，這一作用可能歸因于壞死及瀕死細胞的存在，它們對腫瘤體積有作用但卻不再分泌MIA。該結(jié)果進一步支持MIA作為對黑素瘤治療中藥物反應和效力的早期指示物的應用。盡管說明并描述了本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，應理解，可以對其進行多種改變而不背離本發(fā)明的精神和范圍。權(quán)利要求1.一種確定具有黑素瘤腫瘤細胞的哺乳動物受試者對黑素瘤抑制劑治療響應的方法，包括(a)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始前，取自哺乳動物受試者的第一生物樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始后，自該哺乳動物受試者所取的第二生物樣品中MIA的第二濃度；和(c)比較MIA的第一和第二濃度，其中在第二生物樣品中測量的MIA第二濃度相比于在第一生物樣品中測量的MIA第一濃度的降低指示對黑素瘤抑制劑治療有正反應。2.權(quán)利要求l的方法，其中黑素瘤抑制劑是選自CHIR-265、索拉非尼和CHIR-258的小分子。3.權(quán)利要求1的方法，其中在治療開始后3個月內(nèi)測量的第二生物樣品中MIA的第二濃度的降低指示對黑素瘤抑制劑治療有正反應。4.權(quán)利要求1的方法，其中在治療后1周內(nèi)測量的第二生物樣品中MIA的第二濃度的降低指示對黑素瘤抑制劑治療有正反應。5.權(quán)利要求1的方法，其中第二生物樣品中MIA的笫二濃度相比于第一生物樣品中MIA的第一濃度至少20%的降低與哺乳動物受試者中腫瘤生長抑制相關(guān)。6.權(quán)利要求1的方法，其中MIA的第二濃度的降低用作評估哺乳動物受試者對黑素瘤抑制劑治療有響應的效力端點。7.權(quán)利要求1的方法，其中生物樣品是血樣。8.權(quán)利要求1的方法，其中使用與MIA特異性結(jié)合的抗體測定生物樣品中的MIA濃度。9.一種評估方法，用于評估黑素瘤抑制劑治療罹患黑素瘤的哺乳動物受試者的黑素瘤的效力，包括(a)確定用黑素瘤抑制劑治療開始前，取自哺乳動物受試者的第一生物樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始后，自該哺乳動物受試者所取的第二生物樣品中MIA的第二濃度；和(c)比較MIA的第一和第二濃度，其中在第二生物樣品中測量的MIA第二濃度相比于在第一生物樣品中測量的MIA第一濃度的降低指示抑制劑對治療黑素瘤有效力。10.權(quán)利要求9的方法，還包括在用抑制劑治療開始前，測量哺乳動物受試者至少一個黑素瘤腫瘤的體積；和在用抑制劑治療開始后測量至少一次黑素瘤腫瘤的體積，并且比較治療前后的腫瘤體積測量值以確定腫瘤體積是否已減小。11.權(quán)利要求9的方法，其中哺乳動物受試者接受臨床前試驗。12.權(quán)利要求9的方法，其中在用抑制劑治療開始后3個月內(nèi)取第二生物樣品。13.權(quán)利要求9的方法，其中在用抑制劑治療開始后1周內(nèi)取第二生物樣品。14.權(quán)利要求9的方法，其中在檢測到腫瘤體積可測量的減小之前的時間，測量到的MIA第二濃度的降低指示抑制劑對黑素瘤治療有效力。15.權(quán)利要求9的方法，其中黑素瘤抑制劑是選自CHIR-265、索拉非尼和CHIR-258的小分子。16.—種確定患者是否應該繼續(xù)接受黑素瘤抑制劑治療的方法，包括(a)確定用黑素瘤抑制劑治療開始前，取自哺乳動物受試者的第一生物樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始后，自該哺乳動物受試者所取的第二生物樣品中MIA的第二濃度；(c)比較MIA的所述第一和第二濃度；和(d)如果MIA的第二濃度相比于MIA的第一濃度降低至少20%，則確定應該繼續(xù)用黑素瘤抑制劑治療該患者。17.權(quán)利要求16的方法，其中黑素瘤抑制劑是選自CHIR-265、索拉非尼和CHIR-258的小分子。18.—種鑒定對黑素瘤治療有效力的藥劑的方法，包括(a)確定向培養(yǎng)的黑素瘤細胞系施用藥劑前，取自培養(yǎng)的黑素瘤細胞系的第一樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定向該培養(yǎng)的黑素瘤細胞系施用藥劑后，取自該黑素瘤細胞系的第二樣品中MIA的第二濃度；(c)比較MIA的所述第一和第二濃度；和(d)如果MIA的第二濃度相比于MIA的第一濃度降低至少20%，則確定該藥劑對黑素瘤治療具有效力。19.權(quán)利要求18的方法，其中黑素瘤細胞系是選自G361、SKMEL-28、A375M和CHL-1的人黑素瘤細胞系。全文摘要本發(fā)明提供一種確定具有黑素瘤腫瘤細胞的哺乳動物受試者對黑素瘤抑制劑治療的反應的方法。一方面，該方法包括(a)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始前，取自哺乳動物受試者的第一生物樣品中黑素瘤抑制性活性蛋白(MIA)的第一濃度；(b)確定在用黑素瘤抑制劑治療開始后，自該哺乳動物受試者所取的第二生物樣品中MIA的第二濃度；和(c)比較MIA的第一和第二濃度，其中在第二生物樣品中測量的MIA的第二濃度相比于在第一生物樣品中測量的MIA的第一濃度的降低指示對黑素瘤抑制劑治療有正反應。文檔編號G01N33/574GK101512343SQ200780033670公開日2009年8月19日申請日期2007年7月26日優(yōu)先權(quán)日2006年7月28日發(fā)明者C·海斯,E·韋內(nèi)特薩納科斯,M·福雷,N·譚申請人:諾瓦提斯公司