專利名稱：抗藥物抗體測定法的制作方法
技術領域：
本發明包含測定抗藥物抗體的方法，和用于這樣的測定法的試劑盒。
背景技術：
使用單克隆抗體的標準固相免疫測定法涉及在吸附在固相上的抗體 (捕獲抗體)、抗原、和針對抗原另一表位、綴合了酶或可檢測標記的抗
體(示蹤抗體)之間形成復合物。由此形成夾心體固相-捕獲抗體-抗原-示蹤抗體。在夾心體中，抗體綴合的酶活性(或可檢測標記的量)與孵育 介質中的抗原濃度成比例。 一種夾心測定法為雙抗原橋聯免疫測定法 (double antigen bridging immunoassay )，其中捕獲和示蹤抗體與抗原的 不同表位結合。Hoesel， W，等人在J. Immunol. Methods 294 (2004) 101-110 中報道了抗EPO雙抗原橋聯測定法，使用了與氨基和與糖基偶聯的固定 化rhEPO的混合物。免疫測定法如雙抗原橋聯ELISA是在研究患者對于 抗體藥物的免疫原性反應中所通常應用的測定法類型。Mire-Sluis, A.R. 等人，在J. Immunol. Methods 289 (2004) 1-16中，總結了設計和優化檢測 針對生物技術產品的宿主抗體的免疫測定法的建議。根據Mire-Sluis等人 所述，眾所周知的抗藥物抗體測定法形式顯示出不少缺點。抗藥物抗體測 定法在例如WO 2005/045058和WO 90/006515中有所提及。抗獨特型抗 體測定法在例如US5，219，730、 WO 87/002778、 EP 0 139 389和EP 0 170 302中有所提及。Wadhwa， M.等人在J. Immunol. Methods 278 (2003) 1-17 中報道了檢測、測量和表征由治療性生物制品誘導的不必要抗體的方法。 PCT/EP2007/001935中描述了用雙抗原橋聯免疫測定法對樣品中針對藥物 抗體的抗體進;f亍免疫測定的免疫測定法。WO 2006/066912中描述了測定 猴中的人抗體的免疫測定法。本領域中(例如US 2003/0068664)能夠檢測活性治療性抗體的測定系統同樣公知。這樣的系統需要抗原與固相結合， 治療性抗體與此結合的抗原結合，及檢測通過抗原而與固相結合的治療性 抗體。
發明簡述
本發明提供了與食蟹猴(Cynomolgus ) IgG特異性結合、不與人IgG 結合的抗體。優選所述抗體為單克隆抗體。
在優選實施方案中，根據本發明的抗體用細胞系3.25.12 (DSM ACC2799 ) 、 3.29.15 (DSM ACC2800 ) 、 4.38.30 (DSM ACC2801 ) 、 7.57.41 (DSMACC2802)或7.72.32 (DSM ACC2803 )生產。
本發明提供了用夾心測定法，即雙抗原橋聯免疫測定法對猴種的樣品 中藥物抗體(DA)和針對所述藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)的 免疫復合物進行免疫測定的方法。
所述免疫復合物進一步縮寫為DA/ADA復合物。
本發明提供了免疫測定樣品中DA/ADA復合物的方法，其使用包含捕 獲抗體和示蹤抗體的夾心型或雙抗原橋聯免疫測定法，特征在于所述抗體 之一，即示蹤抗體或捕獲抗體，是與食蟹猴IgG特異性結合的抗體，另一 抗體是與人免疫球蛋白特異性結合的抗體。
在本發明的優選實施方案中，捕獲抗體為與人免疫球蛋白特異性結合 的抗人Ig抗體，示蹤抗體為與食蟹猴IgG特異性結合的抗食蟹猴IgG抗 體。在本發明的優選實施方案中，捕獲抗體為與食蟹猴IgG特異性結合的 抗食蟹猴IgG抗體，示蹤抗體為與人Ig特異性結合的抗人Ig抗體。
優選抗人Ig抗體與人IgG特異性結合。優選抗食蟹猴IgG抗體和/或 抗人Ig抗體為單克隆抗體。優選所述特異性結合人免疫球蛋白的抗體不與 食蟹猴IgG結合。優選所述結合人免疫球蛋白的抗體由細胞系DSM ACC2708生產。優選所述結合食蟹猴IgG的抗體不與人IgG結合。優選 所述結合食蟹猴IgG的抗體由細胞系3.25.12 (DSM ACC2799) 、 3.29.15 (DSM ACC2800 ) 、 4.38.30 (DSM ACC2801 ) 、 7.57.41 (DSM ACC2802 )或7.72.32 (DSM ACC2803 )生產。
在所述測定過程中，在抗食蟹猴IgG抗體、DA/ADA復合物和抗人Ig 抗體之間形成復合物，形成的復合物的量與DA/ADA復合物、DA和/或 ADA的濃度相關聯。
根據本發明，對于形成的DA/ADA復合物的檢測可以進行直接的樣品 分析。在這樣的測定法中，只有樣品中含有藥物抗體和抗藥物抗體兩者才 能見到陽性信號。
根據本發明，可選地，樣品分析(可以)在與預定量的藥物抗體預孵 育之后進行。在這樣的測定法中，如果樣品中含有抗藥物抗體，就可以見 到陽性信號，而不依賴于樣品中存在/不存在藥物抗體。
優選捕獲抗體通過被動吸附與固相綴合，因此至少在兩個不同的抗體 位點與固相綴合。例如Butler, J.E.， Solid Phases in Immunoassay,于 Immunoassay, Diamandis， E.P.和Christopoulos， T.K.(編)學術出版社, 圣地亞哥(1996) ， 205-225頁中對被動吸附有所描述。
在本發明的優選實施方案中，捕獲抗體通過特異性結合對固定化。這 樣的結合對(第一組分/第二組分)為，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋 白/生物素、抗體/抗原(見例如Hermanson， G.T.等人，Bioconjugate Techniques,學術出版社，1996)、凝集素/多糖、類固醇/類固醇結合蛋白、 激素/激素受體、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。優選捕獲抗體與生物素 綴合，通過固定化抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素進行固定。
優選抗體與其綴合配偶體的綴合是通過化學結合實現，經由N端和/ 或s-氨基(賴氨酸)、不同賴氨酸的s-氨基、抗體氨基酸骨架的氛基、巰 基、羥基和/或酚官能團和/或抗體糖結構的糖醇基進行結合。
在本發明的優選實施方案中，示蹤抗體與可檢測的標記綴合，優選通 過特異性結合對綴合。這樣的結合對(第一組分/第二組分)為，例如抗生 蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白/生物素、抗體/抗原、凝集素/多糖、類固醇/類 固醇結合蛋白、激素/激素受體、酶/底物、IgG/蛋白A和/或G等。優選示 蹤抗體通過洋地黃毒苷和針對洋地黃毒苷的抗體與可檢測的標記綴合。可選地，示蹤抗體與電化學發光標記綴合，如釕聯吡啶絡合物。
本發明的其它實施方案中提供了用夾心型或雙抗原橋聯免疫測定法免
疫測定猴種樣品中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)的方法。
本發明提供了免疫測定樣品中ADA的方法，使用包含捕獲抗體和示 蹤抗體的夾心型或雙抗原橋聯免疫測定法，特征在于所述抗體之一是與食 蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體，另一抗體為藥物抗體。
在免疫測定ADA的優選實施方案中，捕獲抗體為藥物抗體，示蹤抗 體為與食蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗食蟹猴IgG抗體。在 免疫測定ADA的其它優選實施方案中，捕獲抗體為與食蟹猴IgG特異性 結合、不與人IgG結合的抗食蟹猴IgG抗體，示蹤抗體為藥物抗體。在所 述測定過程中，在藥物抗體、ADA和抗食蟹猴IgG抗體之間形成復合物， 形成的所述復合物的量與ADA的濃度相關聯。在免疫測定ADA的優選實 施方案中，所述抗食蟹猴IgG抗體為單克隆抗體(抗食蟹猴mAb)。
本發明的另一實施方案為雜交瘤細胞系3.25.12 (DSM ACC2799)、 3.29.15 (DSM ACC2800 ) 、 4.38.30 (DSM ACC2801 ) 、 7.57.41 (DSM ACC2802) 、 7.72.32 (DSM ACC2803 )。
本發明的另一方面是用于根據本發明的方法的抗體組合物，包含由細 胞系DSM ACC2799、細胞系DSM ACC2800、細胞系DSM ACC2801、 細胞系DSM ACC 2802和/或細胞系DSM ACC2803生產的抗體的混合物。
發明詳述
本發明提供了與食蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體。 根據本發明，術語"藥物抗體，，表示能夠對個體施用以治療疾病的抗 體。在根據本發明進行的一種測定法中，藥物抗體和捕獲抗體，或藥物抗 體和示蹤抗體，分別包含"相同的"抗體分子，例如用相同的表達載體重 組生產，并包含相同的M酸序列。藥物抗體(治療性單克隆抗體)廣泛 應用于治療多種疾病如腫瘤疾病(例如血液和實體惡性肺瘤，包括非霍奇 金淋巴瘤、乳腺癌和結直腸癌)、免疫性疾病、中樞神經疾病、血管疾病
7或傳染病。例如在Levene, A.P.等人，Journal of the Royal Society of Medicine 98 (2005) 145-152對這樣的抗體有所描述。這樣的抗體為例如針 對CD20、 CD22、 HLA-DR、 CD33、 CD52、 EGFR、 G250、 GD3、 HER2、 PSMA、 CD56、 VEGF、 VEGF2、 CEA、 Levis Y抗原、IL-6受體或IGF-1 受體的抗體。治療性抗體在Groner, B.等人，Curr. Mol. Meth. 4 (2004) 539-547; Harris, M.， Lancet Oncol. (2004) 292-302中也有所描述。
治療性/藥物抗體的實例(優選單克隆抗體)為針對IL-6受體的抗體 (mAb IL畫6R)。這樣的抗體在例如Mihara， M.等人，Clin. Immunol. 98 (2001)319-326; Nishimoto， N.等人，Blood 106 (2005) 2627-2632;臨床實 驗NCT00046774; WO 2004/096274中有所描述。
治療性/藥物抗體的實例(優選單克隆)為針對IGF-1受體的抗體(mAb IGF-1R)。這樣的抗體在例如WO 2004/087756， WO 2005/005635中有所 描述。
"抗藥物抗體，，為抗體，其可以針對藥物抗體的任何區域，例如藥物 抗體的可變結構域、恒定結構域或糖結構。這樣的抗藥物抗體可能在抗體 治療過程中作為患者的免疫原性反應出現(見Pan， Y.等人，FASEB丄9 (1995)43-49)。多數"抗藥物抗體"與藥物抗體的一個或多個互補決定區 結合。抗藥物抗體與其藥物抗體的抗原之間的親和力通常低于藥物抗體與 其靶抗原的親和力。
"抗食蟹猴IgG抗體"為與食蟹猴IgG (食蟹猴免疫球蛋白G)特異 性結合的抗體，優選為單克隆抗體(即單克隆抗食蟹猴抗體，mAb<Cyno IgG>)。這樣的抗體與食蟹猴IgG結合的解離常數(-KDiss.)為至少l(T9 moI/L，更優選KDiss.為少l(r1G mol/L。同時，通過l(T8 mol/L或更差的 KDiss.例如l(T5 mol/L確保其不與人IgG結合的性質。同樣優選地，與食 蟹猴IgG結合、不與人IgG結合的抗體，分別對食蟹猴IgG和人IgG的 反應性之間KDiss.的差異為至少100倍。
優選抗食蟹猴IgG抗體還與絨猴IgG、恒河猴IgG和狒狒IgG結合， 解離常數(=KDiss.)為至少l(r8mol/l,優選為l(T9 mol/L,更優選KDiss.
8為至少10"Q mol/L。
在一個實施方案中，根據本發明的抗體為單克隆抗體。在本申請中使 用的術語"單克隆"表示由單種細胞或其子代生產的抗體群，并且與其乾
抗原的單個抗原決定簇結合。在本申請中使用的術語"不與人IgG結合，， 或其等同語法用語表示不與人IgG特異性結合的抗體，即其KDiss.為10-7 mol/L或更差，例如10-5mol/L。這不包括食蟹猴這樣的多克隆抗體群，其 已與人免疫球蛋白交叉吸附以除去與人IgG結合的食蟹猴IgG。由于此過 程中形成的結合平衡，交叉吸附不提供不與人IgG結合的多克隆抗體群， 更不必說單克隆抗體。因為此平衡下許多與人IgG結合的抗體不交叉吸附， 而留在溶液中，于是留在得到的抗體制品中。因此，免疫球蛋白一旦與人 IgG交叉吸附，不會完全排除任何抗人IgG的結合，而仍然顯示人IgG結 合。
本發明的其它方面為細胞系DSMACC2799、細胞系DSMACC2800、 細胞系DSMACC2801、細胞系DSMACC2802、細胞系DSMACC2803， 以及由細胞系DSMACC2799、或細胞系DSM ACC2800、或細胞系DSM ACC2801、或細胞系DSMACC2802、或細胞系DSM ACC2803生產的單 克隆抗體。本發明的另一方面為抗體組合物，包含由細胞系DSM ACC2799、細胞系DSM ACC2800、細胞系DSM ACC2801、細胞系DSM ACC 2802和/或細胞系DSM ACC2803生產的抗體的混合物。本發明還包 含組合物，其包含由細胞系DSM ACC2799、或細胞系DSM ACC2800、 或細胞系DSM ACC2801、或細胞系DSM ACC 2802、或細胞系DSM ACC2803生產的抗體。
使用根據本發明的抗體，能夠最小化或甚至排除個體人血清的背景變化。
根據本發明，術語"猴"指食蟹猴、絨猴、恒河猴和狒狒。"猴"優 選表示食蟹猴、恒河猴和狒狒。
優選抗人Ig抗體(Ig表示免疫球蛋白)為這樣的抗體，其與不存在 于食蟹猴免疫球蛋白上的表位特異性結合，在WO 2006/066912中對此有
9所描述。此表位的特征在于其與MAB<H-Fcy pan>M-R10Z8E9,也稱 MAB<h-Fcgamma>M-R10Z8E9,或簡稱MAB M-R10Z8E9結合。在根據 本發明的優選實施方案中，抗人Ig抗體進一步的特征在于，其結合的表位 與MAB M-R10Z8E9相同。MAB M-R10Z8E9由這樣的細胞系生產，該 細胞系于2004年12月22日保藏于德國微生物保藏中心(DSMZ),保藏 號為DSM ACC2708。優選抗人Ig抗體包含MAB M-R10Z8E9的可變重 鏈和輕鏈結構域。更優選抗人Ig抗體包含MAB M-R10Z8E9可變重鏈和 輕鏈結構域的CDR區和非人框架。優選抗人Ig抗體為單克隆抗體(抗人 Ig mAb )。
優選用BIAcore 儀器評估抗體的結合性質，特別是KDiss.。在此方 法中，通過表面等離子體共振(SPR)的變化評價結合性質。可方便地將 所研究的抗體結合到固相(稱為芯片)上，并評估單克隆抗體、多克隆抗 體、或甚至包含IgG的血清與此包被的芯片的結合。
根據本發明，用于免疫測定法的固相支持物在本領域現有技術中有廣 泛描述(見例如Butler， J.E., Methods 22 (2000) 4-23 )。
例如Hage， D.S.,于Anal. Chem. 71 (1999) 294R-304R中描述了不同 免疫測定法的原理。Lu， B.等人，于Analyst. 121 (1996) 29R-32R中報道 了抗體的定向固定，以用于免疫測定法。例如Wilchek， M.和Bayer， E.A., Methods Enzymol. 184 (1990) 467-469報道了抗生物素蛋白-生物素介導的 免疫測定法。
本發明中使用的術語"雙抗原橋聯免疫測定法"表示夾心型免疫測定 法，其中抗原與兩種不同抗體結合，其各自與抗原中不相重疊或干擾的不 同表位結合。在此測定法中，形成包含捕獲抗體、抗原和示蹤抗體的夾心 體，抗原由此將與之結合的兩種抗體橋聯起來。
作為蛋白質，單克隆抗體和其恒定結構域包含許多反應性側鏈與結合 配偶體偶聯，結合配偶體如表面、蛋白質、聚合物(例如PEG)、纖維素、 或聚苯乙烯、酶、或結合對的成員。抗體的化學反應基團為例如，氨基(賴 氨酸的s-氨基、a-氨基)、硫醇基(胱氨酸、半胱氨酸、曱硫氨酸)、羧
10酸基(天冬氨酸、谷氨酸)和糖醇基。例如Aslam， M.和Dent， A，， Bioconjuation，麥考林出版公司(MacMillan Ref. Ltd.) (1999) ， 50-100 頁，對這樣的方法有所描述。
術語"樣品"包括來自猴的任意量的物質。這樣的物質包括但不限于來 自這樣的個體的全血、血清或血漿，這些是在臨床前例程中最廣泛使用的 樣品來源。
術語"固相"指非流體物質，包括顆粒(包括微粒和珠子)，其由如 諸如聚合物、金屬(順磁、鐵磁性顆粒)、玻璃和陶瓷等材料制成；凝膠 物質如硅膠、氧化鋁和聚合物凝膠；毛細管，其可以由聚合物、金屬、玻 璃和/或陶瓷制成；沸石和其它多孔物質；電極；微孔板；固體檢測條(strip); 比色亞、管或其它分光計樣品容器。測定法中的固相元件與測定法中可能 接觸到的惰性固體表面的不同之處在于，"固相"元件表面包含至少一個預 期與捕獲抗體相互作用的部分。固相可以是固定元件，如管、條、比色皿 或微孔板，或可以是不固定的元件，如珠子和孩M立。孩m還可以作為固相 用于勻相測定法形式。可以使用允許蛋白質和其它物質非共價或共價附著 的多種微粒。這樣的顆粒包括聚合物顆粒如聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲 酯；金顆粒如金納米顆粒和金溶膠；和陶瓷顆粒如硅膠、玻璃和金屬氧化 物顆粒。見伊J:ft口 Martin, C.R.等人，Analytical Chemistry-News & Features 70 (1998) 322A-327A,其通過引用并入本文。
可檢測的標記的實例為色原(熒光或發光基團和染料)、酶、NMR-活性基團或金屬顆粒、半抗原，例如洋地黃毒苷。可檢測的標記還可以是 光活化交聯基團，例如疊氮基或吖丙啶基(azirine)。可以用電化學發光檢 測的金屬螯合物也是優選的信號發射基團，特別優選釕螯合物，例如釕(聯 吡p定):;2+螯合物。例如EP 0 580 979、 WO 90/05301、 WO 90/11511和WO 92/14138中描述了適合的釕標記基團。
免疫測定法為技術人員所熟知。相關的教科書中總結了實施這樣的測 定法的方法，以及實際用途和操作。相關教科書的實例有Tijssen， P., Preparation of enzyme-antibody or other enzyme-macromolecule
iiconjugates, 于Practice and theory of enzyme immunoassay, Burdon, R，H.和v. Knippenberg， P，H.(編)，愛思唯爾公司(Elsevier)，阿姆斯 特丹(19卯)221-278頁；Colowick， S.P.和Caplan, N.O.(編)，"Methods inEnzymology",學術出版社，中涉及免疫檢測方法的多巻，特別是巻70、 73、 74、 84、 92和121。
根據本發明的抗體可以由雜交瘤細胞系3.25.12 (DSM ACC2799)、 3.29.15 (DSM ACC2800 ) 、 4.38.30 (DSM ACC2801 ) 、 7.57.41 (DSM ACC2802) 、 7.72.32 (DSM ACC2803 )生產，這些雜交瘤細胞系本身也是 本發明的一方面。根據本發明的其它抗體，即與食蟹猴IgG特異性結合、 不與人IgG結合的抗體，可以用例如實施例3中概述的方法得到。
可選地，例如可以使用這樣的方法，其中第一步先用竟爭試驗系統測 定與同一耙抗原結合的兩種抗體的表位重疊。為此目的，例如借助酶免疫
測定法，測試所研究的抗體與已知抗體竟爭結合固定化靶抗原的程度，例 如根據本發明的細胞系生產的抗體的竟爭結合程度。為此目的，將適當地 固定化的靶抗原與標記形.式的已知抗體和過量所研究的抗體進行孵育。通 過測定在所研究的抗體存在和不存在的情況下，標記形式的抗體結合的量， 能夠評估所研究的抗體能夠置換已知抗體的結合的程度。如果在同樣的濃 度置換多于20%，優選多于30%;或者所研究的抗體在更高的濃度，優選 103-105倍過量于已知抗體時，如果置換多于70%，優選多于80%，則為 發生表位重疊，兩種抗體均與同一表位的相同或重疊部分結合。在所述方 法的第二步中使用這樣鑒定的抗體。此時測定第一步中鑒定的抗體與人 IgG的結合。可以用例如ELISA、免疫測定法或用表面等離子體共振進行 這樣的測定。如果測定其不與人IgG結合，則定義這樣的抗體為與食蟹猴 IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體。可選地，才艮據本發明的抗體可 以通過分別測定其對于食蟹猴IgG和人IgG的KDiss.并對比這些數值而得 到鑒定。
本發明報道了測定藥物抗體和抗藥物抗體的復合物的免疫測定方法， 所述復合物在下文中表示為DA/ADA復合物。更詳細地，本發明包含用夾
12心型免疫測定法對猴種樣品中藥物抗體(DA )和針對所述藥物抗體的抗體 (抗藥物抗體，ADA)的免疫復合物(DA/ADA復合物)進行免疫測定的 方法，該方法包含捕獲抗體和示蹤抗體，其中所述抗體之一為與食蟹猴IgG 特異性結合、優選不與人IgG結合的抗體，另一所述抗體為與人IgG特異 性結合、優選不與食蟹猴IgG結合的抗體。在一個實施方案中，捕獲抗體 為與人IgG特異性結合、不與食蟹猴IgG結合的抗體，示蹤抗體為與食蟹 猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體。在不同的實施方案中，捕獲 抗體為與食蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體，示蹤抗體為與 人IgG特異性結合、不與食蟹猴IgG結合的抗體。本發明的另一實施方案 中，與食蟹猴IgG特異性結合的抗體和/或與人IgG特異性結合的抗體為 單克隆抗體。
在本方法的優選實施方案中，樣品與預定量的藥物抗體預孵育。這4吏 得無論樣品中是否存在藥物抗體，均可檢測抗藥物抗體，因為本方法檢測 的是DA/ADA復合物(見例如圖5和6 )。
根據人或人源化藥物抗體和食蟹猴IgG之間的高度同一性，藥物抗體 的主要抗原決定簇為其互補決定區。抗藥物抗體優選識別這些抗原決定簇。 于是，多數抗藥物抗體識別相應藥物抗體的互補決定區、并從而與之結合。 抗藥物抗體-藥物抗體復合物的形成屏蔽抗原表位，從而對抗夾心測定法中 對所述復合物的測定。
例如如在WO 2006/066912中所描述的那樣，抗人IgG抗體是與這樣 的表位特異性結合的抗體，所述表位不存在于從食蟹猴中得到的免疫球蛋 白上。在優選實施方案中，抗人IgG抗體的進一步特征在于，其與由細胞 系DSM ACC 2708生產的抗體結合的表位相同，也就是與這樣的表位結 合，所a位存在于G類人免疫球蛋白的所有亞類中，而除了存在于黑猩 猩的IgG上，在多數實驗動物的免疫球蛋白上都不存在。在其它優選實施 方案中，抗人IgG抗體是由細胞系DSMACC2708生產的抗體。
令人吃驚地發現，使用根據本發明的方法防止了對于抗藥物抗體的不 完全檢測。例如，如果捕獲分子和抗藥物抗體結合相同的抗原決定簇，即
13藥物抗體的CDR，則藥物抗體與捕獲分子的結合會封閉這些表位，即將它 們相對于抗藥物抗體屏^來，從而阻止了抗藥物抗體的結合和被檢測到。 這導致對樣品中的抗藥物抗體的不完全檢測。抗藥物抗體通常對于藥物抗 體具有低結合親和力，因此結合藥物抗體需要抗藥物抗體的兩個抗原結合 區的合作。于是，不能與捕獲分子結合也可能導致對抗藥物抗體的低檢測。 因此，通過抗藥物抗體的CDR進行捕獲不適合用于測定。
因此，本發明的一方面是用包含捕獲抗體和示蹤抗體的夾心免疫測定 法對猴種樣品中藥物抗體(DA)和針對所述藥物抗體的抗體(抗藥物抗體， ADA)的免疫復合物(DA/ADA復合物)進行免疫測定的方法，其中所述 抗體之一為與食蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體，另一抗體 為與人IgG特異性結合、不與食蟹猴IgG結合的抗體。在此方面的一個實 施方案中，與食蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體由細胞系
DSMACC2803生產。在此方面的另 一實施方案中，與人IgG特異性結合、 不與食蟹猴IgG結合的抗體由細胞系DSMACC2708生產。
在本方法的一個實施方案中，形成的復合物的量與DA/ADA復合物、 DA和/或ADA的濃度相關聯。
在另一實施方案中，捕獲抗體與抗藥物抗體或DA/ADA復合物結合， 不與抗藥物抗體的CDR、或在序列上或幾何結構上與CDR緊鄰的框架區 結合。
本發明的另一方面是用包含捕獲抗體和示蹤抗體的夾心免疫測定法對 猴種樣品中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)進行免疫測定的方 法，其中捕獲抗體為與食蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體， 示蹤抗體為藥物抗體。還有一方面是用包含捕獲抗體和示蹤抗體的夾心免 疫測定法對猴種樣品中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)進行免 疫測定的方法，其中示蹤抗體為與食蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結 合的抗體，捕獲抗體為藥物抗體。
才艮據本發明的優選雜交瘤細胞系3.25.12、 3.29.15、 4.38.30、 7.57.41、
14和7.72.32依據國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約保藏于 德國微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ):
克隆保藏號保藏日
3.25.12DSM ACC27992006.08.24
3.29.15DSM ACC28002006.08.24
4.38.30DSM ACC28012006.08.24
7.57.41DSM ACC28022006.08.24
7.72.32DSM ACC28032006.08.24
MAB M-R10Z8E9DSM ACC270822.12.2004
由所述細胞系可得的抗體是本發明的實施方案。
提供下文的實施例和附圖以幫助對本發明的理解，本發明的真正范圍 由隨附的權利要求書闡明。應理解在不偏離本發明精神的情況下可以對列 出的方法l故出i奮改。
圖1:檢測DA/ADA復合物的測定法——不加入DA。 將生物素化的抗人Ig抗體固定到抗生蛋白鏈菌素包被的微孔板 (SA-MTP)上。藥物抗體/抗藥物抗體(DA/ADA)復合物被固定化抗人 Ig抗體(Bi;生物素化的)所捕獲。用洋地黃毒苷標記的(Dig;洋地黃 毒苷化的)抗食蟹猴IgG抗體和抗洋地黃毒苷抗體辣根過氧化物酶(POD ) 綴合物(多克隆抗DIG抗體與POD綴合，pAb<Dig>POD)檢測結合的 DA/ADA復合物。用與食蟹猴IgG化學綴合的人IgG作為標準。 圖2:檢測DA/ADA復合物的測定法——加入DA。 在樣品分析之前，用基于PBS的緩沖液稀釋猴血清樣品，摻加藥物抗 體。15分鐘預孵育之后，用上述ELISA分析樣品(見圖l的說明)。
15圖3:用抗食蟹猴抗體檢測ADA的測定法。
將生物素化的藥物抗體與抗生蛋白鏈菌素包被的微孔板(SA-MTP) 結合(Bi;生物素化的)。抗藥物抗體(ADA)與固定化藥物抗體結合。 用洋地黃毒苷標記的(Dig;洋地黃毒苷化的)抗食蟹猴IgG抗體和抗洋 地黃毒苷抗體辣根過氧化物酶綴合物(pAb<Dig>POD )檢測結合的ADA。 用與食蟹猴IgG化學綴合的抗人IgG抗體作為標準。
圖4: DA/ADA復合物測定法的標準曲線。
用含有1% (v-/v)食蟹猴血清的基于PBS的緩沖液稀釋與食蟹猴IgG化 學綴合的人IgG，圖中給出了其在多個濃度下的光密度(OD)。
圖5:在食蟹猴中進行HuMalXlGF-lR〉單劑量藥物動力學研究(3 mg/kg;靜脈注射)，檢測該研究樣品中的DA/ADA復合物。
在給藥后0 h和1176 h之間的8個時間點，收集血清樣品，用ELISA 分析(如圖1所示)，不加入藥物抗體。將DA/ADA復合物的量(405 nm 的OD信號)相對于給藥后的時間作圖。
圖6:在食蟹猴中進行HuMab〈IGF-lR〉單劑量藥物動力學研究(3 mg/kg;靜脈注射)，檢測該研究樣品中的DA/ADA復合物。
在給藥后0 h和1176 h之間的8個時間點，收集血清樣品，用ELISA 分析(如圖2所示)，加入藥物抗體。將DA/ADA復合物的量(405 nm 的OD信號)相對于給藥后的時間作圖。
圖7:單克隆抗食蟹猴IgG和多克隆食蟹猴IgG對于食蟹猴IgG檢測 的對比。
用含有1% (v/v)食蟹猴血清的基于PBS的緩沖液稀釋與食蟹猴IgG化 學綴合的人IgG，圖中給出了其在多個濃度下的光密度(信號(中位值))。
實施例 實施例1
制*蟹猴IgG和食蟹猴Fc片斷 a)制^蟹猴IgG
16食蟹猴血清經Aerosil 380脫脂，用硫酸銨(ad 2.0 M )沉淀。將沉淀 在磷酸鹽緩沖液均質化，以磷酸鹽緩沖液，pH7.0透析。用DEAE離子交 換色譜在pH 7.0分離混合物，通過凝膠過濾濃縮純化流出液中的IgG。
b)制備食蟹猴Fc
在15 mM半胱氨酸存在下，在37°C ， pH 7.0用木瓜蛋白酶(4 mU木 瓜蛋白* mg IgG )將a)中純化的IgG片斷化。80分鐘后，將混合物與 碘乙酰胺(ad 30 mM)在25。C酵育，隨后以含30 mM NaCi， pH 7.5的 10 mM HEPES緩沖液透析。用Q-瓊脂糖離子交換色i普分離混合物。Fab 級分在流出液中，用濃度達l M氯化鈉的鹽梯度洗脫Fc級分。最后，將 Fc級分以磷酸鹽緩沖液透析，通過凝膠過濾純化。
實施例2
產生單克隆抗食蟹猴IgG抗體
a) 免疫小鼠
用100照食蟹猴IgG (食蟹猴免疫球蛋白G)或與CFA (弗氏完全 佐劑)混合的食蟹猴Fc，對8-12周齡的雌性Balb/c或NMRI小鼠分別進 行^M內初次免疫。在4、 7和10周后，每只小鼠用100ng與IFA(弗氏 不完全佐劑)混合的食蟹猴IgG再進行三次腹膜內免疫步驟。然后在融合 前三天，各用100網處于PBS(磷酸緩沖鹽溶液；加入抗組胺和腎上腺素) 中的食蟹猴IgG進行靜脈內加強免疫。
b) 融合和克隆
才艮據Galfr" G.和Milstein， C.， Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46將 按照a)免疫的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合。將約lxl()8脾細胞與約 2xl()7骨髓瘤細胞(P3x63-Ag8.653， ATCC CRL1580 )混合，離心(10分 鐘，300xg， 4'C)。之后用無FCS (胎牛血清)的RPMI 1640培養基洗 涂細胞一次，在50 mL尖底管中以400xg再次離心。此后，加入1 mL PEG
17(聚乙二醇，分子量4,000 g/mol)，通過吸液進行混合。在37C水浴1分 鐘后，逐滴加入5 mL無FCS的RPMI 1640,混合懸液，用含10% (v/v) FCS 的RPMI 1640加滿至50 mL，然后離心。沉淀的細胞用含10%FCS的RPMI 1640重懸，在含生長因子白介素6 (IL-6， 100U/mL)的次黃噤呤-重氮絲 氨酸選擇培養基(100 mmol/L次黃嘌呤，1 jig/mL重氮絲氨酸，處于含 10%FCS的RPMI 1640中)中鋪板。約10天之后，測定原代培養物的特 定抗體合成(參見實施例3)。將顯示與食蟹猴IgG結合、且不與人正常 IgG交叉反應的原代培養物用流式細胞儀(FACSAria, BD生物科學公司
(BD Biosciences ))通過單細胞沉積至96孔細胞培養板內而進行個體化， 培養基中含生長因子白介素6 (100U/mL)。依照此實驗方案產生保藏的 克隆(表l)。用于本發明的細胞系保藏在德國微生物保藏中心(DSMZ)
(表l)。
表l:
抗食蟹猴mAb克隆
克隆IgG類和亞類免疫原保藏號保藏日
3.25.12IgGl, kIgGDSM ACC27992006.08.24
3.29.15IgGl， kIgGDSM ACC28002006.08.24
4.38.30IgGl, kIgGDSM ACC28012006.08.24
7.57.41IgG2a, kFcDSM ACC28022006.08.24
7.72.32IgGl， kFcDSM ACC28032006.08.24
c)由細胞培養物上清生產免疫球蛋白
產生的雜交瘤細胞系以1.0xl()s到2.2xl()s個細胞每mL (取決于個體 細胞系)的初始細胞密度(活細胞)在補加10% FCS的RPMI 1640培養 基中接種，用攪拌技術擴增9到16天(取決于個體細胞系)的時間。在收 獲的培養物上清中，單克隆抗體濃度達到每mL36到61 ng。培養物上清 得到的抗體的純化根據標準蛋白質化學方法例如根據Bruck, C.等人，
18Methods Enzymol. 121 (1986) 587- 596進行。
實施例3
檢測抗食蟹猴IgG抗體的篩選法
a) 初步篩選與食蟹猴IgG優先結合的抗體
為測定雜交瘤細胞培養物上清中抗體的特異性，將重組抗生蛋白鏈菌 素(MicroCoat, Bernried公司，批次MC 1098 )預包被的MTP (微孑L板) 分別用處于補加1.0% (w/v) BSA II的PBS中的生物素化的食蟹猴IgG， 250 ng/mL或生物素化的人IgG， 250 ng/mL進行包被(100 每孔，室 溫孵育60分鐘，伴隨振蕩)，之后用0.9% (w/v) NaCl/0.05%Tween 20 洗滌三次。下一步，每孔加入100nL待測的抗體溶液(培養物上清)，室 溫賻育60分鐘，伴隨振蕩。經過用0.9% (w/v) NaCl/0.05%Tween 20洗 滌三次的步驟之后，每孔加入100 辣根過氧化物酶標記的多克隆綿羊抗 小鼠Fcy抗體的F(ab，)2片斷，以檢測結合的樣品抗體，室溫孵育60分鐘， 伴隨振蕩。隨后，按上文進行洗滌。最后，每孔加入100 ABTS (德國 羅氏診斷產品有限公司(Roche Diagnostics GmbH ),目錄號1684302 )。 室溫孵育30分鐘后，在商用微孔板ELISA讀板器中測量405和492 nm [405/492]處的消光(OD )。此篩選選出與食蟹猴IgG很好結合且對人IgG 顯示無/低交叉反應性的抗體。選出的抗體繼續進行步驟b)的測定。
b) 篩選對人IgG沒有可檢測的交叉反應性的抗體
為了從初步篩選a)中選出的抗體中鑒定出對人IgG顯示沒有可檢測的 交叉反應性的抗體，進行下文描述的測定法。將重組抗生蛋白鏈菌素 (MicroCoat, Bernried 7>司，批次MC 1098 )預包^皮的MTP用處于含 1.0% BSA II的PBS (磷酸緩沖鹽溶液)中的生物素化的食蟹猴IgG, 250 ng/mL進行包被(100 jiL每孔，室溫孵育60分鐘，伴隨振蕩)，隨后用 0.9% (w/v) NaCl/0.05%Tween 20洗滌三次。下一步，分別加入每孔100 fiL 待測的抗體溶液(培養物上清)，和50 nL PBS (參照信號)，或50 jiL
19人IgG溶液(80 mg/mL;測定法中的終濃度27 mg/mL;測定信號)， 室溫孵育60分鐘，伴隨振蕩。經過用0.9% (w/v) NaCl/0.05°/。Tween 20 洗滌三次的步驟之后，每孔加入100 fiL辣根過氧化物酶標記的多克隆綿羊 抗小鼠Fc7抗體的F(ab，)2片斷，以檢測結合的樣品抗體，室溫孵育60分 鐘，伴隨振蕩。隨后，按上文進行洗滌。最后，每孔加入100nLABTS⑧(德 國羅氏診斷產品有限公司，目錄號1684302 )。室溫孵育30分鐘后，在商 用微孔板ELISA讀板器中測量[405/492] nm處的消光。選擇測定信號顯示 與相關的參照信號沒有顯著差異的抗體作進一步用途。以量化角度而言， 這等于與人IgG的交叉反應性估計為<0.001 %。
("沒有顯著差異"的定義測定信號=參照信號的卯-110%。)
實施例4
制務資蟹猴IgG (Cyno-IgG)和人IgG ( H-IgG )的綴合物
a) 制備Cyno畫IgG-SATP
從食蟹猴血清中通過離子交換色譜法和凝膠過濾純化的食蟹猴IgG以 30 mM磷酸鉀緩沖液，pH 7.1透析，調整得到的蛋白質溶液至蛋白質濃 度為約10 mg/ml。將N-琥珀酰亞胺-3-乙酰硫代丙酸酯(SATP )溶于 DMSO，以1:5 (IgG:SATP)的摩爾比加入抗體溶液中。混合物在25。C， pH 7.1孵育60分鐘。通過加入L-賴氨酸至終濃度為10 mM停止反應，將 pH調整為pH6.1，以含200mMNaCl和1 mMEDTA， pH 6.1的10 mM 磷酸鉀緩沖液進行透析，除去過量的SATP。
b) 制備H-IgG-MH
從人血清中通過離子交換色i普法純化的人IgG以30 mM礴酸鉀緩沖 液，pH7.1透析，調整得到的蛋白質溶液至蛋白質濃度為約20mg/ml。將 馬來酰亞胺己酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Maleimidohexanoyl-N-hydroxysuccinimideester，MHS)溶于DMSO，以1:6 (IgG:MHS )的摩 爾比加入抗體溶液中。混合物在25。C， pH7.1孵育60分鐘。通過加入L-
20賴氨酸至終濃度為10 mM停止反應，將pH調整為pH 6.1 ，以含200 mM NaCl和1 mM EDTA, pH 6.1的10 mM鱗酸鉀緩沖液進行透析，除去過 量的MHS。
c)綴合Cyno-IgG畫SATP和H畫IgG畫MH
加入2.5% (v/v) 1 M羥胺溶液，pH 7.5,在25。C孵育60分鐘，將 Cyno-IgG-SATP去乙酰化為Cyno-IgG-SH。去乙酰化的抗體與H-IgG-MH 混合(Cyno-IgG-SH:H-IgG-MH的摩爾比=1:1)至總IgG的終濃度為約7 mg/ml。將pH調整為7.1，在25'C孵育混合物。用分析性凝膠過濾柱(例 如TSK3000)分析綴合過程。 一般而言，在40分鐘后通過加入半胱氨酸 至終濃度為2 mM停止綴合過程。孵育30分鐘后，加入N-甲基馬來酰亞 胺(NMM)至終濃度為5 mM，將pH調整為7.5。在25。C賻育60分鐘后， 用丙烯葡聚糖凝膠S-300通過凝膠過濾色鐠法分離綴合物，除去未綴合的 抗體。
實施例5
制備洋地黃毒苷化的單克隆抗食蟹猴Fc抗體
a) 制備單克隆抗食蟹猴Fc抗體
將單克隆抗食蟹猴Fc抗體的發酵上清濃縮約10倍，移至含20 mM TRIS， 1M硫酸銨，pH9.0的緩沖液，上樣至蛋白A-瓊脂糖柱。將用0.2 M檸檬酸鈉，pH3.0洗脫的洗脫液以磷酸鹽緩沖液，pH7.5進行透析。通 過用針對牛IgG的固定化抗體進行免疫吸附分離牛IgG污染物(來自發酵 液中的FCS)。
b) 單克隆抗食蟹猴Fc抗體的洋地黃毒苷化
將處于磷酸鹽緩沖液中的單克隆抗食蟹猴Fc抗體溶液調整為pH 8.1 ， 濃度為約2 mg/ml。將洋地黃毒苷-3-0-曱基羰基-s-氨基己酸-N-羥基琥珀酰 亞胺酯溶于DMSO，以1:5的摩爾比加入抗體溶液中。60分鐘后通iti口入
21L-賴氨酸停止反應，以含150mMNaCl， pH 7.5的50 mM磷酸鉀緩沖液 透析除去過量的標記試劑。
實施例6
通過BIAcore⑧系統評估抗體的結合/特異性
所有的測量均用使用CM5芯片的81入。^@2000儀器進行。通過標準 胺偶聯實現抗體對芯片的包被。除非另有說明，所有的孵育步驟均于25。C 在HBS緩沖液(HEPES， NaCl， pH 7.4)中進行。將飽和量的不同單克 隆抗食蟹猴IgG抗體、MAB M-R10Z8E9和多克隆抗人Fcy抗體(Dianova 7〉司，德國)，通過胺偶聯分別固定在同一CM5芯片的不同槽(channel) 上。所有的動物血清均在含1 mg/ml羧曱基葡聚糖的HBS緩沖液中稀釋至 終濃度為1 %。通過注入1比100稀釋的血清并孵育60秒分析結合。通過 用HBS緩沖液洗滌芯片表面180秒測量解離。用BIAcore 的 BIAevaluation軟件，以1:1蘭米爾擬合才莫型(Langmuir fitting model)計 算解離常數值(=KDiss.)。對于所有動物血清，此計算都基于IgG水平 為15 mg/ml的假設。選擇開始注入測試抗體80秒后的信號值用于對比結 合的IgG的量(表2中的RU )。
表2:
動物血清與單克隆抗食蟹猴IgG抗體 和多克隆抗人Fcy抗血清的結合信號[RU
樣品(血清)抗食蟹猴mAb (克隆3.25.12)PAb<H-Fcy>
結合的RUKDiss. (mol/L)結合的RUKDiss. —1/L)
絨猴-31.4無結合5321.41xl008
狒狒2038.59.39xl0131404.66.37xlOn
大鼠-20.9無結合48.2無結合
黑猩猩-28.2無結合1918.13.72xl(K13
22食蟹猴2278.72.03xl(T091344.87.17xl012
恒河猴2362.85.09xl01Q1172.19.08xl011
NMRI小鼠-15.7無結合-23.8無結合
人-25.5無結合1571.64.56xl012
狗-35.9無結合564.31.15xl008
CD1小鼠-40.4無結合-30.7無結合
表2顯示單克隆抗食蟹猴IgG抗體不與人血清交叉反應。只檢測到了 其與食蟹猴、恒河猴和狒狒血清包含的IgG的結合。與單克隆抗食蟹猴IgG 抗體不同，多克隆抗人Fc抗體顯示與人、狗和所有測試猴種的血清的高 反應性。
實施例7
測定DA/ADA復合物——不加入DA
在第一步中，生物素化的MAB M-R10Z8E9結合至抗生蛋白鏈菌素包 被的微孔板(SA-MTP)的孔中。通過洗滌除去過量的未結合抗體。之后， 在孔中孵育猴血清樣品和參照標準(人IgG與摻加在1。/。食蟹猴血清中的 食蟹猴IgG化學綴合)。洗去未結合的物質之后，結合的DA/ADA復合 物用洋地黃毒苦化的抗食蟹猴抗體檢測，而后與辣根過氧化物酶標記的抗 洋地黃毒苷抗體進行孵育。抗體一酶綴合物催化ABTS⑧底物的顯色反應。 用ELISA讀板器在波長405nm處(參照波長490 nm ([405/490] nm )) 測量信號。以一式兩份測定各血清樣品的吸光值。圖l顯示例示此測試系 統的方案。
實施例8
測定DA/ADA復合物——加入DA
樣品分析之前，將猴血清樣品在基于PBS的緩沖液中稀釋，摻加藥物 抗體。15分鐘預孵育之后，通過上述ELISA分析樣品。圖2顯示例示此
23測試系統的方案。
實施例9
檢測食蟹猴藥物動力學研究樣品中的DA/ADA復合物
用針對IGF-1R (WO 2005/005635; 3 mg/kg; iv)的人抗體進行食蟹 猴血清樣品單劑量藥物動力學研究(PK=藥物動力學)，用上述ELISA 進行分析i)檢測DA/ADA復合物，不加入藥物抗體(圖5 )，和ii)檢 測DA/ADA復合物，加入藥物抗體(圖6 )。在給藥后0 h和1176 h之間 的8個時間點，收集血清樣品并分析。將DA/ADA復合物的量(405 nm 處的OD信號)相對于給藥后的時間作圖。如圖5所示，如果體內形成 AD/ADA復合物，而未經體外加入藥物抗體，則血清樣品中僅在336 h和 672 h之間(峰形)檢測到陽性信號。不存在抗藥物抗體的情況下，沒有 免疫復合物形成，檢測不到陽性信號(336h之前的時間點)。給藥后672 h或之后，由于樣品中不存在藥物，不能檢測到復合物。當在血清樣品中 加入藥物抗體作為預孵育步驟時，均能檢測到/可檢測到體內形成和體外形 成的DA/ADA復合物。如圖6所示，陽性信號僅依賴于ADA的產生。兩 幅圖(圖5和6)均與藥物一時間曲線4艮好地相關。
實施例10
用抗食蟹猴抗體進行ADA檢測的測定法
在第一步中，將生物素化的藥物抗體(針對IGF-1R的人抗體)結合 到抗生蛋白鏈菌素包被的微孔板(SA-MTP)的孔中。洗滌除去過量未結 合的抗體。之后，孵育猴血清樣品(在基于PBS的緩沖液中稀釋20倍) 和參照標準。洗去未結合的物質之后，用洋地黃毒苷化的抗食蟹猴抗體檢 測結合的抗藥物抗體(ADA)，而后用辣根過氧化物酶標記的抗洋地黃毒 苷抗體孵育。抗體一酶綴合物催化入818@底物的顯色反應。用ELISA讀 板器測量波長405 nm處的信號(參照波長4卯nm )。以一式三份測定 各血清樣品的吸光值。圖3顯示例示此測試系統的方案。
24實施例11制備針對食蟹猴IgG的多克隆抗體a) 從兔血清中純化多克隆抗體根據標準方法，已經用食蟹猴Fc對兔進行免疫。對于來自五只用食 蟹猴Fc免疫的兔的原始血清，用Aerosil (1.5% (w/v))脫脂除去其中的脂成 分，用硫酸銨(1.7M)沉淀免疫球蛋白。經酸處理(30min.， pH 5.5 )并 以補加50 mM NaCl， pH 7.0的15 mM磷酸鉀緩沖液透析之后，用DEAE 離子交換色譜法于pH 7.0分離混合物，將流出液中的IgG級分(=兔多 克隆抗食蟹猴IgG抗體)濃縮至約25mg/ml。b) 制備親和純化的多克隆兔抗食蟹猴IgG抗體(pAb<Cyno-IgG>)，其 對人IgG沒有交叉反應性將步驟a)的濃縮IgG級分移至補加150 mM NaCl， pH 7.5的50 mM 磷酸鉀緩沖液系統(PBS)。用現有技術將食蟹猴IgG與NHS瓊脂糖綴 合，制備得到具有固定化食蟹猴IgG的免疫吸附劑，填充到柱中，用補加 150 mM NaCl pH 7.5的50 mM礴酸鉀緩沖液平衡。將10 mg IgG/ml免疫吸附劑上樣至用PBS平衡的柱中。依次用PBS、 補加0.05% (w/v) Tween 20的0.5 M NaCl和30 mM NaCl洗柱。用3 mM HC1和1 M丙酸洗脫與親和基質特異性結合的IgG,以PBS透析。為除去對人IgG具有交叉反應性的抗體，將親和純化的抗體上祥至具 有固定化人IgG的親和柱中，該親和柱為用現有技術將非特異性人IgG與 NHS瓊脂糖綴合制備而得。用PBS平衡柱。將約6 mg IgG/ml免疫吸附劑 上樣至柱中。特異性多克隆IgG級分在流出液中。用補加0.05% (w/v) Tween 20的0.5 M NaCl、 30 mM NaCl、 1 M丙酸和PBS令柱再生后， 重復進行兩次對于非特異性結合的IgG的免疫吸附，以完全除去對人IgG 具有交叉反應性的抗體。將得到的對人IgG不具有交叉反應性的純化多克隆抗食蟹猴IgG抗體25濃縮至約4mg/ml，儲存于-80'C。 實施例12用BIAcore⑧系統評估多克隆兔抗食蟹猴Fc抗體(pAb<Cyno-Fc> )的抗體 結合/特異性全部的測量均用使用CM5芯片的BIAcore 2000儀器進行。通過標準 胺偶聯實現抗體對此芯片的包被。除非另有說明，所有的孵育均在HBS 緩沖液(HEPES， NaCl， pH 7.4)中在25。C進行。將飽和量的多克隆抗 食蟹猴IgG抗體通過胺偶聯固定在CM5芯片。所有的動物血清均在含1 mg/ml羧甲基葡聚糖的HBS緩沖液中稀釋至終濃度為1 %。通過注入1 比100稀釋的血清并孵育60秒分析結合。通過用HBS緩沖液洗滌芯片表 面180秒測量解離。用BIAcore⑧的BIAevaluation軟件，以1:1蘭米爾擬 合模型計算解離常數值(-KDiss.)。對于所有動物血清，此計算都基于IgG 水平為15 mg/ml的假設。選擇開始注入測試抗體80秒后的信號值用于對 比結合的IgG的量(表3中的RU)表3:動物血清與多克隆抗食蟹猴IgG抗體的結合信號[RU樣品(血清)抗食蟹猴pAb結合的RUKDiss. (mol/L)絨猴50.81.80xl007狒狒1297.44.11xl010大鼠-12.4無結合黑猩猩3,8無結合食蟹猴1357.91.92xl009恒河猴1244.62.16xl009NMRI小鼠42.14.27xl(T0626樣品(血清)抗食蟹猴pAb人-6.7無結合狗-10無結合CD1小鼠-15.9無結合表3顯示多克隆抗食蟹猴IgG抗體不與人血清交叉反應。只檢測到了 其與絨猴、食蟹猴、恒河猴和狒狒血清包含的猴IgG的結合。與單克隆抗 食蟹猴IgG抗體不同，多克隆抗食蟹猴IgG抗體顯示與NMRI小鼠血清 的反應性。而且多克隆抗食蟹猴IgG抗體不與人IgG結合，且與猴IgG和 小鼠IgG之間的反應性的差異至少為100倍。
權利要求
1. 與食蟹猴IgG特異性結合的抗體，特征在于其不與人IgG結合，且為單克隆抗體。
2. 單克隆抗體，其由細胞系DSM ACC2799、或細胞系DSM ACC2800、或細胞系DSM ACC2801、或細胞系DSM ACC2802、或細胞 系DSM ACC2803生產。
3. 用包含捕獲抗體和示蹤抗體的雙抗原橋聯免疫測定法對猴種樣品 中藥物抗體(DA)和針對所述藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)的 免疫復合物(DA/ADA復合物)進行免疫測定的方法，特征在于所述抗體 之一是與食蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體，另一抗體是與 人免疫球蛋白特異性結合的抗體。
4. 權利要求3所述的方法，特征在于捕獲抗體為與人IgG特異性結合 的抗體，示蹤抗體為與食蟹猴IgG特異性結合、不與人免疫球蛋白結合的 抗體。
5. 權利要求3所述的方法，特征在于捕獲抗體為與食蟹猴IgG特異性 結合、不與人免疫球蛋白結合的抗體，示蹤抗體為與人IgG特異性結合的 抗體。
6. 權利要求3到5任一項所述的方法，特征在于所述與食蟹猴IgG特 異性結合的抗體和/或所述與人免疫球蛋白特異性結合的抗體為單克隆抗 體。
7. 權利要求3到6任一項所述的方法，特征在于形成的復合物的量與 DA/ADA復合物、DA和/或ADA的濃度相關聯。
8. 權利要求3到任一項所述的方法，特征在于樣品與預定量的所述藥 物抗體預將育。
9. 用包含捕獲抗體和示蹤抗體的雙抗原橋聯免疫測定法對猴種樣品 中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)進行免疫測定的方法，特征 在于捕獲抗體為與食蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體，示蹤抗體為藥物抗體。
10. 用包含捕獲抗體和示蹤抗體的雙抗原橋聯免疫測定法對猴種樣品 中針對藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)進行免疫測定的方法，特征在 于示蹤抗體為與食蟹猴IgG特異性結合、不與人IgG結合的抗體，捕獲抗 體為藥物抗體。
11. 權利要求3到IO任一項所述的方法，特征在于捕獲抗體通過特異 性結合對固定化。
12. 權利要求ll所述的方法，特征在于捕獲抗體與生物素綴合，通過 固定化抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素進行固定。
13. 權利要求3到12任一項所述的方法，特征在于示蹤抗體通過特異 性結合對與可檢測的標記綴合。
14. ;〖又利要求13所述的方法，特征在于示蹤抗體與洋地黃毒苷綴合， 通過針對洋地黃毒苷的抗體實現與可檢測的標記連接。
15. 雜交瘤細胞系3.25.12 (DSM ACC2799 ) 、 3.29.15 (DSM ACC2800 ) 、 4.38.30 (DSM ACC2801 ) 、 7.57.41 (DSM ACC2802 ) 、 7.72.32 (DSMACC2803)。
16. 用于權利要求3到14所述的方法的抗體組合物，特征在于其包含 由細胞系DSM ACC2799、細胞系DSM ACC2800、細胞系DSM ACC2801、 細胞系DSM ACC 2802和/或細胞系DSM ACC2803生產的抗體的混合物。
全文摘要
本發明提供了與食蟹猴IgG特異性結合的抗體，特征在于其不與人IgG結合，以及用雙抗原橋聯免疫測定法對猴種樣品中藥物抗體(DA)和針對所述藥物抗體的抗體(抗藥物抗體，ADA)的免疫復合物(DA/ADA復合物)進行免疫測定的方法。
文檔編號G01N33/564GK101506659SQ200780030744
公開日2009年8月12日 申請日期2007年9月7日 優先權日2006年9月12日
發明者K-G·施圖本拉赫, R·福格爾, U·埃西希, U·韋塞爾斯 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司