非分離式測定方法

文檔序號：5831117閱讀：493來源：國知局

專利名稱：非分離式測定方法
技術領域：
本發明涉及新穎的與特異性結合反應有關的測定方法，其與已知方法相比更簡單化。該測定方法被稱為非分離式測定法，因為在檢測步驟之前，它們不需要除去或者分離過量的檢測標簽。該方法適用于多種類型的測定，包括免疫測定、受體-配體測定和核酸雜交測定。
背景技術：
人們在測定方法開發、尤其是免疫測定開發的領域已經付出了巨大的努力，以簡化測定設計方案，同時保留它們在靈敏度、動態范圍、耐用性、較寬的應用性和自動化適用性方面的主要優點。已經有一種方法用于設計所謂的同質測定形式，無需對添加的可檢測地標記的特異性結合伴侶進行分離。該類型的方法依賴于設計出檢測原則，即結合反應的結果或是開啟、或是關閉。相反，異質測定形式依靠結合物的物理分離，并且在定量之前不含可檢測地標記的特異性結合伴侶。
在同質酶免疫測定領域，已經公開了許多美國專利。許多專利開發了抗體-抗原結合反應來激活或抑制標記酶:美國專利Nos. 3,817,837; 3,852,157; 3,875,011; 3,966,556; 3,905,871; 4,065,354; 4,043,872; 4,040,907; 4,039,385; 4,046,636; 4,067,774; 4,191,613;以及4,171,244、 4,785,080。其他的同質免疫測定涉及多種通過抗體或者其他的熒光猝滅劑的猝滅熒光方法美國專利Nos. 3,998,943; 3,996,345; 4,174,384; 4,161,515; 4,208,479和4,160,016。在歸為免疫測定類型的領域還有其他的美國專利，包括美國專利Nos. 3,935,074; 4,130,462;以及 4,193,983。美國專利No. 4,160,645公開了一種使用電子傳遞催化劑作為標簽的測定方法。該催化劑(標簽)通過粘結至抗體而失活。
Campbell等(Biochem. J.，巡，185-194 (1983))公開了一種檢測方法，其以競爭性測定形式采用在偶聯于抗原(Ag-L)的化學發光供體與熒光受體偶聯于抗體(Ab-F)之間的能量傳遞。復合抗原最終發射熒光劑的波長，同時游離抗原發射化學發光標簽的特征波長。接著，測量兩種波長的光強度，并且將兩種信號的比率與樣品中分析物的含量相聯系。
已知還有多種其他的同質免疫測定法Rubenstein等，美國專利No. 3,817,837 (同質酶免疫測定)；Ullman，美國專利No. 3,996,345 (熒光猝滅同質免疫測定)；Maggio，美國專利No. 4,233,402 (酶通道同質酶免疫測定)；以及Boguslaski等，加拿大專利1,082,577 (半抗原-輔助因子同質酶免疫測定)。
Ullman的美國專利6,406,913公開的測定方法包括在一定條件下處理一種疑似含有分析物的介質，使得該分析物可以引起光敏劑和化學發光的化合物獲得接近的近似性。該光敏劑產生單線態氧，當其處于接近的近似性時，其通過溶液擴散并且激活化學發光化合物。被激活的化學發光化合物隨后產生光。產生的光量與介質中的分析物含量有關。在一個實施方式中，至少一種光敏劑和化學發光化合物與懸浮的顆粒有關，并且與特異結合性配對成員相結合。
McCapra的美國專利5,516,636公開的測定方法包括特異性結合測定，其利用敏化劑作為標簽。當通過輻射、電子傳遞、電解、電致發光或者能量傳遞而被激化時，該敏化劑達到激發態，其(a)剛一與分子氧相互作用就產生單線態氧，或者(b)剛一與無色染料相互作用就被氧還原，產生過氧化氫。兩種與激發的敏化劑，連同外加的其他試劑一起，進行相互作用中的任何一種，可以產生可檢測信號。
盡管人們在設計同質的、或者非分離式的測定形式方面作了相當大的努力，但這些測定法仍然未受到廣泛的商業應用。異質測定法預料作為更簡單的測定法而被開發并大量生產，雖然操作上更復雜。特別地，在高容量的臨床免疫診斷的領域和較小的臨床核酸診斷領域，異質測定形式占統治地位。在該應用領域內，測試形式將有利于方案可以簡單化、復雜度可以降低、并且兼容性可以提高、同時可以通過除去多余步驟而自動化的領域。

發明內容
在一個方面，本發明提供新穎的與特異性結合反應有關的測定方法，尤其是免疫測定，其與己知方法相比更簡單化。通過在檢測步驟之前省去分離和洗滌步驟而使測定方法簡單化，并且因此被認為是非分離式測定法。該方法的特征在于，使用被固定的化學發光化合物和結合(conjugated)于特異性結合伴侶的活化劑化合物，用于誘導化學發光反應。分析物介導的共定位的化學發光標簽化合物和活化劑結合物引起隨后的化學發光反應僅在被結合的分析物分子的位點處發生。未結合的過量活化劑結合物的存在不參與或者不妨礙化學發光反應。其結果是，發射的化學發光強度與分析物的數量成正比。

圖1是根據本發明使用標記的捕獲抗體進行免疫測定的檢測步驟的示意圖。
圖2是根據本發明使用標記的封閉性蛋白質和未標記的捕獲抗體進行的另一種免疫測定
法的檢測步驟的示意圖。
圖3是根據本發明使用標記的固體表面和未標記的捕獲抗體進行的另一種免疫測定法的
檢測步驟的示意圖。
圖4是一圖表，顯示了在使用固定在微孔板的孔中的標記的捕獲抗體和過量的用于檢測的抗IgG-HRP結合物的非分離式免疫測定法中的IgG抗原檢測。
圖5是一圖表，顯示了在使用標記的封閉性蛋白質和固定在微孔板的孔中的未標記的捕獲抗體以及過量的用于檢測的抗IgG-HRP結合物的非分離式免疫測定法中的IgG抗原檢測。
圖6是根據本發明使用標記的捕獲核酸進行的核酸雜交測定法的檢測步驟的示意圖。
圖7是根據本發明使用標記的固相、被固定的捕獲抗體和標記的分析物類似物進行的競爭性免疫測定的檢測步驟示意圖。
具體實施例方式
定義
烷基-含有l-20個碳的支鏈、直鏈或者環烴基團，其可以用1個以上除H之外的低級垸基取代基取代，在此使用的低級垸基指的是那些含有直至8個碳的烷基。
分析物--測定中在待檢測樣品中的物質。一種以上具有對分析物的特異性結合親合力的物質將被用于檢測分析物。該分析物可以是蛋白質、抗體、或半抗原，與該半抗原結合的抗體可以被制備。該分析物可以是核酸，該核酸可以被互補的核酸結合。該分析物可以是任何其他的形成特異性結合配對中的成員的物質。
芳烷基--用芳基取代的烷基。
芳基—含有芳香環的基團，該基團含有1至5個碳環的芳香環，其可以用1個以上除H 之外的取代基取代。
生物材料--包括全血、防止凝血的、血漿、血清、組織、細胞、細胞內容物、以及病毒。化學發光化合物--經過導致其被轉化為在電子激發態下形成的另一種化合物的反應的化合物。該激發態可以是單線激態或三重激態。該激發態可以剛一衰減成基態就直接發光，或者可以將激發能傳遞至發射能受體，借此返回到基態。在該過程中，能量受體被躍遷至激發態并發光。
樣品-含有或者疑似含有核酸的液體。可以在本發明方法中使用的典型的樣品包括身體的液體，比如血液，其可以是當收集血液標本時通常發現的抗凝血的血液、血漿、血清、尿液、精液、唾液、細胞培養物、組織提取液等等。其他類型的樣品包括溶劑、海水、工業用水樣品、食用樣品和環境樣品比如土壤或水、植物材料、真核生物、細菌、質粒和病毒、真菌、以及源于原核生物的細胞。
固相材料-具有測定成分被固定在其上的表面的材料。原料可以為如下形式顆粒、微粒、納米顆粒、纖維、珠子、膜片、濾紙及其他支持物比如試管和微孔板。
特異性結合配對、特異性結合伴侶-一種分子，其包括對另一種物質具有特異性結合親合力的生物分子，所述另一種物質包括DNA、 RNA、低聚核苷酸、抗體、抗體片段、抗體 -DNA嵌合體、抗原、半抗原、蛋白質、凝集素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和生物
素。特異性結合伴侶可以結合于活化劑或化學發光化合物的一種以上分子。
取代--是指基團上至少一個被非氫基團置換。應該注意，關于取代基團，本文中指的是可以存在多個置換位點，除非另有明確說明。
本發明涉及用于利用特異性結合配對反應來檢測物質的快速而簡單的測定方法。該方法需要使用被固定的化學發光化合物、用于誘導化學發光反應的結合于特異性結合伴侶的活化劑化合物、以及引發劑溶液。該方法涉及一種以上用于檢測分析物的特異性結合配對反應。標記的特異性結合伴侶結合于分析物的結果是，使活化劑成為近似于被固定的化學發光化合物，以使得其可以有效激活剛一添加引發劑溶液就產生化學發光的反應。將被活化劑標記的特異性結合伴侶以過量于結合所有的分析物所需要的量，提供至系統。在添加引發劑溶液和檢測之前，不用除去過量的未結合的活化劑結合物，因為其不能參與反應。
本發明的方法因此不同于常規試驗方法，不需要除去存在的大大過量于與分析物特異性聯接的量的未結合的活化劑結合物。可以將含有分析物、活化劑結合物、和引發劑溶液的樣品依序添加至試驗容器，無需洗滌或者分離、以及發光讀取。另一方面，在導入引發劑溶液之前，可以將樣品和活化劑結合物預混合并添加至試驗容器，所述試驗容器含有用于俘獲分析物的特異性結合伴侶并含有被固定的化學發光標簽。不需要洗滌或分離過量的未結合的活
化劑結合物。另一個與本技術領域已知的常規化學發光測定法差別化的關鍵點在于該事實參與光產生的化學發光化合物和活化劑(例如過氧化物酶)都不能自由地擴散進入溶液。兩者都受空間制約。部分由于該結果，信號產生趨于短暫。
使用化學發光底物和酶標記的結合物的常規測定法要提供大大過量于標簽酶的量的底物。通常，底物/酶的摩爾比率可以超過十的九次冪、即，過量十億倍。據認為有必要供應這樣極大過量的化學發光化合物，以便確保充分的底物供應，用于連續的酶法轉化，并且該過程確保在測定中足夠的檢測靈敏度。申請人發現，有可能設計出高靈敏度的測定方法，其將該比率減小了幾個數量級。就這點來說，這些方法基本上不同于巳知的方法。
省去如上所述和如下所述示例性測定法顯示的洗滌和分離步驟，從而提供了使測定方案設計簡單化的機會。操作步驟數量的減少可以降低測定時間、由不完全的洗滌帶來的內測定變化性、以及成本。同時，增強了實施自動化和小型化測定的能力，并具有自動化和小型化伴隨的所有固有優點。
根據本發明的方法進行的測定包含四個步驟。在第一步，將固相提供于試驗設備中，用于特異性捕獲所研究的分析物。該固相上設有被固定的用于待檢測的分析物的特異性結合伴侶。該固相上進一步設有固定于其上的化學發光標簽化合物。可以以如下詳述的許多不同方式提供化學發光標簽。在各個變體中，化學發光標簽都不可逆以使其固定不動的方式附著于物質或材料上。在第二步，將含有分析物的樣品和活化劑結合物導入具有固相被固定的用于分析物的特異性結合伴侶的試驗設備，并且允許形成特異性結合復合物。樣品和活化劑結合物可以被分別地依序或同時添加，或者可以被預混合并作為組合添加。在此刻可以插入允許結合反應發生的任選滯后時間。在第三步，添加引發劑溶液以產生化學發光，用于檢測分析物。最后，檢測化學發光。優選測量峰值光強度水平或總的累積光強度。該光量可以通過繪制校準曲線根據通常已知的方法而與分析物含量有關。當在添加引發劑溶液后緊跟著發生光發射時，優選用如下任何一種機械方式定時測量的開始通過合適的注射器的添加，或者通過已處于檢測器作用下的試驗設備進行添加。
測定形式和固體支持物
在本發明的方法中，將化學發光標簽化合物固定至測試體系的成分。這可以以數種方式中的任一方式完成。在一個實施方式中，化學發光標簽共價聯接至被固定的用于分析物的特異性結合伴侶。一個實施例是一種固定在微孔板的孔上的捕獲抗體。特異性結合伴侶的固定可以通過共價連接或者通過吸附工藝進行。在這種圖1中描繪的方式中，借助于以"夾心" 形式結合分析物的兩種特異性結合伴侶，化學發光標簽變得與活化劑有關。在圖2中描繪的另一個實施方式中，化學發光標簽被共價連接于以任意方式固定在固體支持物上的輔助物質。輔助物質的固定可以通過共價連接或者通過吸附工藝進行。因此該標簽被近乎均勻地分配在固體支持物表面的周圍。提供一種方法用于將分析物吸引至表面，例如通過沒有標記的用于分析物的特異性結合伴侶來進行。借助于可使活化劑接近附著于輔助物質的化學發光標簽的
13特異性結合反應，該化學發光標簽變得與活化劑有關，從而該輔助物質被動地被涂布到支持物表面上。在另一個實施方式中，化學發光標簽被共價連接至固體支持物的表面。如圖3所示，標簽因此被近乎均勻地分配在固體支持物表面的周圍。提供一種方法用于將分析物吸引至表面，例如通過沒有標記的用于分析物的特異性結合伴侶來進行。借助于可使活化劑接近直接附著于支持物表面的化學發光標簽的特異性結合反應，該化學發光標簽變得與活化劑有關。然后，無需洗滌或分離，添加引發劑溶液并且測量化學發光。
另一個實施方式包括一種變化，其中，使用分析物的類似物，包括活化劑-分析物結合物。該分析物類似物和分析物將競爭性地與用于分析物的特異性結合伴侶結合。顯而易見，在這類測定方法中，在樣品中的分析物含量和化學發光強度之間將呈負相關性(圖7)。
除通過用于結合抗原或其他蛋白質或其他抗體的抗體經由免疫測定法進行化學發光標簽的附著之外，本發明的方法可以使用化學發光標記的核酸，用于通過互補核酸的結合來檢測核酸。在這點上，該使用就核酸的大小而言沒有特別限定，僅有的標準是，互補伴侶有足夠的長度以允許穩定的雜交。在此使用的核酸包括基因長度的核酸、核酸的較短碎片、多聚核苷酸和低聚核苷酸，其中任何一種可以是單鏈的或者是雙鏈的。在本發明的使用核酸作為特異性結合伴侶的實施方式中，核酸被共價附接或者物理地固定在固體支持物的表面上，以捕獲分析物核酸。可以將化學發光標簽附接于俘獲核酸，大略如圖6所示，或者可以按如上所述將標簽與固相直接地相聯接。該俘獲核酸將具有與分析物核酸的序列區域完全的或者基本上完全的序列互補性。當基本上互補時，俘獲核酸可能具有不與分析物互補的末端突出部分、末端環狀部分或內部環狀部分，只要其不會妨礙或者抑制與分析物的雜交。反向位置也可以出現在其中突出或環位于分析物核酸內部的位置。俘獲核酸、分析物核酸、以及活化劑和第三核酸的結合物允許雜交。該第三核酸與分析物核酸的序列區域基本上互補，所述序列區域不同于與俘獲核酸互補的區域。俘獲核酸和活化劑結合物核酸與分析物的雜交可以依序或者是同時地連續進行。該工藝過程的結果是，借助于可使活化劑接近直接附著于支持物表面的化學發光標簽的特異性雜交反應，該化學發光標簽變得與活化劑有關。按如上所述提供引發劑溶液并且檢測化學發光。
另一個實施方式包括一種變化，其中，使用分析物與活化劑的結合物。該分析物核酸-
活化劑結合物和分析物核酸將競爭性地與用于分析物的特異性結合伴侶核酸結合。顯而易見，在這類測定方法中，在樣品中的分析物含量和化學發光強度之間將呈負相關性。
除基于抗體和基于核酸的體系之外，其他特異性結合配對，如通常為本領域的普通技術人員所熟知的結合測定法，可以用作根據本發明的試驗方法的基礎。該例子有熒光素/抗熒光
14素配對、地高辛配基/抗地高辛配基配對、以及硝基苯基/抗硝基苯基配對。作為另一個例子，可以使用眾所周知的(鏈霉)抗生物素蛋白/生物素結合配對。為顯示其中可以使用該結合配對的一種方式，可以將鏈霉抗生物素蛋白-化學發光標簽結合物共價連接或者吸附到固體支持物上。然后添加用生物素標記的分析物和活化劑結合物，其中結合物被附接于抗生物素抗體或者抗分析物抗體。在使復合物被形成后，添加引發劑溶液并且按上述方法進行檢測。對于本領域的技術人員而言，這些例子及其他例子皆被認為在本發明方法的范圍之內。
在本發明的實施方式中有用的固體支持物可以是各種材料、各種形狀、和各種尺寸。已經在結合測定法中使用的材料皆可提供對于化學發光標簽附著和固定特異性結合伴侶有用的固體支持物，包括96孔、384孔以上的多種微孔板，試管，樣品杯，塑料微球，纖維素，紙質或塑料試驗條，膠乳粒子，聚合物顆粒，二氧化硅粒子，磁性粒子，尤其是那些平均直徑為O.l - 10 iam以及納米顆粒的各種材料。本發明的公開教導了對用于本發明測定方法的
這些材料功能化的方法，。具體說，公開了一些方法，用于將化學發光標簽化合物和特異性結合伴侶例如抗體這兩者都附接至相同的表面、尤其是微粒。化學發光標簽化合物
在本發明的實施方式中用作化學發光標簽的化合物具有通式CL-L-RG，其中，CL表示化學發光的部分，L表示連接化學發光部分和活性基團的連接部分，并且RG表示用于偶聯于另一種材料的活性基團部分。化學發光部分CL被包括其內。優選，但并非必需，CL基團、活化劑和引發劑溶液的化學發光反應快速發生在非常短暫的時間間隔的整個期間。
優選的化學發光化合物是能夠被氧化從而當存在活化劑和引發劑溶液時產生化學發光。通過連接物和活性基團的結合可以作化學發光標簽的示例性化合物種類包括氨基苯二酰一肼 (魯米諾)，以及在結構上相關的環狀酰肼，包括異氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基異氨基苯二酰一肼(ABEI)、氨基己基乙基異氨基苯二酰一肼(AHEI) 、 7-二甲基氨基萘-1,2 -二羧酸酰肼、環取代的氨基鄰苯二甲酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-1,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羥基-鄰苯二甲酰肼、6-羥基鄰苯二甲酰肼，以及在Masuya等的美國專利No. 5,420,275和Yamaguchi的美國專利No. 5,324,835中公幵的其他2,3-二氮雜萘二酮類似物。
另一類化學發光部分包括在美國專利No. 5,491,072、 5,523,212、 5,593、 845和6.030、 803 中公開的9,10-二氫化吖啶酯、硫酯和氨磺酰。
另一類化學發光部分包括在美國專利No. 5,922,558; 6,696,569和6，891，057中公開的雜環化合物。這些化合物優選包括優選包含氮、氧或者含硫的五元環或六元環或多元環基團的雜環，該雜環鍵合環外的雙鍵，該雜環的末端碳原子可用選自氧和硫原子的兩種原子取代。
15據認為，任何己知可以在過氧化氫和過氧化物酶的作用下產生化學發光的化合物將具有本發明中使用的化學發光標簽化合物的化學發光部分的功能。本技術領域已知有許多各種結構分類的這樣的化合物在這些條件下可以產生化學發光，這樣的化合物包括占辛染料、芳香胺和雜環胺。
在本發明的方法中有用的化學發光標簽化合物的優選基團包括具有式I的9,10-二氫化吖啶類化合物
其中，L是連接基團，其可以是化學鍵或另一種二價或多價的基團；RG是反應基團，其使化學發光標簽化合物能夠被結合于另一種化合物；R1、 W和W是含有1到50個非氫原子的有機基團，并且R、R"中的每一個是氫或無干擾性的取代基。標記性取代基-L-RG優選存在于R1或R2的一個上，雖然其還可以作為取代基存在于R3上或者R4 - R11之一上。
在化學式I的化合物中的基團W和I^可以是含有1到約50個選自于C、 N、 O、 S、 P、 Si和鹵素原子的非氫原子的任何有機基團，其使光產生。所述使光產生是指，當式I的化合物經受本發明的反應時，激發態產物化合物被產生并且其可以涉及一種以上化學發光中間體的產生。激發態產物可以直接地發射光，或者可以通過能量傳遞而將激發能傳遞至熒光受體，引起光從熒光受體發出。R'和R"尤選選自于l-20個碳原子的取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基。當R' 或f是取代基時，其用l-3個原子或基團取代，所述基團選自于羰基、羧基、三(Cl-C8垸基)甲硅烷基基團、S03—基團、OSO^基團、葡糖基基團、P03—基團、OP03—2基團、鹵素原子、羥基、硫醇基、氨基、季銨基團、季鱗基團。在一種優選實施方式中，R'或W優選用式 -L-RG的標記性取代基取代，此處L是連接基團，而RG是反應基團。
基團R3是含有1到50個除滿足基團中原子的原子價所需要的必需數量的H原子之外的非氫原子的有機基團，所述非氫原子選自于C、 N、 O、 S、 P、 Si和鹵素原子。更優選W含
R8 R3 R7
其中，基團R'-R11中的至少一種是下式的標記性取代基:
-L- RG有1到20個非氫原子。該有機基團優選選自由含l-20個碳原子的垸基、取代烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基所構成的組。更優選的W基團包括取代或未取代的d-C4垸基、苯基、取代或未取代的芐基、烷氧基垸基、羧基烷基和烷基磺酸基團。基團113可以被結合于117或118以構成5元環或6元環。在一個實施方式中，RS用式-L-RG的標記性取代基取代。
在式I的化合物中，基團R、RU各自獨立地是H或取代基團，其允許產生激發態產物，并且通常含有1到50個選自于C、 N、 0、 S、 P、 Si和鹵素的原子。有代表性的取代基團可以包括，但不限于垸基、取代垸基、芳基、取代芳基、芳烷基、烯基、炔基、垸氧基、芳氧基、鹵素、氨基、取代氨基、羧基、烷氧羰基、氨甲酰、氰基、以及磺酸酯基團。相鄰基團的配對，例如R、RS或者RS-R6，可以被結合一起，從而形成包括至少一種融合于環中的附接有兩個基團的5元環或6元環的碳環或雜環體系。這樣融合的雜環可以含有N、 O或S 原子，并且可以如上所述那些含有除H之外的環取代基。一種以上的基團R4 - R11可以是式-L -RG的標記性取代基。優選W-I^選自于氫、鹵素和烷氧基比如甲氧基、乙氧基、叔丁氧基等等。優選所述化合物中的R5、 R6、 119或111()基團之一為鹵素，而R4 - R"中的其他基團皆為氫原子。
取代基團可以以各種量并入、并且選擇在9，10-二氫化吖啶環上的環或者鏈位置，以便改變化合物的特性或者便于合成。這些特性包括，例如，化學發光量子產率、酶反應速度、最大光強度、光發射持續時間、光的發射波長以及在反應介質中的溶解度。具體的取代基和它們的效果被顯示在下述具體的實施例中，然而，無論如何不應將其視為對本發明保護范圍的限制。為便于合成式I的化合物，優選W至R"中的每一個基團皆為氫原子。
連接基團(L)。連接基團可以是鍵、原子、二價基團和多價基團、或者是原子上的直鏈或支鏈，其中一些可以是環狀結構的一部分。該取代基通常含有1至約50個非氫原子、更通常1至約30個非氫原子。包含鏈的原子選自于C、 0、 N、 S、 P、 Si、 B、以及Se原子，優選選自于C、、 N、 P和S原子。鹵素原子可以作為鏈或環上的取代基存在。典型的包含連接的取代基的官能團包括亞烷基，亞芳基，亞鏈烯基，醚，過氧化物，羰基例如酮、酉旨、碳酸酯、硫酯，或者酰胺基，胺，脒，氨基甲酸酯，脲，亞胺，酰亞胺，酰亞胺鹽，碳二亞胺，肼，重氮，磷酸二酯，磷酸三酯，磷酸酯，硫醚，二硫化物，亞砜，砜，磺酸酯，硫酸酯，以及硫脲基團。
反應基團。反應基團RG是原子或基團，其存在可以促進通過共價連接或者物理力而鍵合于另一種分子。在一些實施方式中，例如，當反應基團是離去基團比如鹵素原子或甲苯磺酸鹽基團、并且化學發光標簽化合物被通過親核置換反應而共價附接于另一種化合物上時，本發明的化學發光標簽化合物連接至另一種化合物將涉及從反應基團上喪失一種以上原子。在其他實施方式中，當發生加成反應例如Michael加成時、或者當反應基團是異氰酸鹽或者異硫氰酸鹽基團時，化學發光標簽化合物通過形成共價鍵而連接至另一種化合物將涉及反應基團內部鍵的重組。在另一些其他的實施方式中，連接不會涉及共價鍵形成，但涉及物理力，而在這樣情況下反應基團保持不變。而物理力是指吸引力，比如氫鍵吸引力、靜電吸引力或者離子吸引力；疏水性吸引力比如堿基堆積；以及特異性親合力相互作用比如生物素-鏈霉抗生物素蛋白相互作用、抗原-抗體相互作用、以及核苷酸-核苷酸相互作用。
表1.用于將標簽化學結合至有機分子和生物分子的反應基團
a)胺反應基團。b)硫醇反應基團(
<formula>formula see original document page 19</formula>
3)羧酸反應基團,
-卵:
4)羥基反應基團,
2
0、 j
0
、
一u==c=o ~*S02ci% cp3
5) 醛/酮反應基團。
-NH2
6) 其他反應基團配對。
ONH2
NHNH2
19R~J%
優選的反應基團包括OH、 NH2、 ONH2、 NHNH2、 COOH、 S02CH2CF3、 N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基琥珀酰亞胺醚和順丁烯二酰亞胺基團。
雙功能偶聯劑還可以用于將標簽偶聯到具有合適的反應性基團的有機分子和生物分子上 (參見L. J.Kricka，配體-結合物測定法。Marcel Dekker公司出版，紐約，1985年，第18-20 頁、表2.2;和T. H. Ji，"雙功能試劑"，Methods in Enzvmology, 91 ， 580-609 (1983))。
有兩種類型的雙功能試劑并入最終結構的雙功能試劑，以及不并入最終結構、并且僅起偶聯兩種反應物作用的雙功能試劑。
優選的化合物組具有式II，其中，W至RH中的每一個都是氫。基團R1、 112和113如以
上所定義的。
優選的具有式I的標簽化合物具有作為基團R1或R2上取代基的基團-L - RG。優選的標簽化合物具有式III。
有代表性的優選的標簽化合物以及它們在連接于其他分子和固體表面的用途在下述具體的實施例中有描述。活化劑結合物活化劑化合物成為活化劑-特異性結合伴侶結合物的一部分。結合物具有雙重作用；1) 在測定中，通過特異性結合伴侶部分直接地或者通過中間的特異性結合伴侶而特異性地結合至分析物上，和2)通過活化劑部分激活化學發光化合物。結合物的活化劑部分是具有活化化學發光化合物的效果的化合物，使得當存在引發劑溶液時產生化學發光。能夠用作活化劑的化合物包括過渡金屬鹽和絡合物以及酶，尤其是含有過渡金屬的酶，更尤其是過氧化物酶。在活化劑化合物中有用的過渡金屬包括周期表3 - 12族中的那些過渡金屬，尤其是鐵、銅、鈷、鋅、錳和鉻。應該注意，決定著信號產生的活化劑分子可以在物理上限制的半徑內起作用，并且僅與有限供應的化學發光化合物相接觸。如果活化劑具有這種潛力，這似乎阻止了較大的催化轉化。
可以經受化學發光反應的過氧化物酶包括乳過氧化物酶、微小過氧化物酶、髓過氧化物酶、鹵素過氧化物酶例如釩溴過氧化物酶、辣根過氧化物酶、真菌的過氧化物酶比如木質素過氧化物酶和來源于Arthromyces ramosus的過氧化物酶以及在白腐真菌中產生的依賴Mn 的過氧化物酶、以及大豆過氧化物酶。其他氧化物酶的模擬化合物并不是酶，而是具有類似過氧化物酶的活性，其包括鐵絡合物比如亞鐵原卟啉和Mn-TPPS4 (Y.X. Ci等，Mikrochem. J.， 52， 257-62 (1995))，己知該化合物可以催化底物的化學發光氧化，這種化合物明確地被考慮包含本發明所使用的過氧化物酶含義的范圍內。
過氧化物酶和生物分子的結合物或者復合物還可以被使用于產生化學發光的方法中，僅有的附帶條件是結合物顯示出過氧化物酶活性。可以結合于一個以上過氧化物酶分子的生物分子包括DNA、 RNA、低聚核苷酸、抗體、抗體片段、抗體-DNA嵌合體、抗原、半抗原、蛋白質、凝集素、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白和生物素。還可以在本發明的方法中使用包含或者結合過氧化物酶的復合物，比如脂質體、膠束、囊泡和為連接生物分子而被功能化的聚合物。
引發劑溶液
引發劑溶液提供了為產生對于化學發光所需激發態化合物所需要的反應物。該反應物可以是一種對于通過直接與化學發光標簽反應而進行化學發光反應所必需的反應物。其可以具有代替該功能或者除該功能之外的促進活化劑化合物功能的作用。例如，當活化劑是過氧化物酶時，將會發生這種情況。在一種優選實施方式中，引發劑溶液包含過氧化物化合物。該過氧化物成分是任何能夠與過氧化物酶反應的過氧化物或者烷基氫過氧化物。優選的過氧化物包括過氧化氫、過氧化脲和過硼酸鹽。有代表性的實施方式使用作為活化劑的過氧化物酶結合物、被9,10-二氫化吖啶標記的分析物(其中，通過特異性結合伴侶與上述式III的化合
21物反應而提供9,10-二氫化吖啶標簽)、以及包含過氧化氫的引發劑溶液。該過氧化物與過氧化物酶反應，估計可能是在酶的活性部位將鐵的氧化態變成了不同的氧化態。這種改變了狀態的酶與保持與酶近似性的9，10-二氫化吖啶標簽反應。化學發光反應包含由化學發光化合物與過氧化物形成的中間體的進一步反應，以產生最終的反應產物和光。
某些增強化合物的并入引發劑溶液會促進酶的反應性。這些增強劑中包括已知可增強其他的過氧化物酶反應的酚類化合物和芳香胺，如美國專利No. 5,171,668和5,206,149所述，現將其引入本文作為參考。在美國專利5,512,451中公開了取代的和未被取代的芳基硼酸化合物和它們的酯和酐衍生物，將其引入本文作為參考，在此也考慮將其歸入在本發明中有用的增強劑范圍內。優選的增強劑包括，但不限于對苯基苯酚、對碘苯酚、對溴苯酚、對羥基桂皮酸、對咪唑基苯酚、醋氨酚、2,4-二氯苯酚、2-萘酚和6-溴-2-萘酚。還可以使用選自如上所述這些種類的一種以上增強劑的混合物。
被發現有效增強由本發明的化合物產生化學發光的輔助增強劑是吩惡嗪和吩噻嗪的衍生物，它們具有下式。
在吩惡嗪和吩噻嗪增強劑的氮原子上被取代的R基包括1-8個碳原子的烷基，以及用磺酸酯鹽或羧酸酯鹽基團取代的l-8個碳原子的烷基。優選的增強劑包括3- (N-吩噻嗪基) -丙垸磺酸鹽、3 - (N-吩惡嗪基)丙烷磺酸鹽、4 - (N-吩惡嗪基)丁垸磺酸鹽、5 - (N-吩惡嗪基(phenoxazinyl))-戊酸鹽、以及N-甲基吩惡嗪(N-methylphenoxazine)和相關同系物。
檢測本發明的反應是用引發劑溶液進行的，該引發劑溶液是典型的緩沖水溶液。合適的緩沖液包括任何常用的能夠保持環境允許的化學發光反應進行的緩沖液。典型地，引發劑溶液將具有約5至約10.5的pH值。示例性的緩沖液包括磷酸鹽、硼酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽、三(羥基-甲基氨基)甲垸[tris]、甘氨酸、麥黃酮(Tricine) 、 2-氨基-2-甲基-1-丙醇、二乙醇月安、MOPS、 HEPES、 MES等等。
引發劑溶液還可以含有一種以上清潔劑或者聚合物表面活性劑，以增強產光反應的發光
效率或者提高測定的信/噪比。在本發明的實施方式中有用的非離子表面活性劑包括，例如聚氧乙烯化烷基酚類、聚氧乙烯化醇類、聚氧乙烯化醚類和聚氧乙烯化山梨糖醇酯類。可以
使用包括季銨鹽化合物比如CTAB和季鱗鹽化合物在內的單體陽離子表面活性劑。為此目的，還可以使用包括那些含有季銨和季鱗鹽基團的陽離子表面活性劑的聚合型陽離子表面活性劑。
通過任何合適的已知手段比如光度計、X射線膠片、高速感光膠片、CCD攝像機、閃爍計數器、化學光度計或目測，可以檢測通過本發明的方法發射的光。每種檢測手段具有不同的光譜靈敏度。人眼是優選地對綠光靈敏，CCD攝像機顯示出對紅光的最高靈敏度，X射線膠片具有對紫外線、藍光或綠光的最大應答，這些都是可利用的。檢測裝置的選擇將取決于應用和成本、方便性考慮、以及是否需要產生經常記錄。在那些光發射時程較快的實施方式中，優選進行引發劑反應以便在使用檢測裝置時產生化學發光。作為例子，可以在適合于接受試管或微孔板的殼體內，在放置于光度計中或者被置于CCD攝像機前的試管或微孔板中進行檢測反應。
應用
本發明的測定方法發現了在許多類型的特異性結合配對測定法中的應用性。在這些應用中，首要的應用是化學發光酶聯免疫測定法，比如ELISA。進行免疫化學步驟的各種測定形式和方案己為本領域技術人員所熟知，并且包括競爭性測定法和夾心測定法。可以通過根據本發明的免疫測定法測試的物質種類包括蛋白質、抗體、半抗原、藥物、類固醇及其他通常在免疫測定技術領域已知的物質。
本發明的方法還可用于通過利用酶標記核酸探針的核酸檢測。例舉的方法包括溶液雜
交測定法、Southern blotting中的DNA檢測、通過Northern blotting的RNA檢測、DNA測序、 DNA指紋圖譜法、集落雜交(colony hybridization)以及噬菌斑雜交法(plaque lift)，其進
行過程對本領域的技術人員而言是眾所周知的。
除上述的抗原-抗體、半抗原-抗體或者抗體-抗體配對之外，特異性結合配對還可以包括互補的低聚核苷酸或多聚核苷酸、抗生物素蛋白-生物素、鏈霉抗生物素蛋白-生物素、激素-受體、凝集素-碳水化合物、IgG蛋白質A、核酸-核酸結合蛋白以及核酸-抗核酸抗體。在篩選藥物候選對象中使用的受體測定法是本發明方法的另一應用領域。這些結合配對的任何一種皆可以適合于在本發明方法的三組分夾心技術或者如上所述的二組分競爭性技術中使用。
本發明的目的還在于提供根據本發明的方法進行測定的試劑盒。試劑盒在包裝產品組合中可以包括化學發光標簽，其或者是游離的標簽化合物、化學發光標記的特異性結合伴侶、化學發光衍生的固體支持物比如顆粒或者微孔板，或者是化學發光標記的輔助物質比如封閉性蛋白質；同時還有引發劑溶液和使用說明書。如果化學發光標記是由使用者進行的話，試劑盒還可以任選地含有活化劑結合物、分析物定標器、稀釋劑和反應緩沖液。
23實施例
實施例1.化合物1的合成。
、Ph 、Ph
B 1 使用DCC作為偶聯劑，通過碘化羧酸與N-羥基琥珀酰亞胺反應，合成了碘化羧酸酯NHS酯。
在氬氣保護下，向二硫酯S (1.808 g， 5.00mmo1)在無水DMF (50mL)中的溶液中添加NaH (在礦物油中60%， 0.200 g， 5.00mmo1)。在室溫下反應后4h后，添加NHS 3-碘化丙酸酯4 (1.485 g， 5.00 mmol)，并且將得到的混合物攪拌過夜。在真空下除去NMF。用 CH2Cl2/EtOAc (40: 1)進行柱層析，得到1.770 g的黃色固體化合物丄(產率67%) 。 'HNMR (300MHz， CDC13) : 5 2.30 (s， 3H) ， 2.74 (t， 2H) ， 2.83 (s， 4H) ， 3.01 (t， 2H)， 5.31 (s， 2H) ， 6.88 (t， 2H) ， 7.07 (m， 2H) ， 7.11-7.18 (m， 3H) ， 7.27 (m， 4H)， 7.82 (dd， 1H) ， 7.89 (dd， 1H) ppm。實施例2.化合物2的合成。
<formula>formula see original document page 25</formula>
在氬氣保護下，將二硫酯￡ (0.692 g， 1.50mmo1)和NaH (在礦物油中60%, 0.060 g， 1.5Ommo1)在無水DMF (20mL)中的混合物在室溫下攪拌4小時，得到稍混濁的溶液。然后將NHS6碘化己酸酯A (0.661 g， 1.95mmo1)添加在DMF (5mL)中。在16h后，在真空下除去DMF。向殘余物添加10 mL的丙酮，接著添加20 mL的乙醚。傾析上清液。以相同的工序洗滌沉淀物三次。在真空干燥后，得到了 1.200g的黃色固體化合物2。 "HNMR(300 MHz， CD30D) : S 1,15 (m， 2H) ， 1.33 -1.47 (m， 4H) ， 2.01 (p， 2H) ， 2.38 (t， 2H)， 2.67 (t， 2H) ， 2.75 (t， 2H) ， 2.82 (s， 4H) ， 2.88 (t， 2H) ， 5.32 (s, 2H) ， 6.88-6.93 (m， 2H) ， 7.00 (t， 2H) ， 7.08 -7.28 (m， 7H) ， 7.83 (d， 1H) ， 7.92 (d， 1H) ppm。實施例3.化合物3和4的合成。
在氬氣保護下，將二硫酯￡ (l,OOg， 2.10 mmol)和NaH (在礦物油中60%, 0.087 g， 2.16mmo1)在無水DMF (20mL)中的混合物在室溫下攪拌4小時，得到稍混濁的溶液。然后將N-6碘化己氧基琥珀酰亞胺2 (0.82 g， 2.52mmo1)添加在DMF (5mL)中。將混合物攪拌過夜，此后在真空下除去DMF。用30 mL乙醚洗滌殘余物四次，得到1.35 g的化合物^。
將化合物2 (0.25 g)溶于5mL甲醇中，向其內添加5.0 mL的50%的NH2OH水溶液。溶液攪拌2天后，在真空下蒸去溶劑。用6x20mL的乙醚洗滌殘余物，得到0.21 g的化合物 4。 'HNMR (300MHz， CD30D) : S U4 (m， 4H) ， 1.40 (m， 4H) ， 1.94 (p， 2H)， 2.65-2.71 (m， 4H) ， 2.84 (t， 2H) ， 3.55 (t， 2H) ， 5.31 (s， 2H) ， 6.88 (d， 2H) ， 6.98 (q， 2H) ， 7,10 (m， 4H) ， 7.12-7.27 (m， 3H) , 7.85 (t， 2H) ppm。實施例4.化合物5和6的合成。
G
在氬氣保護下，將二硫酯￡ (1.32 g， 2.78mmo1)和NaH (在礦物油中60%， 0.1 14 g， 2.86mmo1)在30 mL無水DMF中的混合物在室溫下攪拌4小時。然后將化合物g (1.014 g， 3.61 mmol)添加于10 mL的DMF中。將混合物攪拌過夜，此后在真空下除去DMF。用20 mL 乙醚洗滌殘余物三次，得到2.10 g的化合物￡。
將化合物￡ (2.25 g)溶于15 mL的在甲醇中7NNHs和10 mL的28%氨水溶液的混合物中。攪拌3天后，在真空下除去溶劑。用乙醚(3x50mL)洗滌殘余物，并且用1^0/2-丙醇重結晶，得到1.20g的化合物5。
向化合物5 (0.300 g的話，0.563 mmol)在9.0 mL干燥DMF中的懸浮液中添加1.20 mL 的三乙胺。將混合物攪拌5 min，得到稍混濁的溶液。向該溶液中添加6 -馬來酰亞胺己酸NHS 酯(化合物G 0.260 g， 0.843 mmol)。在5 min內得到透明溶液。在16hrs后，在真空下除去DMF。用乙醚(4x30mL)洗滌殘余物，然后溶于甲醇(2mL)，并且用乙醚(50mL) 沉淀。得到0.400 g淺黃色泡沫狀固體化合物6。 'HNMR(400MHz， CD3OD) : 5 1.26 (t，11H) ， 1.49 -1.58 (m， 6H) ， 1.90 (p， 2H) ， 2.08 (t， 2H) ， 2.68 (m， 4H) ， 2.80 (t， 2H) ， 3.00 (t， 2H) ， 3.15 (q, 6H) ， 3.42 (t, 2H) ， 5.28 (s， 2H) ， 6.73 (s， 2H)， 6.85 (d， 2H) ， 6.96 (m， 2H) ， 7.07 (m， 4H) ， 7.18 -7.25 (m， 3H) ， 7.83 (m， 2H) ppm。
實施例5.輔助標簽化合物7 - 12。
在美國專利6,858,733中公開了下述所列其他示例性的標簽化合物的制備方法。
實施例6. 9,10-二氫化吖啶標記的抗體的制備。
實施例3中的9,10-二氫化吖啶標記的化合物i被用于標記綿羊抗小鼠lgG(H+L)(Jackson Immunoresearch)。使0.24 mg抗體在0.1 M硼酸鹽緩沖液、pH 8.25中的溶液與DMF中化合物2 (10:1摩爾比化合物2:抗體)以500y 1的體積在室溫下反應15 min，然后z 4 。C下過夜。使溶液穿過脫鹽柱(BioRad)，用PBS緩沖液洗脫，以便除去未結合的標簽。通過收集 500 Ul組分，得到了與任何未反應的抗體混在一起的標記的抗體。
通過化學發光測定法測試組分的標記抗體的含量。將1或10 y 1等分組分與50y 1的0.4 MHC1+3.6 %過氧化脲混合，接著在Turner Designs TD- 20e型光度計中向試管內注射50 U 1 的0.5 M的NaOH。從注射時開始測量來自發光脈沖的總的累積強度。保留顯示化學發光的那些組分。組分8在產物中占有最大含量。
28實施例7. 9，10-二氫化吖啶標記的BSA的制備。
實施例3中9,10-二氫化吖啶標記的化合物i被用于標記牛血清白蛋白(BSA)。使0.1g 的BSA在500 u 1的0.1 M硼酸鹽緩沖液、pH 8.25中的溶液與42 u 1的23.4 mg化合物》/100 ylDMF ( 10:1摩爾比化合物2: BSA)在室溫下反應15min，然后在4。C下過夜。使溶液穿過脫鹽柱(BioRad)，用PBS緩沖液洗脫，以便除去未結合的標簽。通過收集500 " 1組分，得到了與任何未反應的BSA混在一起的標記的BSA。
按實施例6中的方法，通過化學發光測定法測試組分中標記的BSA的含量。保留顯示化學發光的組分。組分7在產物中占有最大含量。
實施例8.被9，10-二氫化吖啶功能化的微孔的制備。
通過使用EDC作為偶聯劑，使被羧酸基團(生物系統)功能化的白色聚苯乙烯96孔微孔板與化合物5_偶聯。制備化合物5_在DMF和0.1 M的MES緩沖液(70:30 (v/v))所組成的溶液、(pH4)中的原液。將0.2mL等分原液添加至平板的各個孔，這些孔已經預先在 MES緩沖液中洗滌。添加在MES緩沖液中的EDC,并且使混合物反應過夜。除去上清液，并且依序用水2 x 1 mL禾P甲醇6 x 1 mL洗滌這些孔。
實施例9，用9,10-二氫化吖啶標記的聚(甲基丙烯酸酯)微粒物的制備。
通過回流四個小時，使安伯來特樹脂(Amberliteresin， IRP-64， 100 - 400目，2.50 g) 與SOCl2反應。冷卻該反應，并且在真空下除去揮發物。然后將小球懸浮在50 mL的CH2C12 中，向其中添加17.0mL的三乙胺，接著添加15.0mL的1， 2-乙二胺。在氬氣保護下將混合物攪拌過夜。通過添加100mL的甲醇分散顆粒物，然后過濾。用甲醇和CH2Cl2洗滌濾出的顆粒物，并且風干。得到的顆粒物重2.80g，計算的NH2含量是2.86mmol/g。
在氬氣保護下，將在10 mL無水DMF中的用1，2-乙二胺修飾的顆粒物(100 mg)與10 mg 的化合物2_—起在室溫下攪拌過夜。將混合物過濾，并且用甲醇洗滌顆粒物。在風干后，回收的功能化顆粒物重102 mg。
在可選的另一種方法中，通過按上述方法與SOCl2反應，將2.50 g的安伯來特樹脂轉化為酸性氯化物形式，然后與4.32 g的N-羥基琥珀酰亞胺在50 mL的四氫呋喃和6.8 mL的三乙胺中起反應，從而制備出被NHS酯功能化的顆粒物。這些顆粒與含有游離末端NH2基團的化合物i起反應，達到偶聯效果。
實施例10.被9,10-二氫化吖啶標記的微粒物與抗體的結合。
在室溫下，將20mg重量的、含有未反應的末端NH2基團的、用9,10-二氫化吖啶標記的安伯來特顆粒物，進一步與在100mL無水DMF中的102 mg 二琥珀酰亞胺基辛二酸酯(約5當量)反應15 min。通過離心分離顆粒物，并且用10x 1 mL的DMF洗滌。得到的游離NHS 酯在0.1 M硼酸鹽緩沖液、pH 8.5， 2 mM的EDTA中被偶聯于綿羊抗小鼠IgG (0.5 mL的1.8 mg/ml原液)，在4。C下過夜。將反應混合物在13krpm下離心，并且除去上清液。該顆粒物在離心柱(spin column)上用PBS+0.05%吐溫-20洗滌若干次。
通過在1.0 mL的封閉緩沖液(1 % BSA，在IX PBS中1 %蔗糖)中于37 °C下孵育1 小時，將得到的被抗體標記的顆粒物用BSA封閉。該顆粒用吐溫-PBS洗滌緩沖液進行洗滌，并且儲存于l.OmL的1 XxPBS中。
實施例11.用9，10-二氫化吖啶標記的磁性微粒物的制備。
制備4 mg化合物i在0.7 mL的DMF和0.3 mL的0.1 M MES緩沖液所組成的溶液(pH 4)中的原液。將0.1mL等分原液添加至50mg的己經在MES緩沖液中洗滌過的羧基化聚苯乙烯顆粒物(Dynal Dynabeads M-270型羧酸)。混合物用0.67 mL的MES緩沖液和0.23 mL 的DMF稀釋。添加EDC (23mg)，并且將混合物搖動過夜。除去上清液，并且顆粒物依序用2xlmL的水和6xlmL的甲醇洗漆，并且再懸浮于mL的甲醇中。
測試顆粒物的標記結合。將IO ul等分的顆粒物(含有大約0.5 mg)添加至0.5 mL的水中，制備出1 mg/ml原液。使100 U 1等分原液與過量的HRP反應5 min。用4 x 1 mL的水洗滌顆粒物，然后懸浮在1 mL的水中。注射含有25 mM tris、 pH 8.0、 8 mM對羥基桂皮酸、lmMEDTA、 0.2%吐溫-20和0.1 M過氧化脲的引發劑溶液(10 n 1)，并且在光度計中記錄化學發光的閃光。觀察到相比空白18 RLU的6040RLU信號。
將5mg部分的顆粒物用2x200 ul的0.1 M MES緩沖液、pH 4洗滌，然后再懸浮于117 yl的MES緩沖液。將綿羊抗小鼠IgG (0.15 mg，來自1.8 mg/ml原液)添加到顆粒物，并且將混合物搖動30分鐘。添加5mg的EDC，并且將混合物搖動4個小時。除去上清液，并且用3 x 500 u 1的洗滌緩沖液(PBS + 0.05 %吐溫-20)洗滌小球。將顆粒物再懸浮于500 y l的封閉緩沖液(PBS+l。/。BSA+P/。蔗糖)禾卩5mg的EDC中，在室溫下攪拌15min，并且在4 。C下攪拌過夜。除去上清液，顆粒物用2 x 500 y 1的洗漆緩沖液洗滌，并且再懸浮于1 mL 的PBS中。
實施例12.使用標記的捕獲抗體進行微孔板免疫測定。
將來自實施例6中標記抗體制備的含有產物的組分以1:100的比例在PBS緩沖液中稀釋。將50 !U等分稀釋液分別添加至白色聚苯乙烯96孔板上的26個孔中。該平板在室溫下在軌道搖床上攪動5分鐘。除去溶液，并且將孔用1X PBS + 0.05。/。吐溫-20洗滌三次，在各個步驟以后除去所有的洗滌緩沖液。
30將綿羊抗小鼠IgG F(ab')2 - HRP結合物(Jackson Immunoresearch)在包含2.5% BSA和在1XPBS中1。/。蔗糖的結合緩沖液中以1: 1.2x 106的比例稀釋。作為另一種選擇，結合物還可以在其他的基質比如FBS中稀釋。
將等分的稀釋結合物分配入26個孔中。通過與在抗IgG F(ab')2-HRP結合溶液中0 ng/ml 溶液一起進行2倍稀釋，從而制備出含有100 ng/ml - 0.048 ng/ml的IgG標準試樣。該標準試樣和零試樣是分配入孔中，達到最終容積50 yl/孔。將平板在平板搖床上室溫下培育1 hr。
制備出含有25 mM tris、 pH 8.0、 8 mM對羥基肉桂酸、1 mM EDTA、 0.2 %吐溫-20和 O.IM過氧化脲的引發劑溶液。
將平板轉移至Luminoskan平板光度計。無需除去結合溶液，通過依序注射100 iU的引發劑溶液產生發光，并且讀取各個孔的累積強度持續5秒。繪制得到的測定結果如圖1所示。該測定法允許在全程測試的整個期間用超過零信號的零+2標準偏差的最低校準進行定量。
實施例13.未標記的捕獲抗體和標記BSA微孔板免疫測定法。
添加50 lU等分未標記的綿羊抗小鼠IgG (H + L) 40 wg/ml的lXPBS，以涂敷白色聚苯乙烯96孔板的26個孔。該平板在室溫下在軌道搖床上攪動5分鐘。除去溶液，并且將孔用1XPBS + 0.05。/。吐溫-20洗滌三次，在各個步驟以后除去所有的洗滌緩沖液。
在PBS緩沖液+ 1%蔗糖中以50y 1 / mL稀釋來自在實施例7中標記的BSA制備的含有產物的組分。將IOO ul等分稀釋液添加至白色聚苯乙烯96孔板的26個孔的每一個中。該平板在37 。C下保溫1 hr。除去溶液，并且將孔用PBS + 0.05 %吐溫-20洗滌三次，在各個步驟以后除去所有的洗滌緩沖液。
將綿羊抗小鼠IgG F(ab')2- HRP結合物(Jackson Immunoresearch)在包含1% BSA和在 1XPBS中1%蔗糖的結合緩沖液中以l:1.2x 106的比例稀釋。將等分的稀釋結合物分配入26 個孔中。通過與在抗IgG F(ab')2-HRP結合溶液中0 ng/ml溶液一起進行2倍稀釋，制備出含有100 ng/ml - 0.048 ng/ml的IgG標準試樣。將標準試樣和零含量試樣分配入孔中，達到最終容積50 U 1/孔。將平板在平板搖床上室溫下培育1 hr。
將平板轉移至Luminoskan平板光度計。無需除去結合溶液，通過依序注射100 yl的引發劑溶液產生發光，并且和讀取各個孔的累積強度持續5秒。繪制得到的測定結果如圖2所示。該測定法允許在全程測試的整個期間用超過零信號的零+ 2標準偏差的最低校準進行定
實施例14.通過使用標記的磁性微粒物進行微粒物免疫測定。取50 !ig的9,10-二氫化吖啶反應物和實施例11中制得的抗體共標記的磁性微粒物。顆粒物用IX PBS + 0.05 %吐溫-20洗滌三次，并且再懸浮于綿羊抗小鼠IgG F(ab')2 -HRP結合物在含有1% BSA和1%蔗糖的IX PBS緩沖液中以1: 1.2 x 106比例稀釋的稀釋液中。將該顆粒懸浮液分配入白色聚苯乙烯96孔板上26個孔中。通過在孔中進行2倍連續稀釋至最后濃度100 ng/ml-0.048 ng/ml或0 ng/ml，制備出綿羊抗小鼠IgG F(ab')2 - HRP結合物溶液的IgG 標準試樣。將各個標準試樣和零試樣分配入孔中，使得最終的反應物體積為50 ul/孔。將平板在搖床上室溫下培育1 hr。
將平板轉移至Luminoskan平板光度計。無需除去結合物溶液，通過依序注射100 ul的引發劑溶液產生發光，并且讀取各個孔的累積強度持續5秒。繪制得到的測定結果，使IgG
實施例15.通過使用標記的安伯來特微粒物進行微粒物免疫測定。
取100 ug的9,10-二氫化吖啶反應物和實施例10的抗體共標記的安伯來特微粒物。顆粒物用IX PBS + 0.05 %吐溫-20洗滌三次，并且再懸浮于在含有1% BSA和1%蔗糖的IX PBS緩沖液中以1:1.2 xl(^的比例稀釋的綿羊抗小鼠IgGF(ab')2-HRP結合物稀釋液。將該顆粒懸浮液分配入白色聚苯乙烯96孔板上26個孔中。通過在孔中進行2倍連續稀釋至終濃度 100 ng/ml-0.048 ng/ml或0 ng/ml，制備出綿羊抗小鼠IgG F(ab')2 - HRP結合物溶液的IgG標準試樣。將各個標準試樣和零試樣分配入孔中，使得最終的反應物體積為50 ul/孔。將平板在搖床上室溫下培育1 hr。
將平板轉移至Luminoskan平板光度計。無需除去結合物溶液，通過依序注射100 iU的引發劑溶液產生發光，并且讀取各個孔的累積強度持續5秒。繪制得到的測定結果，使IgG 定量。
實施例16.制備用9,10-二氫化吖啶標記的羧基修飾的微粒物。
通過根據實施例11中所述程序的EDC偶聯，將具有0.0282毫當量/g的羧基載荷的羧酸修飾的聚苯乙烯l ym微粒物(Seradyn)結合于化合物5。用0.39 mg的化合物5 (0.74 y mol)處理52.5 mg部分的顆粒物(1.48 umolCOOH)，以保證未反應的COOH基團被保留。通過在pH 4的MES緩沖液中的EDC偶聯，將游離的COOH基偶聯于綿羊抗小鼠IgG (1.48 ymol)。通過使用離心柱，用吐溫-PBS緩沖液洗滌除去未反應的抗體。
權利要求
1. 一種用于在分析程序中檢測樣品中分析物的方法，其包含a)提供含有或者疑似含有分析物的樣品和在其上固定有下述物質的固體支持物1)化學發光化合物，以及2)所述分析物的第一特異性結合伴侶；b)使所述樣品和所述固體支持物接觸以使所述分析物結合于所述被固定的所述分析物的特異性結合伴侶；c)提供過量的活化劑化合物結合物，所述結合物包含或者與所述分析物的第二特異性結合伴侶結合、或者與所述分析物結合的活化劑化合物；d)允許所述活化劑化合物結合物經受特異性結合配對反應，由此使所述活化劑化合物結合物的第一部分近似于所述被固定的化學發光化合物，其中所述活化劑化合物結合物的第二部分不經受特異性結合配對反應且并不近似于所述被固定的化學發光化合物，以及其中所述近似于所述被固定的化學發光化合物的所述活化劑化合物結合物的部分激活所述被固定的化學發光化合物的一部分；e)提供引發劑溶液，以便由所述化學發光化合物的激活部分產生化學發光；f)檢測所產生的化學發光；以及g)將產生的化學發光與所述樣品中分析物的存在、位置或含量關聯起來。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，在添加所述引發劑溶液以產生化學發光之前，不除去不與所述被固定的化學發光化合物近似的所述活化劑化合物結合物的第二部分。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，在添加所述引發劑溶液以產生化學發光之前，除去不與所述被固定的化學發光化合物近似的所述活化劑化合物結合物的第二部分。
4. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述活化劑化合物選自于過渡金屬鹽及絡合物、過氧化物酶、以及含過渡金屬酶中的至少一種，其中所述過渡金屬選自于鐵、銅、鈷、鋅、錳和鉻中的至少一種。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述引發劑溶液是含有過氧化物的水溶液。
6. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述固體支持物選自于微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素試驗條、紙測試條、塑料試驗條、膠乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子以及磁性粒子。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，當存在所述活化劑和引發劑溶液時，所述化學發光化合物能夠被氧化而產生化學發光，并且含有化學發光部分和將所述化學發光部分連接于所述固體支持物的連接部分，其中所述化學發光部分選自于氨基苯二酰一肼、異氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基異氨基苯二酰一肼、氨基己基乙基異氨基苯二酰一肼、7-二甲基氨基萘-1,2-二羧酸酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-l,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羥基鄰苯二甲酰肼、6-羥基鄰苯二甲酰肼、9,10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶硫酯、9,10-二氫化吖啶氨磺酰、以及具有下述式I的基團其中，R1、 112和113是含有1到50個非氫原子的有機基團，R、RH中的每一個是氫或無干擾性取代基，其中基團R'-R11中至少一個含有所述連接部分。
8. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述化學發光化合物被共價連接于所述固體支持物。
9. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述化學發光化合物被共價連接于固定在所述固體支持物上的輔助物質。
10. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述化學發光化合物被共價連接于固定在所述固體支持物上的特異結合性配對成員。
11. 如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述測定法是免疫測定法。
12. 如權利要求ll所述的方法，其特征在于，所述免疫測定法是夾心免疫測定法。
13. 如權利要求1所述的方法，i其特征在于，所述測定法是核酸雜交測定法，其中所述分析物是耙核酸，所述第一特異性結合伴侶是與所述標靶第一區域互補的核酸，所述活化劑化合物結合物是被結合于與所述標靶第二區域互補的核酸的活化劑化合物。
14. 一種用于在分析程序中檢測樣品中分析物的方法，其包含a)提供含有或者疑似含有分析物的樣品和在其上固定有下述物質的固體支持物1)化學發光化合物，其含有化學發光部分和將所述化學發光部分連接于所述固體支持物的連接部分，其中，所述化學發光部分具有下述式I:<formula>formula see original document page 4</formula>其中，R1、 112和113是含有1到50個非氫原子的有機基團，R^R"中的每一個是氫或無干擾性取代基，其中基團R'-R"中的至少一個含有所述連接部分，以及 2)所述分析物的第一特異性結合伴侶；b) 使所述樣品和所述固體支持物接觸以使所述分析物結合于所述被固定的所述分析物的特異性結合伴侶；c) 提供過量的活化劑化合物結合物，所述結合物包含或者與所述分析物的第二特異性結合伴侶結合、或者與所述分析物結合的活化劑化合物，其中所述活化劑化合物是過氧化物酶；d) 允許所述活化劑化合物結合物經受特異性結合配對反應，由此使所述活化劑化合物結合物的第一部分近似于所述被固定的化學發光化合物，其中所述活化劑化合物結合物的第二部分不經受特異性結合配對反應且并不近似于所述被固定的化學發光化合物，以及其中所述近似于所述被固定的化學發光化合物的所述活化劑化合物結合物的部分激活所述被固定的化學發光化合物的一部分；e) 在無需除去所述活化劑化合物結合物的第二部分的情況下，提供引發劑溶液以便由所述化學發光化合物的激活部分產生化學發光，其中所述引發劑溶液是含有過氧化物的水溶液;f) 檢測所產生的化學發光；以及g) 將產生的化學發光與所述樣品中分析物的存在、位置或含量關聯起來。
15. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，在添加所述引發劑溶液以產生化學發光之前，不除去不與所述被固定的化學發光化合物近似的所述活化劑化合物結合物的第二部分。
16. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，在添加所述引發劑溶液以產生化學發光之前，除去不與所述被固定的化學發光化合物近似的所述活化劑化合物結合物的第二部分。
17. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述活化劑化合物選自過渡金屬鹽及絡合物、過氧化物酶、以及含有過渡金屬酶中的至少一種，其中所述過渡金屬選自鐵、銅、鈷、鋅、錳和鉻中的至少一種。
18. 如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述引發劑溶液是含有過氧化物的水溶液。
19. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述固體支持物選自微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素試驗條、紙測試條、塑料試驗條、膠乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子以及磁性粒子。
20. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，當存在所述活化劑和引發劑溶液時，所述化學發光化合物能夠被氧化而產生化學發光，并且含有化學發光部分和將所述化學發光部分連接于所述固體支持物的連接部分，其中所述化學發光部分選自氨基苯二酰一肼、異氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基異氨基苯二酰一肼、氨基己基乙基異氨基苯二酰一肼、7-二甲基氨基萘-1,2-二羧酸酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-l,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羥基鄰苯二甲酰肼、6-羥基鄰苯二甲酰肼、9,10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶硫酯、9,10-二氫化吖啶氨磺酰、以及具有下述式I的基團其中，R1、 W和W是含有1到50個非氫原子的有機基團，R^R"中的每一個是氫或無干擾性取代基，其中基團R'-R11中的至少一個含有所述連接部分。
21. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述化學發光化合物被共價連接于所述固體支持物。
22. '如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述化學發光化合物被共價連接于固定在固體支持物上的輔助物質。
23. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述化學發光化合物被共價連接于固定在所述固體支持物上的特異結合性配對成員。
24. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述測定法是免疫測定法。
25. 如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述免疫測定法是夾心免疫測定法。
26. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述測定法是核酸雜交測定法，其中所述分析物是標靶核酸，所述第一特異性結合伴侶是與所述標靶第一區域互補的核酸，所述活化劑化合物結合物是被結合于與所述標靶第二區域互補的核酸的活化劑化合物。
27. —種用于在分析程序中檢測樣品中分析物的方法，其包含a)提供含有或者疑似含有分析物的樣品和在其上固定有下述物質的化學發光標記的固體1) 化學發光化合物，以及2) 所述分析物的第一特異性結合伴侶，其中所述化學發光標記的固體支持物是通過固體支持物與具有下述式II的化合物的反應而制備的-其中，M是堿金屬離子，b) 使所述樣品和所述化學發光標記的固體支持物接觸，以使分析物結合于所述被固定的所述分析物的特異性結合伴侶；c) 提供過量的活化劑化合物結合物，所述結合物包含或者與所述分析物的第二特異性結合伴侶結合、或者與所述分析物結合的過氧化物酶；d) 允許所述活化劑化合物結合物經受特異性結合配對反應，由此使所述活化劑化合物結合物的第一部分近似于所述被固定的化學發光化合物，其中所述活化劑化合物結合物的第二部分不經受特異性結合配對反應且并不近似于所述被固定的化學發光化合物，以及其中所述近似于所述被固定的化學發光化合物的所述活化劑化合物結合物的部分激活所述被固定的化學發光化合物的一部分；支持物:e) 在無需除去所述活化劑化合物結合物的所述第二部分的情況下，提供引發劑溶液從而由所述化學發光化合物的激活部分產生化學發光，其中所述引發劑溶液是含有過氧化物的水溶液；f) 檢測所產生的化學發光；以及g) 將所產生的化學發光與所述樣品中分析物的存在、位置或含量關聯起來。
28. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，在添加所述引發劑溶液以產生化學發光之前，不除去不與所述被固定的化學發光化合物近似的所述活化劑化合物結合物的第二部分。
29. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，在添加所述引發劑溶液以產生化學發光之前，除去不與所述被固定的化學發光化合物近似的所述活化劑化合物結合物的第二部分。
30. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述活化劑化合物選自過渡金屬鹽及絡合物、過氧化物酶、以及含有過渡金屬的酶中的至少一種，其中所述過渡金屬選自鐵、銅、鈷、鋅、錳和鉻中的至少一種。
31. 如權利要求30所述的方法，其特征在于，所述引發劑溶液是含有過氧化物的水溶液。
32. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述固體支持物選自微孔板、試管、樣品杯、塑料微球、纖維素試驗條、紙測試條、塑料試驗條、膠乳粒子、聚合物粒子、二氧化硅粒子以及磁性粒子。
33. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，當存在所述活化劑和引發劑溶液時，所述化學發光化合物能夠被氧化而產生化學發光，并且含有化學發光部分和將所述化學發光部分連接于所述固體支持物的連接部分，其中所述化學發光部分選自于氨基苯二酰一肼、異氨基苯二酰一肼、氨基丁基乙基異氨基苯二酰一肼、氨基己基乙基異氨基苯二酰一肼、7-二甲基氨基萘-l,2-二羧酸酰肼、蒽-2,3-二羧酸酰肼、菲-l,2-二羧酸酰肼、芘二羧酸酰肼、5-羥基鄰苯二甲酰肼、6 -羥基鄰苯二甲酰肼、9,10-二氫化吖啶酯、9,10-二氫化吖啶硫酯、9,10-二氫化吖啶氨磺酰、以及具有下述式I的基團<formula>formula see original document page 7</formula>其中，R1、 112和113是含有1到50個非氫原子的有機基團，R^R"中的每一個是氫或無干擾性取代基，其中基團W-R11中的至少一個含有所述連接部分。
34. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述化學發光化合物被共價連接于所述固體支持物。
35. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述化學發光化合物被共價連接于固定在固體支持物上的輔助物質。
36. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述化學發光化合物被共價連接于固定在固體支持物上的特異結合性配對成員。
37. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述測定法是免疫測定法。
38. 如權利要求37所述的方法，其特征在于，所述免疫測定法是夾心免疫測定法。
39. 如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述測定法是核酸雜交測定法，其中所述分析物是標靶核酸，所述第一特異性結合伴侶是與所述標靶第一區域互補的核酸，所述活化劑化合物結合物是被結合于與所述標耙的第二區域互補的核酸的活化劑化合物。
全文摘要
公開了與特異性結合反應有關的測定方法，其與已知方法相比更簡單化。能夠產生化學發光的化合物被固定在固體支持物上，作為用于捕獲樣品中分析物的特異性結合配對成員。可以激活所述化學發光化合物并且被結合于特異結合性配對成員的活化劑化合物被過量地與樣品一起添加至所述固體支持物。在活化劑結合物已經特異性地結合的位點，引發劑溶液的添加引起化學發光反應。該測定方法被稱為非分離式測定法，因為在檢測步驟之前，不需要除去或者分離過量的檢測標簽(活化劑結合物)。該方法適用于多種類型的測定，包括免疫測定、受體-配體測定和核酸雜交測定。
文檔編號G01N21/76GK101473216SQ200780022839
公開日2009年7月1日申請日期2007年5月7日優先權日2006年5月9日
發明者H·阿哈萬-塔夫狄申請人:貝克曼考爾特公司

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