脂蛋白傳感器的制作方法

專利名稱：脂蛋白傳感器的制作方法
脂蛋白傳感器
本發明涉及乙二醇醚在傳感器中的用途。具體地，本發明涉及乙二醇 醚在生物傳感器中的用途，該生物傳感器在與膽固醇中的高密度脂蛋白具 有最小相互作用的條件下，選擇性地增溶膽固醇中的低密度脂蛋白
(LDL)，由此可以檢測LDL。
膽固醇在正常身體功能中扮演重要角色。它對細胞組織的發育、細胞 膜的再生、激素起作用，并提供其它功能。然而，血液中高水平的膽固醇 增加冠心病的風險，冠心病可以導致心臟病發作。另外，己知它與增大的 中風風險相關。患有高水平血液膽固醇的患者被認為患有高膽固醇血癥。
身體中存在兩個主要的膽固醇來源。第一個主要來源是來自身體本 身。另一個主要來源是來自食物，諸如肉類、家禽、魚和乳制品。飽和脂 肪高的食物促進身體增加膽固醇的產生。
通過特定載體，己知為脂蛋白，將膽固醇傳遞到和傳遞出細胞。這是 因為它在血液中是不可溶的。存在兩種主要類型的脂蛋白。它們是低密度 脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。已知LDL是"壞的"膽固醇載 體形式；而已知HDL是"好的"膽固醇載體形式。LDL膽固醇傾向于在 動脈內壁中堆積，導致能阻塞動脈的斑塊沉積，從而引起增大的心臟病發 作或中風風險。血液中理想的LDL膽固醇水平是約100mg/dl。較高的水 平(高于160mg/dl)表示增大的心臟病風險。
認為HDL膽固醇保護身體以避免所述增加的心臟病風險。認為HDL 將膽固醇運出動脈，并返回到肝。另外，HDL還可以從動脈中己經存在的 斑土夾沉積中去除過量的膽面醇。
因此，已經盡力開發能夠區別血液中LDL膽固醇和HDL膽固醇的量 的傳感器。
傳統地，利用差速超速離心法確定低密度脂蛋白中膽固醇的量。然而， 這需要特殊的設備，且會花費很長時間來獲得所需的測量。 更近期，開發了更易于使用并提供更可靠結果的傳感器。這樣的傳感 器一般稱為生物傳感器。
生物傳感器是將生物化學識別成分或傳感要素與物理轉換器組合的 分析工具。它們在如個人健康監控、環境篩選和監控、生物過程監控以及 在食品和飲料工業內的不同領域中具有廣泛的應用。
生物傳感要素可以是酶、抗體、DNA序列或甚至是微生物。生物化學
成分用于選擇性催化反應或促進結合作用。生物化學識別作用的選擇性容 許生物傳感器在復雜樣品基質，即體液中的操作。所述轉換器將生物化學 作用轉化為可測量的信號，由此提供用于檢測它的方法。可測量的作用涵 蓋從光譜的變化到生物化學絡合作用時的質量變化，其中所述光譜的變化 是由于酶反應產物/底物的產生或消耗。通常，轉換器采用許多形式，且它 們指示將要測量的物理化學參數。因此，轉換器可以是基于光學的，測量 如光學吸收、熒光或折射率的變化。它可以是基于質量的，測量與生物來 源的結合反應相伴的質量變化。另外，它可以是基于熱的(測量焓(熱) 的變化)或基于阻抗的(測量電性質的變化)，其伴隨著分析物/生物-識別 層相互作用，或是基于電化學的。
生物傳感器提供分布式測量的方便性和簡易性，即，使該檢驗實現關 注或護理目的的潛能。適當設計和制造的生物傳感器裝置可以方便地大規 模生產。然而，生物傳感器的使用存在若干限制。這些限制包括轉換器對 于結垢和干擾的易損性。
基于酶的生物傳感器廣泛用于檢測臨床、環境、農業和生物技術應用 中的分析物。在人體的流體的臨床檢驗中可以測量的分析物包括，例如葡 萄糖、乳酸、膽固醇、膽紅素和氨基酸。這些分析物在生物流體，如血液 中的水平對于疾病的診斷和監控是重要的。
將通常在基于酶的系統中使用的傳感器提供為為了護理目的或非處 方可出售的裝置。它們可以用于測試新鮮未改性的全手指采血樣品，從而
在將樣品加入到裝置后的例如]-2分鐘內(注意該時間是不固定的且可以 進行顯著的變化)，確定全部膽固醇、甘油三酸酯、HDL和LDL的濃度。 臨床上證明了這4種參數，結合起來，為成年人心臟病的風險提供非常好 的適應證。眾所周知，高膽固醇是無癥狀的。因此，建議每位成年人應該
進行測試以評估其風險。如果發現其風險高，則通過單獨地正確控制飲食， 或與治療藥物相結合，可以顯著減少所述風險。
在這樣一種基于酶的生物傳感器的一個實例中，利用電化學檢驗以檢 測所討論的分析物。該用途是由介體氧化態的改變造成的，所述介體與酶 相互作用，所述酶與待確定的分析物反應。選擇介體的氧化態，以使該氧 化態僅處于這樣的狀態，所述狀態將在添加底物時與酶相互作用。分析物 通過酶與介體反應。這引起該介體被氧化或被還原(根據酶反應)，并且 可以通過確定電化學信號，例如在給定電壓下產生的電流，測量介體水平 中的這種改變。
可以使用常規微電極，典型地具有工作微電極和參比電極。工作電極
通常由鈀、鉬、金或碳構成。對電極典型地是碳、Ag/AgCl、 Ag/Ag2S04、 鈀、金、鉬、Cu/CuS04、 Hg/HgO、 Hg/HgCl2、 Hg/HgS04或Zn/ZnS04。
工作電極可以位于形成所述微電極的容器孔中。其中可以使用的微電 極實例是WO03/097860中公開的那些，將其全部內容通過參考結合于此。
現有技術教導了許多檢測樣品如血液、血清或血漿中LDL膽固醇的 方法。這些用于檢測膽固醇濃度的現有技術方法中的許多是基于多種性 質，如顏色變化的評估。
EP 1 434 054, WO 03/102596和JP 2004-354284公開了使用聚乙二醇 醚的生物傳感器。美國專利號6 762 062公開了用于確定低密度脂蛋白中 的膽固醇的方法。該方法是基于測量樣品中的膽固醇總水平和非LDL級 分(HDL， VLDL和乳糜微粒)中的膽固醇水平為基礎。然后可以通過簡 單地從一個量中減去另一個量而確定LDL膽固醇的量。美國專利號6 342 364和JP2001-343348也公開了基于電化學電池的使用的LDL檢測系統。
因此，擁有能夠簡單使用但產生一致可靠結果且不需要顏色的變化作 為檢測方法部分的檢測系統將是有利的。
按照本發明的第一方面，提供了生物傳感器，其包括含有生tH七學分 析物的底物、酶系統、低分子量乙二醇醚和檢測工具。
典型地，所述底物是生物流體，如血液或血漿。從所述生物流體中確 定的生物化學分析物可以是脂蛋白，通常是低密度脂蛋白。
所述酶系統可以包含膽固醇酶，如膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或膽固
醇脫氫酶。
所述低分子量乙二醇醚可以選自具有1-4個重復的直鏈或支鏈垸撐二 醇基團的組，通常所述亞垸基是1,2-亞乙基、1，2-亞丙基及其異構體、亞 丁基及其異構體、亞戊基(pentylene)及其異構體，或其組合。乙二醇醚可 以被垸基，如CrC5垸基取代。低分子量乙二醇醚可以選自2-甲氧基乙醇、 三丙二醇甲基醚、二甘醇丙基醚、二甘醇丁基醚、二甘醇戊基醚、1-甲氧 基_2-丙醇、雙丙甘醇丁基醚、三丙二醇丁基醚、甘油乙氧基化物-共-丙氧 基化物三元醇、新戊二醇乙氧基化物、丙氧基乙醇(propxyethanol)、三甘 醇甲基醚、丙二醇丙基醚、l-叔-丁氧基-2-丙醇、雙丙甘醇丙基醚、三丙二 醇丙基醚或雙丙甘醇叔-丁基醚。
生物傳感器可以進一步包括水性緩沖溶液。該緩沖溶液典型地具有 pH5-10。更優選地，pH范圍可以是7-10。
可以增大生物傳感器溶液的離子強度或鹽強度，以便改善對低密度脂 蛋白的選擇性。離子強度可以通過添加鹽而增大，所述鹽選自由下列各項 組成的組氯化鉀、硫酸鎂、氯化六胺釕、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯 化鑭、硫酸鈉或硫酸鎂。
所述檢測工具可以是以電化學電池的形式。
按照本發明的第二方面，提供用于測量樣品中生物化學分析物的量的
檢測系統，其包括下列步驟
a) 提供低分子量乙二醇醚的溶液和酶混合物的混合物；
b) 加入待測樣品的溶液；
c) 在產生可測量信號變化的條件下培育所得到的混合物；
d) 測量所得到的變化；和
e) 利用校準曲線在原始樣品中確定分析物的量或確定HDL和LDL 之間的差別。
所述分析物可以是低密度脂蛋白。
典型地，所述可測量的信號是電化學信號、比色信號、熱信號、壓電 信號或光譜信號。
可以在使用前干燥生物分析物和試劑。可以冷凍干燥分析物和試劑。 按照本發明的第三方面，提供低分子量乙二醇醚用于增溶生物化學分
析物的用途。
低分子量乙二醇醚可以選自具有1-4個重復的直鏈或支鏈烷撐二醇基 團的組，通常所述亞烷基是1,2-亞乙基、1,2-亞丙基及其異構體、亞丁基 及其異構體、亞戊基及其異構體，或其組合。乙二醇醚可以被烷基，如
d-Cs垸基取代。低分子量乙二醇醚可以選自2-甲氧基乙醇、三丙二醇甲 基醚、二甘醇丙基醚、二甘醇丁基醚、二甘醇戊基醚、l-甲氧基-2-丙醇、
雙丙甘醇丁基醚、三丙二醇丁基醚、甘油乙氧基化物-共-丙氧基化物三元 醇、新戊二醇乙氧基化物、丙氧基乙醇、三甘醇甲基醚、丙二醇丙基醚、
l-叔-丁氧基-2-丙醇、雙丙甘醇丙基醚、三丙二醇丙基醚或雙丙甘醇叔-丁
基醚。
乙二醇醚可以用于增溶脂蛋白，如低密度脂蛋白膽固醇。
在本發明的第四方面中，溶液的離子強度幫助在HDL和LDL膽固醇 之間獲得的區別。已經發現液體的離子強度或鹽濃度的改變影響這兩種膽 固醇的相對反應程度。因此，提供了鹽用于增大含有低密度脂蛋白、高密 度脂蛋白和乙二醇醚的溶液的離子強度或鹽濃度的用途，其中所述溶液離 子強度的增大調節低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的相對溶解度。
典型地，所述鹽增大離子強度或鹽濃度的用途增大了低密度脂蛋白相 對于高密度脂蛋白的溶解度。
可以通過添加的鹽控制溶液的離子強度或鹽濃度，并在實施例中將氯 化鉀、硫酸鎂或氯化六胺釕用于改變溶液的離子強度或鹽濃度。然而，可 以使用其它鹽，例如氯化鉀、硫酸鎂、氯化六胺釕、氯化鈉、氯化鈣、氯 化鎂、氯化鑭、硫酸鈉或硫酸鎂。
當用于本文時，下列定義限定所述術語
術語"二醇"指二羥基醇。術語"乙二醇醚"指二羥基醇或三羥基醇 的一垸基醚。
術語"烷基"包括直鏈或支鏈的飽和脂肪族烴。烷基的實例包括甲基、 乙基、正-丙基、正-丙基、異丙基、正-丁基、叔-丁基等。除非另外說明， 術語"烷基"包括垸基和環烷基基團。
"生物流體"是其中可以測量分析物的任何體液或體液衍生物，例如， 血、尿、間質液、血漿、皮液、汗和淚。
"電化學傳感器"是設置為經由電化學氧化或還原反應，檢測在樣品 中的分析物的存在或測量其濃度或量的裝置。
"氧化還原介體"是電子傳遞試劑，其用于在分析物或分析物還原的 酶或分析物氧化的酶、輔因子或其他氧化還原活性種和電極之間，直接地 或經由一種或多種另外的電子傳遞試劑運送電子。
除非另外指出，術語"參比電極"包括以下二者a)參比電極和b) 還可以作為對電極起作用的參比電極(即，對電極/參比電極)。
除非另外指出，術語"對電極"包括以下二者a)對電極和b)還可 以作為參比電極起作用的對電極(即，對-參比電極)。
術語"可測量的信號"意指可以容易地測量的信號，如電流、電壓、
熒光、吸收光譜、發光、光散射、NMR、 IR、質譜、熱交換或壓電改變。
術語"生物化學分析物"包括任何可以在生物流體中存在的可測量的
化學或生物化學物質，且還包括任何的酶、抗體、DNA序列或微生物。
可以按照本發明使用的已知生物傳感器可以由例如具有4個試劑孔和 1個共同參考的條帶組成；其中每個孔具有其自身的微帶工作電極，如管 狀微帶電極。通過干燥不同的，具體而言是配制的試劑而提供所述條帶的 傳感組分，所述試劑包括至少一種酶和在每個孔中與試樣中的特定分析物 相互作用的介體。由于，潛在地，可以向每個孔添加和干燥不同的試劑， 所以顯然可以利用單一試樣完成多分析物的測試。孔的數量是可變的，因 而特定測試的數量也是可變的，例如可以使用利用l-6孔的傳感器。
可以使用常規微電極，典型地具有工作微電極和參比電極。工作電極 通常由鈀、鉬、金或碳構成。對電極典型地是碳、Ag/AgCl、 Ag/Ag2S04、 鈀、金、鉑、Cu/CuS04、 Hg/HgO、 Hg/HgCl2、 Hg/HgS04或Zn/ZnS04。
在優選的微電極中，工作電極位于形成所述微電極的容器中。可以按 照本發明使用的微電極實例是WO2003097860中公開的那些。
現僅參考下列附圖，通過實施例描述本發明的實施方案，其中

圖1和2圖解說明了當使用二甘醇一戊基醚時優先于HDL而選擇性 增溶LDL所獲得的結果(實施例l)。
圖3和4圖解說明了當使用二甘醇一丁基醚時優先于HDL而選擇性 增溶LDL所獲得的結果(實施例1)。
圖5顯示來自實施例2的結果。(其中E2C4是二甘醇丁基醚)。每個 時間點的梯度用于計算由LDL和HDL的測量所獲得的％差別。
圖6顯示來自實施例3的結果。每個時間點的梯度用于計算由LDL 和HDL的測量所獲得的％差別。
圖7顯示來自實施例4的結果。每個時間點的梯度用于計算由LDL 和HDL測量所獲得的％差別。
圖8顯示來自實施例5的結果。在第一時間點的梯度用于計算在LDL 和HDL的測量之間所獲得的％差別。
圖9顯示來自實施例6的結果。每個時間點的梯度用于計算在LDL 和HDL的測量之間所獲得的％差別。
圖10顯示來自實施例7的結果。每個時間點的梯度用于計算在LDL 和HDL的測量之間所獲得的％差別。
圖11 a-d顯示來自實施例8的第一個時間點0秒的結果。每個時間點 的梯度用于計算在LDL和HDL之間所獲得的％差別。
圖12顯示利用E2C4，血漿LDL (實心圓圈)和HDL (空心圓圈) 的差別(實施例9)。
圖13顯示利用P2C4，血漿LDL (實心圓圈)禾卩HDL (空心圓圈) 的差別(實施例9)。
圖14顯示用于計算LDL和HDL的測量之間％差別的每個時間點的梯 度(實施例10)。
實施例1
LDL緩沖液#1 (Tris緩沖液-5%甘氨酸PH9.0)
將Trizma Pre-Set Crystals, pH9.0 (Sigma(西格瑪)，T-1444)溶解在 950ml dH20 (dH20 -去離子水)中，并記錄pH。隨后，將50g甘氨酸 (Sigma(西格瑪),G-7403)加入到該tris緩沖液中，并記錄pH。利用IOM氫 氧化鉀(Sigma(西格瑪),P-5958)將pH調節到8.8-9.2之內，并且用dH20將 該溶液制備為1000ml，并記錄最終的pH (pH9.1)。將該溶液保存在4"。
乙二醇醚溶液
利用LDL緩沖液#1制備兩倍強度的乙二醇醚溶液。
二甘醇一戊基醚(Sigma-Aldrich(西格瑪-奧德里奇),32285) 大約2.5% C0.0218g在872^1 LDL緩沖液#1中) 二甘醇一丁基醚(Sigma-Aldrich(西格瑪-奧德里奇)，537640) 大約10% (0.0640g在640|ul LDL緩沖液#1中)
Scipac LDL和HDL樣品
利用脫脂質的血清(Scipac, S 139)，將LDL(Scipac， P232-8)和 HDL(Scipac, P233-8)樣品制成10倍所需濃度(由于在最終測試混合物中的 1:10的稀釋)。然后利用空間臨床分析儀(Space clinical analyzer) (Schiappanelli Biosystems Inc )分析該樣品。
酶混合物
利用LDL緩沖液#1將酶混合物制成2倍強度 160mM氯化六胺釕(m)(阿法埃莎(Alfa Aesar), 10511) 17.7mM硫代煙酰胺腺嘌吟二核苷酸(東方酵母公司(Oriental Yeast Co))
8.4mg/ml假單孢氧還蛋白還原酶(生物催化劑(Biocatalysts)) 6.7mg/ml膽固醇酯酶(Sorachim/Toyobo， COE-311) 44.4mg/ml膽固醇脫氫酶，無明膠(安滿能(Amano), CHDH-6)
測試方案
將9^1兩倍強度的1,2-乙二醇溶液與9^il酶混合物相混合。在T=-30 秒時，將2pl樣品(10倍濃縮的LDL或HDL，或脫脂質血清)與所得到 的乙二醇醚酶混合物混合，將9pl所得到的溶液置于電極上。在T-0秒 時，啟動計時電流分析試驗。在0.15mV，在5個時間點(10，32，63, 90和 110秒)測量氧化電流，在-0.45mV，在最終時間點測量還原電流。將每個 樣品一式兩份進行試驗。
分析
連同由空間分析儀獲得的LDL、 HDL和脫脂質血清濃度一起分析這 些數據。將每個時間點的HDL和LDL響應的梯度用于計算由LDL和HDL 的測量所獲得的％差別。
圖1和2圖解說明了當使用二甘醇一戊基醚時所獲得的優于HDL的 選擇性增溶LDL的結果。
圖3和4圖解說明了當使用二甘醇一丁基醚時所獲得的優于HDL的 選擇性增溶LDL的結果。
結論
二甘醇一丁基醚(5%)顯示出對LDL〉35Y。的優先差別。二甘醇一戊 基醚(1.25%)也顯示出對LDL的優先差別，但是達到> 20%的較小程度。
實施例2:健贊(Genzyme)膽固醇酯酶對比健贊(Genzyme)脂肪酶 溶液
RuAcAc = [Rum(acac)2(py-3-COOH)(py-3-COO)]
30mM Ruacac溶液是利用含有0.1M KC1， Tris pH 9.0， 5%甘氨酸的緩 沖液制成的。
二甘醇丁基醚溶液10%乙二醇醚溶液是利用RuAcac溶液制成的。
酶混合物是利用Ruacac溶液制成的 17.7mM硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 8.4mg/ml假單孢氧還蛋白還原酶 6.7mg/ml膽固醇酯酶或6.7mg/ml脂肪酶 44.4mg/ml膽固醇脫氫酶，無明膠
利用脫脂質血清(Scipac, S139)，制備LDL(Scipac， P232-8)和 HDL(Scipac, P233-8)樣品。然后利用空間臨床分析儀(Schiappanelli Biosystems Inc)分析該樣品。
測試方案
將9^1兩倍強度的乙二醇醚溶液(或不含乙二醇醚的Ruacac溶液)與 9pl酶混合物混合。在T^30秒時，將2^1樣品(LDL或HDL，或脫脂質 血清)與所得到的乙二醇醚酶混合物混合，并且將9pl所得到的溶液置 于電極上。該電極記述在WO200356319中。在丁=0秒時，啟動計時電流 分析試驗。在0.15mV，在7個時間點(O, 28, 56, 84, 112, 140和168秒)測 量氧化電流，在-0.45mV，在最終時間點測量還原電流。將每個樣品一式 兩份測試。
結果
其中E2C4是二甘醇丁基醚。
每個時間點的梯度用于計算由LDL和HDL的測量所獲得的％差別， 并顯示在圖5中。
結論
在5%二甘醇丁基醚的存在下，利用膽固醇酯酶或脂肪酶賦予LDL在 酶混合物上的差別，盡管在利用膽固醇酯酶的條件下，對LDL的差別是 最高的。
這些數據表明使用脂肪酶引起的差別通過添加二甘醇丁基醚，從HDL 差別轉換為LDL差別。這顯示出二甘醇丁基醚具有比膽固醇酯水解酶更 強的對LDL差別的影響。
實施例3:確定選擇性增溶LDL的二甘醇丁基醚的最佳濃度
本實驗的目的是滴定二甘醇一丁基醚，從而為了檢測LDL的目的， 確定在與HDL具有最小相互作用的條件下選擇性增溶LDL的最佳濃度。
溶液
RuAcAc溶液30mM RuAcac是利用含有Tris pH9.0， 10%蔗糖和0.1M KC1的緩沖液制成的。
在上述Ruacac溶液中將乙二醇醚溶液制成為12%， 10%， 8% , 6%, 4% 和2%二甘醇丁基醚。
酶混合物(含有膽固醇酯酶)和LDL和HDL樣品是按照與實施例2 中相同的配方制成的。
方法
按照試驗2中所述的方法進行該試驗和分析。
結論
隨著二甘醇丁基醚濃度的增加，對LDL的響應梯度增大。這導致對 LDL的差別在6%二甘醇丁基醚時是最高的。
實施例4:確定對選擇性增溶LDL的雙丙甘醇丁基醚的最佳濃度
本實驗的目的是改變雙丙甘醇一丁基醚的濃度，從而為了檢測LDL 的目的，確定在與HDL具有最小相互作用的條件下選擇性增溶LDL的最 佳濃度。
溶液
如實施例2中所述制備30mM Ruacac緩沖液，酶溶液(含有膽固醇酯 酶)和HDL或LDL Scipac樣品。
乙二醇醚溶液是通過在前述Ruacac溶液中使用3.5%, 3%， 2.5%. 2%. 1.5%和1%雙丙甘醇丁基醚制成的。
方法
如實施例2所述進行該試驗。將結果顯示在圖7中。
結論
因為雙丙甘醇丁基醚濃度增加，所以獲得了對LDL響應様度的增加。 這導致對LDL差別的增加。在1.5和1.75%雙丙甘醇丁基醚，獲得最高差 別。
實施例5:確定顯示對LDL增加的選擇性的試劑
本實驗的目的是為了檢測LDL的目的而確定在與HDL具有最小相互 作用的條件下顯示出對LDL的選擇性的試劑。
溶液
乙二醇醚溶液每種乙二醇醚溶液是利用Tris緩沖液，pH9.0， 5%甘 氨酸制成的。下列量生成兩倍強度的乙二醇醚溶液。請注意，由于稱重上 的微小變化，百分比僅為近似值
2-甲氧基乙醇(Aldrich(奧德里奇)185469)
10% (0.0477g在477pl緩沖液中)
三甘醇甲基醚(Fluka 90450)
10% (100(il + 900(il緩沖液)
二甘醇丙基醚(Aldrich(奧德里奇)537667)
10% (0.0947g在947^1緩沖液中)
二甘醇丁基醚(Aldrich(奧德里奇)537640)
10% (0.0640g在640(il緩沖液中)
二甘醇戊基醚(Fluka 32285)
2.5% (0.0218g在872^1緩沖液中)
l-甲氧基-2-丙醇(AWrich(奧德里奇)65280)
10% (0.0459g在459|ul緩沖液中)
雙丙甘醇丁基醚(Aldrich(奧德里奇)388130)
2.5% (0.0121g在484^1緩沖液中)
三丙二醇甲基醚(Aldrich(奧德里奇)30,286-4)
10% (0.0463g在463|il緩沖液中)
三丙二醇丁基醚(Aldrich(奧德里奇)48,422-9)
2.5% (0.0176g在704pl緩沖液中)
甘油乙氧基化物-共-丙氧基化物三元醇(Aldrich(奧德里奇)40,918-9) 5% (0.0534g在1.068ml緩沖液中) 新戊二醇乙氧基化物(Aldrich(奧德里奇)410276) 10% (0.0619g在619pl緩沖液中)
丙二醇丙基醚(Sigma-Aldrich(西格瑪-奧德里奇)424927)
10% (0'0444g在444^1緩沖液中)
1- 叔-丁氧基-2-丙醇(Sigma-Aldrich(西格瑪-奧德里奇)433845) 10% (0.0470g在470(il緩沖液中)
雙丙甘醇丙基醚(Sigma-Aldrich(西格瑪-奧德里奇)484210) 10% (0.0458g在458pl緩沖液中)
三丙二醇丙基醚(Sigma-Aldrich(西格瑪-奧德里奇)4699CM) 10% ((X0435g在435jul緩沖液中)
雙丙甘醇叔-丁基醚(Sigma-Aldrich(西格瑪-奧德里奇)593346) 10% (0'0417g在417^1緩沖液中)
2- 丙氧基乙醇(Sigma-Aldrich(西格瑪-奧德里奇)82400) 10%(0.0444g在444pd緩沖液中)
Scipac LDL和HDL樣品LDL和HDL樣品是利用脫脂質血清制成的。 酶混合物
酶混合物是利用上述Tris緩沖液pH9.0， 5%甘氨酸制成的，其含有
160mM氯化六胺(III)釕
17.7mM硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸
8.4mg/ml假單孢氧還蛋白還原酶
6.7mg/ml膽固醇酯酶
44.4mg/ml膽固醇脫氫酶，無明膠
測試方案
將9^1乙二醇醚溶液與9^1酶混合物相混合。在T=-30秒時，將2|il 樣品(LDL， HDL，或脫脂質血清)與所得到的乙二醇醚酶混合物混合， 并且將9^1所得到的溶液置于電極上。該電極描述在WO200356319中。 在T=0秒時，啟動計時電流分析試驗。在0.15mV，在5個時間點(IO, 32, 63， 90和IIO秒)測量氧化電流，在-0.45mV，在最終時間點測量還原電流。將 每個樣品一式兩份測試。
結果
分析數據，將第一時間點的梯度用于計算在LDL和HDL的測量之間 所獲得的％差別。將結果顯示在圖8中。
實施例6: KC1滴定500-1500mM
本實驗的目的是研究在二甘醇一丁基醚存在下增大的離子強度對 LDL和HDL響應的影響。
溶液
30mM Ruacac溶液30mM RuAcac, Tris pH 9.0, 5%甘氨酸，5%二甘醇 丁基醚
在3M , 2M， 1.5M禾B 1M KC1的KC1溶液在上述Ruacac溶液中制成。
酶混合物在上述Ruacac溶液中制成 17.7mM硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 8.4mg/ml假單孢氧還蛋白還原酶 6.7mg/ml膽固醇酯酶 44.4mg/ml膽固醇脫氫酶
在脫脂質血清中制成Scipac LDL和HDL樣品。
測試方案
將9^1 KC1溶液與9^1酶混合物混合。在T=-30秒時，將2^1樣品與所；
得到的KC1:酶混合物混合，并且將9|11所得到的溶液置于電極上。在丁=() 秒時，啟動計時電流分析試驗。在0.15mV，在7個時間點(O， 32, 64, 96， 128， 16G和192秒)測量氧化電流，在-0.45mV，在最終時間點測量還原電流。 將每個樣品一式兩份進行試驗。
分析數據，將每個時間點的梯度用于計算在LDL和HDL的測量之間 所獲得的％差別。將結果顯示在圖9中。
結論
通過增加對HDL響應的梯度，將KC1濃度增至非常高的濃度(1.5M) 減少了對LDL的差別。在500,750和1MKC1時，獲得了對LDL的高差 別。
實施例7: KCl滴定0-500mM
本實驗的目的是研究在二甘醇丁基醚存在下離子強度對LDL和HDL 響應的影響。
溶液
30mM Ruacac溶液在含有Tris pH 9.0, 5%甘氨酸，5%二甘醇丁基醚溶 液的緩沖液中制成。
KC1溶液在上述Ruacac溶液中制成1M , 500mM禾B 100 mM KC1的濃
利用Ruacac溶液將酶混合物制成兩倍強度
17.7mM硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(東方酵母公司(Oriental Yeast Co))
8.4mg/ml假單孢氧還蛋白還原酶(生物催化劑(Biocatalysts)) 6.7mg/ml膽固醇酯酶(健贊(Genzyme))
44.4mg/ml膽固醇脫氫酶，無明膠(安滿能(Amano), CHDH-6) ScipacLDL和HDL樣品在來自Scipac的脫脂質血清中制成。 測試方案
將9^il KC1溶液或Ruaeac溶液(空白)與9^酶混合物混合。在T=-30 秒時，將2pl樣品(10x濃縮的LDL或HDL，或脫脂質血清)與所得到 的KC1:酶混合物混合，并且將9pl所得到的溶液置于電極上。該電極描 述在WO200356319中。在T=0秒時，啟動計時電流分析試驗。在0.15mV， 在7個時間點(O， 32, 64, 96, 128, 160和192秒)測量氧化電流，在-0.45mV,
在最終時間點測量還原電流。將每個樣品一式兩份進行試驗。 結果
分析數據，將每個時間點的梯度用于計算在LDL和HDL的測量之間 所獲得的％差別。將結果顯示在圖10中。
結論
在0-500mM范圍內增加KCl的濃度導致隨著KCl濃度的增加對LDL 更高的差別，其原因在于對LDL響應的梯度增加。
實施例8:研究離子強度對LDL選擇性增溶的影響
本實驗的目的是為了檢測LDL的目的，通過改變氯化六胺釕介體濃 度來研究在與HDL具有最小相互作用的條件下離子強度對LDL的選擇性 增溶的影響。
溶液
含有12。/。二甘醇一丁基醚的乙二醇醚溶液是在Tris緩沖液(pH9.0, 5% 甘氨酸)中制成的。
利用Scipac脫脂質血清將Scipac LDL和HDL制成多種濃度。
利用Tris緩沖液pH9.0， 5%甘氨酸將酶混合物制成兩倍強度。
制備了 4種單獨的酶混合物，其含有80, 160, 240或480 mM氯化六胺
釕
80, 160, 240或480 mM氯化六胺釕 17.7mM硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 8.4mg/ml假單孢氧還蛋白還原酶 6.7mg/ml膽固醇酯酶 44.4mg/ml膽固醇脫氫酶，無明膠
測試方案
將9^1兩倍強度的乙二醇醚溶液與9^1酶混合物混合。在T=-30秒時， 將2ial樣品(10x濃縮的LDL或HDL，或脫脂質血清)與所得到的乙二 醇醚酶混合物混合，并且將9pl所得的溶液置于電極上(該電極描述在 WO200356319中)。在T=0秒時，啟動計時電流分析試驗。在0.15mV， 在5個時間點(O, 28， 56, 84和112秒)測量氧化電流，在-0.45mV，在最終 時間點測量還原電流。將每個樣品一式兩份進行試驗。
分析
分析數據，并且將每個時間點的梯度用于計算在LDL和HDL之間所 獲得的％差別。將第一時間點O秒的結果顯示在表圖11 a-d中。
結論
用80mM氯化六胺釕獲得對LDL最高的差別。
雖然不希望受到任何具體理論限制，但是可以假定存在的離子水平的 變化改變共溶劑對膽固醇的相對的溶劑化能力，直到離子強度或離子濃度 達到溶解度受限的水平。
實施例9:利用二甘醇丁醚或雙丙甘醇丁醚的血漿校準
本實驗的目的是研究在二甘醇一丁基醚(E2C4)或雙丙甘醇一丁基醚 (P2C4)存在下對血漿LDL和HDL的響應的響應。
溶液
KC1緩沖液Tris緩沖液pH 9.0， 5%甘氨酸，0.2M KC1 40mM Ruacac是利用上述KC1緩沖液制成的。 3M KC1溶液是在上述Ru acac溶液中制成的。
酶混合物酶混合物(無共溶劑)是利用Ruacac溶液制成的 17.7mM硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 8.4mg/ml假單孢氧還蛋白還原酶
6.7mg/ml膽固醇酯酶 44.4mg/ml膽固醇脫氫酶，無明膠
含有12%E2C4的酶混合物將0.0304g E2C4 (Sigma-Aldrich)溶解在 253pi酶混合物中。
含有3.5% P2C4的酶混合物將0.0075g P2C4 (Sigma-Aldrich)溶解在 250^1酶混合物中。
血漿樣品對冷凍血漿樣品進行至少30分鐘的解凍，隨后進行5分
鐘離心。然后利用空間臨床分析儀(Schiappanelli Biosystems Inc)分析該樣 p
叩o
湖'J試方案
對于含有E2C4的酶混合物，將1.5^1 3M KC1溶液與7.5|il酶混合物 混合。在T=-30秒時，將9^1樣品(血漿，或脫脂質血清)與所得到的KC1: 酶混合物混合，并且將9pl所得到的溶液置于電極上。在丁=0秒時，啟動 計時電流分析試驗。在0.15mV，在7個時間點(O， 32, 64, 96, 128, 160和192 秒)測量氧化電流，在-0.45mV，在最終時間點測量還原電流。將每個樣品 一式兩份進行試驗。
對于含有P2C4的酶混合物，在T=-30秒時，將9^1酶混合物與9^1 樣品(血漿，或脫脂質血清)混合。將9)il所得到的溶液置于電極上，并 在T=0秒時，如上述對E2C4啟動計時電流分析試驗。
分析
分析數據。每個時間點的梯度用于計算在LDL和HDL的測量之間所 獲得的％差別。
結果
利用E2C4，在時間^0秒時，對血漿LDL的差別是103% (圖12-由 空心圓圈表示的HDL，由實心圓圈表示的LDL)。利用P2C4，在時間，96 秒時，對血漿LDL的差別是91% (圖13-由空心圓圈表示的HDL，由實
心圓圈表示的LDL)'
結論
用E2C4或P2C4獲得了對血漿LDL的高差別。
實施例10:為了檢測LDL的目的而確定在與HDL具有最小相互作用的 條件下選擇性增溶LDL的試劑的試驗
溶液
O.IM KC1緩沖液=Tris緩沖液，pH 9.0, 5%甘氨酸，O.IM KC1 乙二醇醚溶液
利用0.1MKC1溶液制備兩倍強度的乙二醇醚溶液 二甘醇丁基醚(Aldrich "7640) 10% (0.0958g在958(^1 KC1緩沖液中)
酶混合物
利用0.1MKC1制備酶混合物，且其含有 40mM RuAcac
17.7mM硫代煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 8.4mg/ml假單孢氧還蛋白還原酶 6.7mg/ml膽固醇酯酶 44.4mg/ml膽固醇脫氫酶，無明膠
Scipac LDL和HDL樣品
利用脫脂質血漿(Sdpac, S139)制備LDL (Scipac, P232-8)和 HDL(Scipac, P233-8)樣品為10x所需濃度。然后利用空間臨床分析儀 (Schiappanelli Biosystems Inc)分析該樣品。
測試方案
將9^1乙二醇醚溶液與9^1酶混合物混合。在T=-30秒時，將2pl樣 品(LDL或HDL，或脫脂質血清)與所得到的乙二醇醚酶混合物混合， 將9pl所得到的溶液置于電極上(該電極描述在WO200356319中)。在丁=0 秒時，啟動計時電流分析試驗。在0.15mV，在5個時間點(O， 35, 63, 90, 118, 145和172秒)測量氧化電流，在-0.45mV，在最終時間點測量還原電流。 將每個樣品 一式兩份進行試驗。
分析
連同由空間分析儀獲得的LDL、 HDL和脫脂質血清的濃度一起分析 這些數據。每個時間點的梯度用于計算在LDL和HDL測量之間所獲得的 %差別。將結果顯示在圖14中。
結論
用二甘醇丁基醚獲得了對LDL的高差別。
權利要求
1. 一種生物傳感器，所述生物傳感器包括含有生物化學分析物的底物、酶系統、低分子量乙二醇醚和檢測工具。
2. 權利要求1中所述的生物傳感器，其中所述底物是生物流體，諸如血、血清或血漿。
3. 權利要求2中所述的生物傳感器，其中從所述生物流體所確定的生 物化學分析物是脂蛋白。
4. 權利要求3中所述的生物傳感器，其中所述脂蛋白是低密度脂蛋白。
5. 在前權利要求的任一項中所述的生物傳感器，其中所述酶系統含有 膽固醇酶，諸如膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。
6. 在前權利要求的任一項中所述的生物傳感器，其中所述低分子乙二 醇醚選自具有1-4個重復的直鏈或支鏈亞烷基的組。
7. 權利要求6中所述的生物傳感器，其中所述亞烷基是l，2-亞乙基、 1,2-亞丙基及其異構體、亞丁基及其異構體、或亞戊基及其異構體，或其 組合。
8. 在前權利要求的任一項中所述的生物傳感器，其中所述乙二醇醚由 烷基取代，所述垸基任選地由一個或多個垸氧基取代。
9. 權利要求8中所述的生物傳感器，其中所述垸基基團是C廣Cs垸基。
10. 權利要求6-9的任一項中所述的生物傳感器，其中將所述亞烷基 或烷基用l-4個垸氧基取代。
11. 權利要求11中所述的生物傳感器，其中所述1-4個垸氧基是1-4 個乙氧基。
12. 在前權利要求的任一項中所述的生物傳感器，其中所述低分子量 乙二醇醚是2-甲氧基乙醇、三丙二醇甲基醚、二甘醇丙基醚、二甘醇丁基 醚、二甘醇戊基醚、l-甲氧基-2-丙醇、雙丙甘醇丁基醚、三丙二醇丁基醚、 甘油乙氧基化物-共-丙氧基化物三元醇、新戊二醇乙氧基化物、丙氧基乙 醇(propxyethanol)、三甘醇甲基醚、丙二醇丙基醚、l-叔-丁氧基-l丙醇、 雙丙甘醇丙基醚、三丙二醇丙基醚或雙丙甘醇叔-丁基醚。
13. 在前權利要求的任一項中所述的生物傳感器，其中所述生物傳感 器還包括水性緩沖溶液。
14. 權利要求13中所述的生物傳感器，其中所述緩沖溶液典型地具有堿性pH。
15. 權利要求1-14的任一項中所述的生物傳感器，其中增加所述溶液 的離子強度，以便改善對低密度脂蛋白的選擇性。
16. 權利要求15中所述的生物傳感器，其中通過添加選自由下列各項組成的組中的鹽增加所述溶液的離子強度氯化鉀、硫酸鎂、氯化六胺釕、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鑭、硫酸鈉或硫酸鎂。
17. 在前權利要求的任一項中所述的生物傳感器，其中所述檢測工具 是以電化學電池的形式。
18. —種用于測量樣品中生物化學分析物的量的檢測系統，所述檢測系統包括下列步驟a) 提供低分子量乙二醇醚溶液與酶混合物的混合物；b) 加入待測樣品的溶液；c) 在引起可測量信號變化的條件下培育所得到的混合物；d) 測量所得到的變化；和e) 利用校準曲線在原始樣品中確定分析物的量或確定HDL和LDL 之間的差別。
19. 權利要求18中所述的檢測系統，其中所述分析物是低密度脂蛋白。
20. 權利要求18或19中所述的檢測系統，其中所述可測量信號是電 化學信號、比色信號、熱信號、壓電信號或光譜信號。
21. 權利要求18-20的任一項中所述的檢測系統，其中所述低分子量 乙二醇醚如權利要求6-12的任一項中所限定。
22. 權利要求18-21的任一項中所述的檢測系統，其中在使用前干燥 所述生物分析物和試劑。
23. 低分子量乙二醇醚用于增溶生物化學分析物的用途。
24. 權利要求23中所述的用途，其中所述低分子量乙二醇醚如權利要 求6-12的任一項中所限定。
25. 權利要求23或權利要求24的任一項中所限定的用途，其中所述 乙二醇醚用于增溶脂蛋白，如低密度脂蛋白膽固醇。
26. 鹽用于增加含有低密度脂蛋白、高密度脂蛋白和乙二醇醚的溶液 離子強度的用途，其中所述溶液離子強度的增加調節所述低密度脂蛋白和 所述高密度脂蛋白的相對溶解度。
27. 權利要求26中所述的用途，其中所述離子強度的增加增大了所述 低密度脂蛋白相對于所述高密度脂蛋白的溶解度。
28. 權利要求26或權利要求27的任一項中所述的用途，其中所述鹽 選自由氯化鉀、硫酸鎂、氯化六胺釕、氯化鈉、氯化鈣、氯化鎂、氯化鑭、 硫酸鈉或硫酸鎂組成的組。
29. 權利要求26-28的任一項中所述的用途，其中所述鹽的濃度在 0.1M-1M的范圍內。
30. 權利要求26-28的任一項中所述的用途，其中所述溶液的離子強 度在0.5M- 1.5M的范圍內。
全文摘要
根據本發明，提供了生物傳感器，其包括含有生物化學分析物的底物、酶系統、低分子量乙二醇醚和檢測工具。所述生物化學分析物是低密度脂蛋白。所述酶系統含有膽固醇酶，諸如膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶。
文檔編號G01N33/92GK101389766SQ200780006854
公開日2009年3月18日 申請日期2007年4月5日 優先權日2006年4月6日
發明者林迪·簡·墨菲, 赫伯特·弗蘭克·艾斯丘 申請人:牛津生物傳感器有限公司