專利名稱：：用于癌癥預后和病理分期的試劑和方法用于癌癥預后和病理分期的試劑和方法本申請要求2006年2月16日提交的美國臨時申請系列號NO.60/774,563的優先權，將其通過引用并入本文。
背景技術：
：1.發明領域本發明涉及用于評估個體中結腸直腸癌癥發展(progression)的試劑和方法。更具體地，本發明提供了用于測定或診斷癌癥的發展或病理分期(pathologicalstaging)以更精確地修整(tailor)對個體的治療的所述試劑和方法。本發明還涉及用于監測和分析生物樣品的EGFR途徑的生物標記物的任一種或信息性組合的定量表達和活化的免疫試劑和方法，所述生物標記物包括EGFR、PTEN、pHERl、pAKT、pERK、pMEK和Ki67。2.
背景技術：
：癌癥治療的基本目標是選擇性地殺死或抑制惡性細胞的不受控制的生長而不有害地影響正常細胞。傳統的化學治療藥物是高度細胞毒性的試劑，其優選的對惡性細胞具有比正常細胞更大的親和性，或至少根據惡性細胞的高細胞生長速度和代謝活性優先地影響惡性細胞。然而，證明這些試劑不是"魔術子彈"，并常常損害正常細胞以及癌細胞；相反地，某些癌癥產生出正常細胞不會產生的對所述化學治療劑的抗性。可以靶向惡性細胞并不傷害正常細胞的癌癥治療被稱為靶向治療，是癌癥化學治療的新浪潮。這種新的方法與治療實體腫瘤癌癥是特別相關的，實體腫瘤癌癥保持了需要具有較少副作用的靈活和應答性(responsive)治療的慢性病癥，它們的發展需要被研究。一般地，靶向癌癥治療試圖通過干擾特異于癌發生的分子或細胞內途徑來阻斷癌細胞的生長和散布，因而不傷害非癌細胞。這些試劑的作用與傳統的化學治療劑或化學預防劑截然不同(incontradistinction)，傳統的化學治療劑或化學預防劑用于產生癌細胞或前癌細胞的生長延滯、末端分化和細胞死亡，但也能阻斷正常細胞的發育。然而，難以開發用于靶向治療的魯棒(robust)診斷的候選生物標記物，這部分是由于正常細胞和癌細胞表達的受體和配體的多樣性，并得到來自受體信號轉導的可變的結果。幾種信號轉導途徑已顯示為了解和治療腫瘤發生的重要標靶；這些包括生長因子信號轉導途徑。所述生長因子途徑調節響應于細胞內和環境信號(cue)的細胞生長和新陳代謝。這些信號轉導途徑在癌癥中通常被改變或異常調節，導致不受控生長的表型和周圍組織的侵入。在癌癥診斷和治療中的細胞生長的關鍵決定因素和活性研究的目標是表皮生長因子(EGF)和它的受體(EGFR)。EGF是活化蛋白質受體酪氨酸激酶(RTK)活性來啟動信號轉導級聯，引起細胞生長、增殖和分化發生改變的生長因子。已知EGF和它的下游靶物(在圖1中說明)，包括ras/raf、mek和erk涉及不同癌癥的發病和發展。這種途徑和它的信號轉導分子提供了治療介入的吸引人的目標，這樣的方法正在開發中(Stadler,2005,Cancer,104:2323-33;Normanno,等，2006，Gene,366:2-16》把向EGF和它的受體的試劑包括bevacizumab、PTK787、SU011248和BAY43-9006。也已經顯示了BAY43-卯06抑制EGF途徑中的下游目標，包括raf、mek和erk(Stadler,2005Cancer,Id.)。這種受體系統還涉及許多人實體腫瘤，包括肺、乳腺、前列腺、結腸、卵巢、頭和頸的發生和發展。HER1/EGFR是四種受體的家族的成員{EGFR(也稱為HER1或ErbBl)、ErbB2(HER2/neu)、ErbB3(HER3)和ErbB4(HER4)}。受體存在于細胞質膜中，并包括外部的配體結合域、跨膜域和內部酪氨酸激酶域。配體的結合觸發受體二聚作用和內部受體域的自動磷酸化。這啟動了細胞反應的級聯，其影響細胞分裂和細胞生長的許多其它方面。EGF受體的活性增高，無論是由提高的配體濃度、受體數量或由受體突變引起的，都可以引起提高的細胞增殖。現在有明顯的證據顯示HER1/EGFR系統可以介導多種實體腫瘤的建立和發展。雖然一些研究已經檢查了EGF途徑在癌癥的控制和治療中的作用，關于在腫瘤發展和轉移期間這個途徑中的改變了解很少。EGFR途徑中下游效應物的微妙改變可以根據特別是腫瘤類型、階段(stage)和單獨的組成來提供治療介入的獨特和靈活的靶點。這種改變可能對惡性腫瘤的診斷和治療具有顯著的影響。傳統的治療癌癥方式已經根據來自大規模試驗的結果來開發，并且依靠各種各樣的患者和腫瘤的預示性結果。修整對單獨的患者、腫瘤和病理分期(示于圖2)的治療的能力可以提供具有較少副作用的、對惡性腫瘤的更有效的治療。此外，監測癌癥治療的發展并因而調整治療的能力將允許響應于先前使用來自大批患者的數據開發的治療方式對個體差異的更快速的反應。本領域需要開發診斷性生物標記物以容許在癌癥治療之前或期間篩選和快速檢測各種細胞內信號轉導分子中的改變，從而快速地診斷癌癥階段并監測針對EGFR途徑的治療的效果。還需要針對EGFR途徑的抑制物的改善的鑒定方法。
發明內容本發明提供了在患有癌癥的個體中評估腫瘤發展的試劑和方法，特別是其中所述方法用于確定腫瘤階段和評估抗癌治療的效力。本發明還提供了為患者提供個體化的抗癌治療和對治療的反應的方法，其中根據使用本發明的方法確定的腫瘤類型和階段將特定的治療施用于個體患者，根據患者對所述治療的個體反應維持或改變治療。在第一個方面，本發明提供了試劑，特別是免疫學試劑，以及評估個體中腫瘤發展、特別是結腸直腸癌癥發展的方法。在這個方面，分析來自患者的含有組織或腫瘤細胞的樣品來檢測一種或多種生物標記物的表達、磷酸化，或表達和磷酸化兩者的模式(pattern)。在具體的實施方式中，所述生物標記物是EGF代謝途徑的成員，包括但不限于EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67。在這些實施方式中，評估腫瘤發展，其中一種或多種(特別是多種)這些生物標記物的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者的模式基本上類似于來自具有所述腫瘤的發展確定階段的組織或細胞樣品的一種或多種(特別是多種)這些生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式。在可選擇的實施方式中，本發明提供了試劑，特別是免疫學試劑，以及評估個體中腫瘤發展、特別是結腸直腸癌癥發展的方法。在這個方面，分析來自患者的含有組織或腫瘤細胞的樣品來檢測一種或多種生物標記物的表達、磷酸化，或表達和磷酸化兩者的模式。在具體的實施方式中，所述生物標記物是EGF代謝途徑的成員，包括但不限于EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67。在這些實施方式中，評估腫瘤發展，其中一種或多種(特別是多種)這些生物標記物的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者的模式不同于來自包含正常細胞而不是腫瘤細胞的非腫瘤組織或細胞樣品的一種或多種(特別是多種)這些生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式。本發明的試劑和方法的優選的用途是用于評估結腸直腸癌的臨床階段，其中包含所述表達、磷酸化、或表達和磷酸化的模式的生物標記物包括EGFR、PTEN、pMEK、Ki67和pHERl。還落入本發明的這些方面的范圍內的是測量編碼EGFR的基因組DNA的基因擴增的其它步驟。在某些實施方式中，這些分析檢測基因組的編碼EGFR的DNA中平衡的二體性(balanceddisomy)。在這些方面中，組織樣品優選地是小的腺瘤或腺瘤性息肉。具體地，在這些實施方式中，本發明提供了表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者的模式，其中相比非腫瘤組織或細胞樣品中這些生物標記物的表達、磷酸化、.或表達或磷酸化兩者的水平，EGFR的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者被提高；PTEN的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者被提高；pMEK的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者被降低。在其它實施方式中，所述腫瘤是腺癌。具體地，在這些實施方式中，本發明提供了表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者的模式，其中相比小的腺瘤組織或細胞樣品中這些生物標記物的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者的水平，PTEN的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者被降低；pMEK的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者被提高。這些實施方式可包括處于它們的范圍內的測量編碼EGFR的基因組DNA的基因擴增的其它步驟。在某些實施方式中，這些分析檢測基因組的編碼EGFR的DNA中平衡的二體性和平衡的三體性(trisomy)。在更進一步的實施方式中，來自患者的組織樣品是惡性樣品，而本發明提供了表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者的模式，其中相比小的腺瘤組織或細胞樣品中這些生物標記物的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者的水平，PTEN的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者被降低，以及pMEK的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者被提高。這些實施方式可包括處于它們的范圍內的測量編碼EGFR的基因組DNA的基因擴增的其它步驟。在某些實施方式中，這些分析檢測基因組的編碼EGFR的DNA中平衡的二體性和平衡的多體性(polysomy)。在優選的實施方式中，包含在本發明的方法中檢測到的模式的、所述生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的這些模式通過免疫組織化學或原位雜交來檢測。在優選的實施方式中，所述方法包括在使用標記的特異性結合試劑(優選免疫學試劑)染色之后利用組織切片的計算機輔助圖像分析來有利進行的分析。在本發明的方法的實施中提供了用于鑒定對一種或組合的特定化學治療劑有反應的、帶有腫瘤，特別是結腸直腸癌癥腫瘤的個體的方法。在這些實施方式中，本發明的方法用于檢測一個或多個生物標記物的表達、磷酸化、或表達或磷酸化兩者的模式。在某些實施方式中，所述腫瘤是結腸直腸癌癥，而所述生物標記物包括但不限于EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67。在本發明的方法的有利實施方式中，表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式鑒定出對一個或組合的化學治療劑是應答性的腫瘤。在具體的實施方式中，本發明的方法對于鑒定對化學治療劑是應答性的腫瘤樣品是有用的，所述化學治療劑包括但不限于EGFR抗體或激酶抑制物，或EGFR抗體和激酶抑制物兩者。在其它的方面，本發明提供了用于實施本發明的方法的試劑盒。在有用的實施方式中，所述試劑盒包括至少兩種試劑，優選特異結合試劑和更優選免疫學試劑，用于檢測在人腫瘤樣品中關于腫瘤發展或化學治療劑應答性為信息性的生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者。在某些實施方式中，所述至少兩種試劑對于檢測生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者是有用的，所述生物標記物包括但不限于EGFR、pEGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67。在某些實施方式中，所述至少兩種生物標記物是PTEN和pMEK。在某些實施方式中，所述試劑盒包括用于檢測至少三種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的試劑，所述生物標記物優選地包括^f旦不限于EGFR、pEGFR、PTEN、pMEK、pERK或Ki67。在某些實施方式中，所述至少三種生物標記物是EGFR、PTEN和pMEK。在可選擇的實施方式中，所述試劑盒包括用于檢測EGFR、pEGFR、PTEN、pMEK、pERK或Ki67的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的試劑。本發明的試劑盒的某些實施方式還包括用于檢測編碼EGFR的基因組DNA的基因擴增的試劑。本發明的所述試劑盒的每個實施方式有利地還包括在實施本發明的方法中使用所述試劑盒的說明。根據以下某些優選的實施方式的更詳細的說明和權利要求，本發明的特別優選的實施方式將變得明顯。本專利或申請文件含有至少一幅以彩色制作的圖。帶有彩色圖的本申請或專利申請出版物的拷貝將在請求和支付了必要的費用時由官方提供。圖1是EGFR途徑的示意圖。圖2是結腸直腸的結腸發展的示意圖。圖3是CHTN結腸直腸癌癥發展的蘇木色素和曙紅(H&E)染色的代表的顯微照片。圖3A是最大尺寸《cm的腺瘤的代表性H&E染色。圖3B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的代表性H&E染色。圖3C是原發性浸潤性(primaryinvasive)病理階段T1或T2的肺瘤樣品的代表性.H&E染色。圖3D是原發性浸潤性病理階段T3或T4的腫瘤樣品的代表性H&E染色。圖3E是向淋巴結轉移性的結腸直腸腺癌的代表性H&E染色。圖3F是向遠端位點(distantsite)轉移性的結腸直腸腺癌的代表性H&E染色。圖4呈現了從合作人組織網絡(CooperativeHumanTissueNetwork,CHTN)獲得的結腸直腸發展組織微陣列(TMA;CHTN2003CRCProg)的圖。圖5呈現了組織化學組織評定的結果；呈現了通過IHC分析的結腸直腸組織樣品中ptyr表達，表示為平均的陽性百分比。圖6是結腸直腸癌癥發展的代表性EGFR表達水平的顯微照片。圖6A是最大尺寸〈2cm的腺瘤的EGFR染色的代表性圖像(C10);樣品具有100%百分比陽性細胞質/膜染色的3+的分值。圖6B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的EGFR染色的代表性圖像(F5);樣品具有100%百分比陽性細胞質/膜染色妁3+的分值。圖6C是原發性浸潤性病理分期Tl或T2的腫瘤樣品的EGFR染色的代表性圖像(E4);樣品具有100%百分比陽性細胞質/膜染色的3+的分值。圖6D是原發性浸潤性病理分期T3或T4的腫瘤樣品的EGFR染色的代表性圖像(H10);樣品具有卯°/。百分比陽性細胞質/膜染色的3+的分值。圖6E是向淋巴結轉移性的結腸直腸腺癌的EGFR染色的代表性圖像(J20);樣品具有85%百分比陽性細胞質/膜染色的2+的分值。圖6F是向遠端位點轉移性的結腸直腸腺癌的EGFR染色的代表性圖像(B13);樣品具有1%百分比陽性膜染色的1+的分值。圖7是結腸直腸癌癥發展的代表性PTEN表達水平的顯微照片。圖7A是最大尺寸〈2cm的腺瘤的PTEN染色的代表性圖像(C4);樣品具有80%百分比陽性細胞質染色的3+的分值。圖7B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的PTEN染色的代表性圖像(F3);樣品具有75。/。百分比陽性細胞質染色的l+的分值。圖7C是原發性浸潤性病理分期Tl或T2的腫瘤樣品的PTEN染色的代表性圖像(E2);樣品具有80%百分比陽性細胞質染色的2+的分值。圖7D是原發性浸潤性病理分期T3或T4的腫瘤樣品的PTEN染色的代表性圖像(H4);樣品具有40%百分比陽性細胞質染色的l+的分值。圖7E是向淋巴結轉移性的結腸直腸腺癌的PTEN染色的代表性圖像(J18);樣品是陰性的。圖7F是向遠端位點轉移性的結腸直腸腺癌的PTEN染色的代表性圖像(B7);樣品是陰性的。圖8是結腸直腸癌癥發展的代表性pMEK表達水平的顯微照片。圖8A是最大尺寸〈cm的腺瘤的pMEK染色的代表性圖像(CM);樣品具有10%百分比陽性細胞質染色的l+的分值。圖8B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的pMEK染色的代表性圖像(F3);樣品具有70%百分比陽性細胞質染色的l+的分值。圖8C是原發性浸潤性病理分期Tl或T2的腫瘤樣品的pMEK染色的代表性圖像(E2);樣品具有80%百分比陽性細胞質染色的1+和10%百分比陽性核染色的l+的分值。圖8D是原發性浸潤性病理分期T3或T4的腫瘤樣品的pMEK染色的代表性圖像(H4);樣品具有100%百分比陽性細胞質染色的2+和5%百分比陽性核染色的2+的分值。圖8E是向淋巴結轉移性的結腸直腸腺癌的pMEK染色的代表性圖像(J18);樣品是具有100%百分比陽性細胞質染色的3+的分值。圖8F是向遠端位點轉移性的結腸直腸腺癌的pMEK染色的代表性圖像(B7);樣品具有100%百分比陽性細胞質染色的2+和15%百分比陽性核染色的3+的分值。圖9是結腸直腸癌癥發展的代表性Ki67表達水平的顯微照片。圖9A是最大尺寸〈2cm的腺瘤的Ki67染色的代表性圖像(C4);樣品具有10%百分比陽性核染色的2+的分值。圖9B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的Ki67染色的代表性圖^f象(F3);樣品具有25%百分比陽性核染色的2+的分值。圖9C是原發性浸潤性病理分期Tl或T2的腫瘤樣品的Ki67染色的代表性圖像(E2);樣品具有85%百分比陽性核染色的2+的分值。圖9D是原發性浸潤性病理分期T3或T4的腫瘤樣品的Ki67染色的代表性圖像(H4);樣品是具有40%百分比陽性的2+和15%百分比陽性核染色的3+的分值。圖9E是向淋巴結轉移性的結腸直腸腺癌的Ki67染色的代表性圖像(J10);樣品具有45%百分比陽性核染色的3+的分值。圖9F是向遠端位點轉移性的結腸直腸腺癌的Ki67染色的代表性圖像(B7);樣品具有70%百分比陽性細胞質染色的2+的分值。圖IO是來自單個個體病例(男性，71歲)的結腸直腸癌癥發展的生物標記物表達水平的代表性顯微照片。圖10A是最大尺寸〈2cm的腺瘤；最大尺寸〉2cm的腺瘤、原發性浸潤性病理分期T3或T4的腫瘤；向淋巴結轉移性的結腸直腸腺癌的代表性免疫組織化學(IHC)圖像。使用了對EGFR、pHERl、PTEN、pAKT、pMEK和Ki67反應性的抗體。圖10B顯示了圖形形式的結果，都使用了計算機輔助圖像分析(A)和病理分值(B)的結果。圖11顯示在結腸直腸癌癥發展期間EGFR表達途徑中生物標記物評定的概述，如使用圖像分析測定的。結果顯示為平均分值中的％改變。圖12是使用用于表皮生長因子受體(五G^i，紅色)；染色體7(CEP7，綠色)的探針在原位雜交分析中的雙色熒光的顯微照片。圖12A顯示了平衡的二體性；圖12B顯示了平衡的三體性，圖12C顯示了平衡的多體性，圖12D顯示了基因擴增。圖13是結腸直腸癌癥發展中EGFRFISH基因檢測的顯微照片。圖13A是最大尺寸〈2cm的腺瘤的代表性EGFRFISH基因檢測，其是平衡的二體性。圖13B是最大尺寸〉2cm的腺瘤的代表性EGFRFISH基因檢測，其是平衡的二體性。圖13C是原發性浸潤性病理分期Tl或T2的腫瘤樣品的代表性EGFRFISH基因檢測，其是平衡的二體性。圖13D是原發性浸潤性病理分期T3或T4的肺瘤樣品的代表性EGFRFISH基因檢測，其是平衡的多體性。圖13E是向淋巴結轉移性的結腸直腸腺癌的代表性EGFRFISH基因檢測，其是平衡的多體性。圖13F是向遠端位點轉移性的結腸直腸腺癌的代表性EGFRFISH基因檢測，其顯示了基因擴增二體性。圖14是結腸直腸癌癥中EGFR表達水平的顯微照片。圖14A顯示了20X掃描通道(scanpass)的兩個區域(區域1和區域2);圖14B顯示了兩個區域的EGFR組合分值(ARIOL)的結果。圖15是結腸直腸癌癥中HER2表達水平的顯微照片。圖15A顯示了20X掃描通道的兩個區域(區域1和區域2);圖15B顯示了兩個區域的HER2組合分值(ARIOL)的結果。圖16是結腸直腸癌癥中pAKT表達水平的顯微照片。圖16A顯示了20X掃描通道的兩個區域(區域1和區域2);圖16B顯示了兩個區域的pAKT組合分值(ARIOL)的結果。圖17是結腸直腸癌癥中Ki67表達水平的顯孩i吸片。圖17A顯示了20X掃描通道的兩個區域(區域1和區域2);圖17B顯示了兩個區域的Ki67組合分值(ARIOL)的結果。圖18是結腸直腸癌癥中存活蛋白(Survivin)表達水平的顯微照片。圖18A顯示了20X掃描通道的兩個區域(區域1和區域2);圖18B顯示了兩個區域的存活蛋白組合分值(ARIOL)的結果。圖19是結腸直腸癌癥中VEGF表達水平的顯微照片。圖19A顯示了20X掃描通道的兩個區域(區域1和區域2);圖19B顯示了兩個區域的VEGF組合分值(ARIOL)的結果。圖20顯示了銀原位雜交的示意圖。優選實施方式的詳細說明本發明提供了用于評估個體(包括癌癥患者)中結腸直腸癌癥發展的方法。此外，本發明提供了用于評估結腸直腸癌癥發展的預示性生物標記物。此外，此外，本發明提供了用于評估結腸直腸癌癥發展的試劑盒。與在外科手術后進行化學治療藥物治療作為外科手術的輔助(adjunct)的傳統抗癌方法相比，新佐劑(或原始(primary))化療包括施用藥物作為某些癌癥患者中的初始治療。這種方法的一個益處是，由于化療的腫瘤收縮效應，對于超過3cm的原發腫瘤，它允許對大部分患者的保守性外科操作(與例如乳腺癌患者中的根治性乳房切除術相對)的稍后的或伴隨的使用。另一個優點是對于許多癌癥，在所有患者的大約三分之二中實現了部分的或完全的應答。最后，因為在兩到三個周期的化學治療處理之后大部分患者是應答性的，因此有可能監測所采用的化學治療方案的體內效力，來鑒定腫瘤對化學治療處理是非應答性的患者。非應答性腫瘤的及時鑒定容許臨床醫師來限制癌癥患者暴露于不必要的治療副作用并開始選擇性的治療。不幸地，本領域中當前的方法(包括組織學檢查)不足以用于這種及時和精確的鑒定的最佳應用。本發明提供了用于開發更為信息性和有效的治療方案的方法，所述治療方案施用于癌癥患者時，有效結果(即，減少或消除腫瘤)的可能性提高。癌癥診斷，疾病的初步診斷和隨后疾病過程的監測(在治療之前、期間或之后)通常通過從患者取出的細胞或組織樣品的組織學檢查來確認。臨床病理學家需要能夠精確地確定這些樣品是良性還是惡性的，以及區分視為惡性的腫瘤樣品的侵略性，因為這些測定通常形成了選擇患者治療的適合過程的基礎。類似地，病理學家需要能夠檢測癌癥已生長或已進入緩解的程度，特別組織學檢查通常需要(entail)組織染色操作，其允許樣品的形態特征在光學顯微鏡下容易地觀察。病理學家在檢查染色的樣品之后，一般進行腫瘤樣品是否是惡性的定性測定。然而，僅僅通過樣品的組織學檢查來確定腫瘤的侵略性是困難的，因為腫瘤的侵略性通常是腫瘤內細胞的生物化學的結果，例如蛋白質表達或抑制和蛋白質磷酸化，其可能或可能不由樣品的形態反映。因而，重要的是能夠評估腫瘤樣品內細胞的生物化學。此外，希望的是能夠觀察和定量腫瘤相關基因或蛋白質的基因表達和蛋白質磷酸化，或更特別的是腫瘤相關信號轉導途徑的細胞成分。癌癥治療可以基于胂瘤的分子分布而不僅僅是它們的組織學或疾病的位點。闡明肺瘤組織中靶向治療的生物學效果并將這些效果與臨床應答相關聯有助于鑒定腫瘤中起作用的優勢生長和存活途徑，從而確定了可能的應答物的模式，并反之提供了用于設計策略以克服抗性的理論。例如，生長因子受體的成功的診斷性靶向必須通過所述治療不靶向的其它受體來確定腫瘤生長或存活是否受到靶向的受體或受體家族的驅動，以及下游的信號轉導是否表明涉及另一種致癌途徑。此外，當暗示了超過一種信號轉導途徑時，那些信號轉導途徑的成員可以用作診斷目標以確定雙抑制物治療是否將是或者是有效的。為了使化療有效，藥物應當破壞腫瘤細胞并且不傷害正常的體細胞，特別是可鄰近或接近腫瘤的那些正常細胞。特別地，通過使用影響主要在癌癥細胞中而不在正常細胞中發生的細胞活性的藥物，可以實現這一點。本領域已知的自動化的(計算機輔助的)圖象分析系統可以增強腫瘤樣品的視覺檢查。在代表性實施方式中，將細胞或組織樣品暴露于對特定的生物標記物是特異性的可檢測標記的試劑，然后通過計算機處理細胞的放大的圖像，計算機從電荷耦合器件(CCD)或照相機例如電視攝像機接收圖像。這種系統可以用于，例如，才企測和測量樣品中EGFR、ptyr、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或KI67、或任何其它診斷生物標記物的表達和活性水平。因而，本發明的方法提供了更精確的癌癥診斷和組織學鑒定的癌細胞中更好的基因表達特征，最特別的是關于腫瘤標記物基因或已知在特定癌癥類型和亞型(例如具有不同程度的惡性腫瘤)中表達的基因的表達。這種信息允許施用更為信息性和有效的治療方案，因為可將對某些腫瘤類型或亞型具有臨床效力的藥物施用于其細胞被這樣鑒定出的患者。常規抗癌治療的另一個缺點是特定化學治療劑在治療個體人患者中的特定癌癥方面的效力是不可預測的。鑒于這種不可預測性，本領域不能夠在開始治療之前確定一種或多種選定的試劑是否將在個體患者中作為抗腫瘤試劑是活性的、或提供精確的預后或治療過程。這是特別重要的，因為特定的臨床癌癥可能為臨床醫師提供了治療方案的選擇，而無評估哪種方案對于特定個體將是最有效的任何目前的方法。本發明的方法的優勢是它們能夠更好地評估提出的治療試劑(或試劑的組合)在個體患者中預期的效力。所要求保護的方法對于其它原因也是有益的，所述原因是它們在化學治療方案效力的評估中是有時間和成本效率的，并且對癌癥患者是最d、外傷性的。使用本發明的方法來檢測和定量多肽的表達和磷酸化的模式。更具體地，使用本發明的方法來檢測和定量作為腫瘤相關信號轉導途徑的細胞成分的多肽的表達和磷酸化模式。例如，可以使用特異于所述多肽的生物檢測試劑(包括但不限于抗體)來檢測多肽的表達和磷酸化的模式。作為選擇，生物檢測試劑可以是核酸探針。如本文公開的發明性方法所使用的，將核酸探針定義為一種或多種核酸片段的集合，所述核酸片段與樣品的雜交可以被檢測。探針可以是未標記的或標記的，從而其與靶物或樣品的結合可以被檢測。探針產生自來自基因組的一個或多個特定(預選的)部分的核酸來源，例如一個或多個克隆、分離的完整染色體或染色體片段、或聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產物的集合。核酸探針也可以是固定在固體表面(例如，硝化纖維、玻璃、石英、蒸汽沉積二氧化硅(flimedsilica)載玻片)上的分離的核酸，如在陣列中。探針可以是例如WO96/17958中描述的核酸的陣列的成員。能夠產生高密度陣列的技術也可以用于這個目的(參見，例如，Fodor,1991,5We"ceX:767-773;Johnston,1998,Cwk腸/.旦R171-R174;Schummer,1997,脂ec—腦21:1087-1092;Kern,1997,5Zofec/7w々wey21:120-124;U.S.Pat.No.5,143,854)。技術人員將認識到，可將特定探針的確切序列修飾到一定程度來產生"基本上相同的"、但保持了與衍生它們的探針的相同靶物或樣品的特異性結合(即，特異性雜交)能力的探針。術語"核酸"是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。該術語包括核酸，例如，寡核芬酸，含有天然核苷酸的已知類似物，所述類似物對于期望的目的具有與參考核酸相似或改進的結合性質。該術語還包括核酸，所述核酸以類似于天然存在的核苷酸的方式、或以對于期望的目的改進的速率被代謝。該術語還包括具有合成的骨架的核酸樣結構。通過參考例如涉及結腸癌細胞的篩選的美國專利6,326,148，技術人員將知道如何使用核酸探針用于篩選樣品中的癌細胞。可使用針對直接檢測的生物標記物(包括但不限于EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、p、pERK或Ki67)的合適的初級抗體，或使用適當的二級抗體(例如當使用小鼠初級抗體時為兔抗小鼠IgG)和/或第三抗生物素蛋白(或抗生蛋白鏈菌素(Strepavidin))生物素復合物("ABC")通過圖像分析來定量與癌癥相關的多肽。如本文例示的在本發明方法的實施中有用的試劑的實例包括免疫學試劑。"免疫學試劑，，是指抗體，特別包括多克隆抗血清和單克隆抗體。可通過用于合成抗體的本領域已知的任何方法(包括化學合成或重組表達技術，或優選使用常規的免疫學方法)來產生本發明的抗體。如本文使用的，術語"抗體"包括但不限于天然存在的和非天然存在的抗體。如本文使用的，術語"抗體"意圖廣泛地涉及任何免疫學結合試劑，例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。一般地，IgG和/或IgM是優選的，因為它們是生理學情況中最常見的抗體，并且因為它們是在實驗室環境中最容易制造的。更具體地，術語"抗體"包括多克隆和單克隆抗體，以及它們的抗原結合片段，例如Fab、Fab'和F(ab')2片段。此外，術語"抗體"包括嵌合抗體和完全合成的抗體，包括遺傳工程化的抗體，和它們的片段。多克隆和單克隆抗體可以是"純化的"，其是指所述多克隆和單克隆抗體不含任何其它的抗體。制備多克隆和單克隆抗體的方法是本領域公知的(參見，例如，Sambrook等，1989，MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,SecondEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.;andHurrell(Ed,),MONOCLONALHYBRIDOMAANTIBOD正S:TECHNIQUESANDAPPLICATIONS,CRCPress,Inc.,BocaRaton，Fla.,通過引用將其并入本文)。對本領域普通技術人員顯而易見的是，多克隆抗體可以產生自各種溫血動物，例如馬、牛、山羊、綿羊、狗、雞、兔、小鼠和大鼠。可以通過使用佐劑例如弗氏佐劑(完全的和不完全的)、礦物質凝膠例如氫氧化鋁、表面活性物質，例如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔戚血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin)、二硝基酚和潛在有用的人佐劑例如BCG(卡介苗)和短'J、棒桿菌(corynebacteriumparvum)來增加抗原性表位的免疫原性。這些佐劑也是本領域公知的。例如在Tijssen(1987，PRACTICEANDTHEORYOFENZYMEIMMUNOASSAYS,3rdEd.，Elsevier:NewYork)中公開了關于佐劑和免疫分析的各個方面的信息。涉及制備多克隆抗血清的方法的其它有用的參考文件包括Microbiology(1969，HoeberMedicalDivision,HarperandRow);Landsteiner(1962,SPECIFICITYOFSEROLOGICALREACTIONS,DoverPublications:NewYork),和Williams等(1967，METHODSINIMMUNOLOGYANDIMMUNOCHEMISTRY，Vol.1,AcademicPress:NewYork)。在多克隆抗體的生產中使用的免疫原組合物的數量根據免疫原的性質以及用于免疫的動物而改變。可使用多種的途徑施用免疫原(皮下、肌內、皮內、靜脈內和腹膜內)。可以通過在免疫后各個點采樣免疫的動物的血液來監測多克隆抗體的產生。也可以給予第二次強化劑(booster)注射。重復強化和滴定的過程直到實現適合的滴度。當獲得期望水平的免疫原性時，可將免疫的動物放血，分離血清并保存。可以直接使用從使用標準方法免疫的動物產生的血清，或者可以使用標準方法例如血漿分離術(plasmaphoresis)或用IgG-特異性吸附劑如固定的蛋白質A的吸附層析來從血清中分離IgG級分。可根據已知的方法通過裂解和收集期望片段來從相應的抗體產生抗體片段，例如F(ab')2和Fab片段(參見，例如Andrew等，1992，"FragmentationofImmunoglobulins"inCURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,Unit2.8，GreenePublishingAssoc.andJohnWiley&Sons)。作為選擇，可以根據公知的技術，例如通過引用并入本文的在美國專利No.4，196，265中例示的那些來制備針對本發明的抗原性肽的單克隆抗體。通過公知的技術來產生針對本發明的抗原性肽產生單克隆抗體的雜交瘤。通常，本方法包括永生細胞系與產生期望抗體的B-淋巴細胞融合。永生細胞系通常是轉化了的哺乳動物細胞，特別是嚙齒動物、牛和人來源的骨髓瘤細胞。嚙齒動物例如小鼠和大鼠是優選的動物，然而，使用兔或羊細胞也是可能的。小鼠是優選的，BALB/c小鼠是最優選的，因為它是最常使用的并且一般得到更高百分比的穩定的融合物。般地，如果采用的是人來源的細胞，則使用外周血淋巴細胞(PBL)，或使用來自非人哺乳動物來源的脾臟或淋巴結細胞。用重復劑量的純化抗原注射宿主動物，允許動物產生期望的生產抗體的細胞，然后收獲細胞用于與永生細胞系融合。最經常地，永生細胞系是大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系，為了方便性和可用性的問題來采用它們。融合的技術也是本領域公知的，一般地包括將細胞與融合試劑，例如聚乙二醇混合。一般地，選擇具有生產抗體的潛力的下述免疫體細胞，特別是B-淋巴細胞(B-細胞)，用于mAb生產規程。這些細胞可以從活檢脾臟、扁桃體或淋巴結、或從外周血樣品獲得。脾臟細胞和外周血細胞是優選的，前者是因為它們是處于分裂漿母細胞階段(dividingplasmablaststage)的生產抗體的細胞的豐富來源，后者是因為外周血是容易獲得的。通常，將一欄(apanelof)動物免疫，將具有最高抗體效價的動物的脾臟取出，通過用注射器將脾臟均質化來獲得脾淋巴細胞。通常，來自免疫的小鼠的脾臟含有大約五千萬到兩億淋巴細胞。適用于生產雜交瘤的融合步驟的骨髓瘤細胞系優選是非抗體生產性的、具有高融合效率、和酶缺陷的，所述酶缺陷使得它們不能在某些選擇培養基中生長，所述選擇培養基僅支持期望的融合細胞(雜交瘤)的生長。可以使用許多骨髓瘤細胞中的任一種，如本領域技術人員已知的。可得到的鼠骨髓瘤系，例如來自美國典型培養物保藏中心(ATCC),10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110-2209，USA的那些，可用于雜交。例如，當免疫的動物是小鼠時，人們可以^f吏用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NSl/l.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC畫ll、MPCll-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul;對于大鼠，人們可以4吏用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210;U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6在人細胞融合方面都是有用的。一種優選的鼠骨髓瘤細胞是NS-1骨髓瘤細胞系(也稱為P3-NS-l-Ag4-l),其是可通過請求細胞系保藏號GM3573從NIGMS人遺傳突變細胞保藏中心容易地獲得的。可以使用的另一種小鼠骨髓瘤細胞系是8-氮雜烏嘌呤抗性小鼠的鼠骨髓瘤SP2/0非產病毒(non-producer)細胞系。產生生產抗體的脾臟或淋巴結細胞與骨髓瘤細胞的雜合體的方法通常包括在促進細胞膜融合的一種或多種試劑(化學的或電學的)存在下以2:1比例混合體細胞和骨髓瘤細胞，而該比例可分別從約20:1變化到約1:1。已經描述了使用仙臺病毒的融合方法(Kohler等，1975，Atowre256:495;Kohler等，1976,五wr./mmw"o/.6:511;Kohler等，1976,//mwwwo/.6:292)，p乂及Gefter等(1977,5bwa"cCe〃3:231-236)使用聚乙二醇(PEG)，例如37%(v/v)PEG的那些方法。使用電學上誘導的融合方法也是適當的(Goding，1986)。融合操作通常以低頻率(約1x10-6到1x10,產生活的雜合體。然而，這不構成難題，因為通過在選擇培養基中培養可將活的融合的雜合體與親本未融合的細胞(特別是將正常地繼續無限分裂的未融合的骨髓瘤細胞)區分。選擇培養基一般是含有試劑的培養基，所述試劑阻斷組織培養基中核苷酸的從頭合成。例示的和優選的試劑是氨基蝶呤(aminopterin)、氨甲蝶呤和重氮絲氨酸(azaserine)。氨蝶呤和氨曱蝶呤阻斷噪呤和嘧啶的從頭合成，而重氮絲氨酸僅阻斷。票呤合成。當使用氨蝶呤或氨曱蝶呤時，培養基可以補充以次黃。票呤和胸苷作為核苷酸的來源(HAT培養基)。當使用重氮絲氨酸時，培養基補充以次黃嘌呤。優選的選擇培養基是HAT。骨髓瘤細胞在補救途徑的關鍵酶(例如，次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT))中是缺陷的，因而它們不能存活。B細胞可以操作這個途徑，但是它們在培養中具有有限的生命期跨度(lifespan),—般在約兩周內死亡。因此，可以在選擇培養基中存活的唯一的細胞是從骨髓瘤和B細胞形成的那些雜合體。在這些條件下培養融合產物提供了雜交瘤的群體，從中選擇特定的雜交瘤。一般地，通過微量滴定板中的單克隆稀釋來培養細胞，隨后測試單個克隆上清液(在約兩到三周后)的期望的反應性來進行雜交瘤的選擇。使用標準的免疫測定，例如Western印跡、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、RIA(放射性免疫測定)等等，選擇分泌期望的抗體的雜交瘤。使用標準的蛋白純化技術(例如Tijssen,1985，/d)從培養基回收抗體。所述分析應該是每文感的、簡單的和快速的，例如放射免疫分析、酶免疫測定、細胞毒性分析、噬菌斑分析(plaqueassay)、點免疫結合分析，等等。然后將選定的雜交瘤連續稀釋，并克隆成單獨的產生抗體的細胞系，然后可將所述克隆無限增殖以提供mAbs。可將細胞系以至少兩種方式用于mAb生產。可將雜交瘤的樣品注射(通常到腹膜腔中)到組織相容的動物的類型中，所述動物用于提供原始融合的體細胞和骨髓瘤細胞。注射的動物發展了腫瘤，所述腫瘤分泌由融合細胞雜合體產生的特異的單克隆抗體。然后可使動物的體液(例如血清或腹水)流出以提供高濃度的mAbs。也可將單獨的細胞系體外培養，其中將mAbs天然地分泌到培養基中，從培養基中可以以高濃度容易地獲得它們。如果需要，可使用過濾、離心和各種層析方法例如HPLC或親和層析將通過任一種方法產生的mAbs進一步純化。可用許多參考文獻來提供應用上述技術中的指導，包括Kohler等(1980,HYBRIDOMATECHNIQUES,ColdSpringHarborLaboratory,NewYork);Tijssen(1985,Id.);Campbell(1984，MONOCLONALANTIBODYTECHNOLOGY,Elsevier:Amsterdam);Hurrell(1982，Id.)。也可以使用公知的噬菌體文庫系統來產生單克隆抗體。參見，例如，Huse等(1989,Science246:1275);Ward等(1989，Nature341:544)。可以根據已知的方法通過裂解和收集期望片段來從相應的抗體產生抗體片段，例如F(ab')2和Fab片段(參見，例如，Andrew等，1992，"FragmentationofImmunoglobulins"inCURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,Unit2.8,GreenePublishingAssoc.andJohnWiley&Sons)。可以例如，以通過公知方法與固相支持物結合的固定化形式使用如此產生的抗體，無論是多克隆的或單克隆的。也可以j吏用未標記的或通過標準方法標記的抗體，作為免疫分析和免疫特異性結合分析的基礎。可以使用的免疫分析包括但不限于竟爭性和非竟爭性分析系統，其使用的技術例如Western印跡、放射免疫分析、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、"夾心"免疫分析、免疫沉淀分析、沉淀素反應、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體結合分析(complement-fixationassay)、免疫放射分析、熒光免疫分析、蛋白質A免疫分析，略舉數例。這些分析是常規的和本領域公知的(參見，例如Ausubel等，eds，1994,Id.)。特別地，本發明的抗體也可以與為免疫組織化學(IHC)研究制備的新鮮冷凍的和/或福爾馬林固定的、石蠟包埋的組織塊(tissueblock)—起使用。通過將抗體與可檢測物質偶連可以使檢測便利化。可檢測物質的實例包括各種酶、輔基(prostheticgroup)、熒光材料、發光材料、生物發光材料、放射性物質、利用各種正電子發射斷層照相術的正電子發射金屬、和非放射性的順磁性金屬離子。可以使用本領域已知的技術通過中間物(例如，本領域已知的接頭)將可檢測物質直接或間接地偶聯或綴合到抗體(或其片段)。對于可以綴合于抗體用作根據本發明的診斷劑的金屬離子，參見，例如美國專利No.4,741,900。使用的特定標記將取決于免疫測定的種類。可以使用的標記物的實例包括但不限于，放射性標記例如&、14C、32P、125I、'311、"'In或"Tc;熒光標記物例如熒光素和其衍生物，羅丹明和其衍生物，丹磺酰和傘形酮；化學發光劑例如熒光素酶和2,3-二氫-鄰苯二曱酰吖嗪二酮(2,3-dihydro-phthalazinediones);以及酶，例如辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和乙酰膽i烕酯酶。可以通過已知的方法用這些標記物來標記抗體。例如，可以使用偶聯劑，例如醛、碳二亞胺、雙馬來酰亞胺(dimaleimide)、亞胺酯(imidates)、琥珀酰亞胺、雙重氮化聯苯胺(bisdiazotizedbenzadine)等等，來標記帶有熒光、化學發光或酶標記物的抗體。涉及的一般方法是本領域公知的，并且例如在IMMUNOASSAY:APRACTICALGUIDE(1987,Chan(Ed.),AcademicPress,Inc.:Orlando，FL)中描述。此外，預測性多肽的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式可以與非腫瘤組織或細胞樣品相比較。非腫瘤組織或細胞樣品可以從來自相同個體的非腫瘤組織或細胞樣品獲得，或作為選擇從來自不同個體的非腫瘤組織或細胞樣品獲得。如果與非腫瘤組織或細胞樣品相比檢測到更少的多肽，則將多肽的檢測模式稱為在哺乳動物腫瘤、組織或細胞樣品中是降低的。如果與非腫瘤組織或細胞樣品相比檢測到更多的多肽，則將多肽的檢測模式稱為在哺乳動物腫瘤、組織或細胞樣品中是"提高"的。如果與非腫瘤組織或細胞樣品相比檢測到相同的或大致相同的多肽，則將多肽的檢測模式稱為在哺乳動物腫瘤、組織或細胞樣品中是"正常，，的。在實施本發明的方法中，可以通過人，例如解剖病理實驗室中的組織技術人員(histotechnician)來進行染色操作。作為選擇，可以使用自動化系統，例如VentanaMedicalSystems'Benchmark⑧系列的自動化染色儀來進行染色操作。在任一種情況中，根據本領域公知的標準技術和規程來進行本發明的方法使用的染色步驟。"細胞或組織樣品，，是指生物樣品，其包括細胞，最優選腫瘤細胞，其為從身體樣品分離的，所述身體樣品例如但不限于涂片、痰、活檢物、分泌物、腦脊液、膽汁、血液、淋巴液、尿液和糞、或從器官移出的組織，所述器官例如乳腺、肺、腸、皮膚、宮頸、前列腺和胃。例如，組織樣品可包含功能上相關的細胞或鄰近細胞的區域。可以通過測量染色的抗原的平均光密度來定量目標蛋白質的量。附隨地，可以容易地計算染色的總組織區域的比例或百分比，例如，在第二圖像中對照水平(例如抗體閾值水平)之上的染色的面積。在含有生物標記物的核的可視化之后，將來自治療后患者的組織中這些細胞的百分比或量與未治療的組織中這些細胞的百分比或數量相比較。就本發明而言，將"測定"多肽的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式廣義地理解為僅指通過直接檢查或間接地從例如承包診斷服務(contractdiagnosticservice)來獲得關于這樣的多肽的表達水平信息。作為選擇，可以使用熒光方法來測定目標蛋白質的量。例如，量子點(Qdots)在包括免疫組織化學、流式細胞術和基于平板的分析的發展的應用列表中是越來越有用的，因而可以與本發明一起使用。Qdot納米晶體具有獨特的光學性質，包括極其明亮的信號用于敏感性和定量，高的光穩定性用于成像和分析。需要單一的激發源，綴合物的增長的范圍使得它們在廣泛的基于細胞的應用中是有用的。QdotBioconjugates(量子點生物綴合物)的特征在于與可用的最明亮的傳統染料可比較的量子產量。另外，與傳統的染料相比，這些基于量子點的熒光基團吸收10-1000倍的光線。來自基礎Qdot量子點的發射是狹窄和對稱的，這意味著與其它顏色的重疊最小化，產生對鄰近檢測通道的最小的滲透(bleedthrough)和衰減的串4尤(crosstalk)，雖然有(inspiteof)可以同時使用許多顏色的事實。標準熒光顯微鏡是用于檢測QdotBioconjugates的便宜的工具。由于Qdot綴合物是實際上光穩定的，可以使用顯微鏡花費時間來找到感興趣的區域并充分地集中于樣品。Qdot綴合物在任何需要明亮的光穩定的發射時是有用的，并且在僅可用一個激發源/過濾器和需要顏色中的最小串擾的多色應用中是特別有用的。例如，量子點已經用作抗生蛋白鏈菌素和IgG的綴合物來標記細胞表面標記物和核抗原，以及來染色微管和肌動蛋白(Wu等2003，NatureBiotech.,21，41-46)。例如，可以使用二級抗體進行QDOT熒光IHC，其中檢測底物是綴合抗生蛋白《連菌素的Qdots(VentanaMedicalSystems,Inc.,Tucson,AZ)("Ventana")。通過首先在光譜成像照相機上捕獲圖像塊來進行圖像分析(CambridgeResearchInstruments,Wobum，MA)。可以用UV(汞)光源來進4亍5敫發。然后可以在VentanaResearchImagingApplication上分析圖<象塊。簡要地，可以在應用中恢復(retrieve)圖像塊，可以提取數據并根據預計在605nm和655nm處發射的Qdots的像素強度來報告。作為實例，可以使用多光譜成像系統Nuance(CambridgeResearch&Instrumentation,Wobum,MA)來測量焚光。作為另一個實例，可以使用光譜成像系統SpectrViewTM(AppliedSpectralImaging,Vista,CA)來測量熒光。多光譜成像是一種技術，其中采集圖像的每個像素的光譜學信息，并用光譜圖像處理軟件來分析所得的數據。例如，Nuance系統可以在電子地和連續地可選的不同波長采集一系列圖像，然后以設計用于處理這些數據的分析程序來應用。即使染料的光鐠高度重疊或將它們共定位時，或在樣品中相同的點發生，只要光譜曲線是不同的，Nuance系統就能夠同時獲得來自多個染料的定量信息。當被更高能量的光激發時，許多生物材料是自身發熒光的，或發射更低能量的光。這種信號可以產生較低對比的圖像和數據。沒有多光譜成像能力的高靈敏度照相機僅提高自身熒光信號和熒光信號。多光譜成像可以不混合、或分離出來自組織的自身焚光，從而增加可實現的信噪比。對于抗體檢測方法，"檢測試劑，，是指可以用于檢測抗體的試劑，包括初級或二級抗體。例如，檢測試劑可以是焚光檢測試劑、Qdots、產色檢測試劑、或基于聚合物的檢測系統。然而，本發明的方法和試劑盒不限于這些檢測試劑，它們也不限于初級和二級抗體方案(例如，三級等的抗體是包含在本發明的方法中)。本發明還使用核酸探針作為間接檢測表達的蛋白質生物標記物的手段。例如，可以使用探針設計領域的普通技術人員公知的標準的探針設計方法來構建EGFR生物標記物的探針。舉例來說，通過引用并入本文的美國專利申請No.US20050137389A1"染色體特異性染色的方法和組合物"描述了設計無重復探針組合物的方法，所述組合物包含經設計以標記整個染色體的序列的異源混合物。可以根據以下公開的方法的任一種來設計基因特異性探針。為此，重要的是產生純的、或同源的探針以將在感興趣位點以外的位置處的雜交最小化(Henderson,1982，InternationalReviewofCytology76:1-46)。Manuelidis等(1984,Chromosoma91:28-38)公開了用于檢測相應于重復DNA序列的家族成員的染色體上的多個基因座的單一種類DNA探針的構建。Wallace等(1981，NucleicAcidsResearch9:879-94)公開了合成的寡核香酸探針的構建，其具有用于檢測相應于結構基因的單個基因座的混合的堿基序列。通過考慮所有可能的核苷酸序列來確定堿基序列的混合物，所述核苷酸序列編碼結構基因相應的蛋白質中選定的氨基酸序列。01sen等(1980，Biochemistry19:2419-28)公開了通過連續雜交來分離標記的獨特序列人X染色體DNA的方法首先，總基因組人DNA針對其自身，從而可以分離獨特的序列DNA部分；第二，分離的獨特序列人DNA部分針對小鼠DNA,從而同源的小鼠/人序列被除去；最后，不與小鼠同源的獨特序列人DNA針對人/小鼠雜合體的總基因組DNA，所述雜合體的僅有的人染色體是染色體X，從而分離獨特序列X染色體DNA的部分。可以在本發明的方法中的基因檢測規程中使用標記的核酸探針。例如，熒光原位雜交("FISH")基因檢測方法可以用于測定基因(例如EGFR基因)的基因狀態。FISH基因檢測可以用于測量編碼例如EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排。FISH基因檢測，其容許測量基因組DNA的擴增、缺失或重排，因而容許檢測基因狀態，例如，基因是否是平衡的二體性、平衡的三體性、或平衡的多體性。本發明還可使用包括銀原位雜交的方法。使用這種技術，酶(例如辣根過氧化酶(HRP))催化銀離子向金屬銀的還原；金屬粒子沉積在與探針雜交的靶物的位點(Hoff等，2002，AmJClinPatho1.117:916-21.;參見圖20)。例如，銀原位雜交可以用于測量基因組DNA的擴增、缺失和重排。通過免疫組織化學根據本發明的方法來分析取自患者的癌癥組織切片的EGF途徑成員或其任何陽性治療應答預示性組合的表達、磷酸化、或表達和磷酸化。在本發明的方法中，"表達"方面的改變可以指檢測到生物標記物的細胞數目的改變，或作為選擇，陽性細胞的數目可以是相同的，但是強度(或水平)可以被改變。術語表達可以用作替代術語，表示分子活化水平的水平變化。例如，可以通過使用組織微陣列來實現這些測量。組織微陣列有利地用于本發明的方法，其為在均一染色和計分條件下快速篩選多個組織樣品的充分驗證的方法。(Hoos等，2001，AmJPathol.158:1245-51)。染色陣列的計分可以使用標準的0到3+級人工地實現，或通過精確定量觀察到的染色的自動化系統實現。這種分析的結果鑒定了最好地預測治療后的患者結果的生物標記物。可以根據一小組配體、受體、信號轉導蛋白質或其預測性組合的表達、磷酸化或兩者來預測從0到100百分比的患者"應答可能性"。可分析來自癌癥患者的其它樣品，作為組織微陣列結果的替代或除組織微陣列結果之外。例如，來自乳腺癌患者的樣品的分析可以確認來自組織陣列的結論，患者的應答是否與受體表達和/或下游信號轉導的特定模式相關聯。本發明部分地提供了用于進行本發明的方法的試劑盒。例如，所述方法提供了用于評估個體中結腸直腸癌癥發展的試劑盒，包括至少兩種試劑，優選抗體，其可以檢測EGF途徑中的多肽的表達、磷酸化或兩者。例如，所述試劑盒可以含有與EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67結合的至少兩種、三種或四種試劑。此外，所述試劑盒可以包括除了以上鑒定的試劑之外的其它成分，包括但不限于其它抗體。例如，臨床醫師或醫師可以使用這樣的試劑盒，來幫助選擇用于特定患者的適當的治療。說明性的目的而列出，并且不認為是限制本發明。實施例1在結腸直腸腫瘤發展中EGF途徑中下游分子的免疫組織化學染色為了確定是否可鑒定與癌的病理分期相關的結腸直腸癌癥的生物標記物分布(profile)，使用商業上可獲得的組織陣列和來自個體病例的組織樣品檢查了結腸直腸癌癥病例中與EGFR的表達相聯系的生物標記物的表達水平。使用免疫組織化學("IHC")評定生物標記物。將VentanaMedicalSystems的鼠抗體克隆3C6用于通過免疫組織化學檢測HER1/EGFR表達。3C6克隆與受體的細胞外域反應。研究的其它生物標記物是pHERl、PTEN、pAKT、pMEK、Ki67和pERK。還評估了pTYR作為活化的替代(surrogate)。如以下和表l中的描述，并根據指定的包裝插頁使用所有試劑。在FFPE單玻片切片中，和在多組織陣列中評估了探針和抗體在自動化IHC規程中檢測蛋白質標記物的性能(參見表2)。在Ventana，sBenchMarkXT和/或Discovery⑧XT染色平臺上進行所有IHC分析。表1.組織化學規程<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>對于單玻片切片，收獲細胞并固定在10。/o中性緩沖液的福爾馬林("NBF")中，然后石蠟包埋("FFPE，，)。將FFPE細胞在1500rpm離心IO分鐘。除去上清'液，添力口3滴ShandoncytoblockCellBlockPreparationSystem("ShandonCytoblock")(ThermoElectronCorporation,Waltham,MA)的試劑1。將細月包在3000rpm離心2分鐘。將三(3)滴ShandonCytoblock試劑2滴下到試管側面以使試劑2流到細胞沉淀懸浮液之下。將樣品溫育10分鐘，然后添加5ml70%乙醇(沉淀漂浮在乙醇的頂部)。最后，將樣品在3000rpm旋轉2分鐘，然后轉移到活檢盒，并加工用于石蠟包埋。觀察了蘇木色素和曙紅("H&E")染色來證實切片對于IHC和原位雜交(ISH)的適用性(圖3)。H&E染色包括以下步驟在二曱苯、100%乙醇和950/0乙醇中脫蠟，然后浸入水中。載玻片浸入蘇木色素中3分鐘，在水中清洗，浸入藍色試劑(bluingreagent)中1分鐘，在水中清洗，浸入曙紅中，最后添加蓋玻片。免疫分析包括以下步驟抗原去屏蔽，以及在與相關的初級和二級抗體溫育之后檢測。作為陰性對照，BenchMarkXT⑧或DiscoveryXTDiluent(Ventana)與相關的玻片溫育。使用DABMap、OmniMap(DiscoveryXT)或iViewTMDAB(BenchMarkXT⑧)檢測試劑盒根據制造商的說明書來檢測初級抗體。筒要地，iVIEWDAB檢測試劑盒檢測與石蠟包埋的或冷凍組織切片中的抗原結合的特異性小鼠IgG、IgM和兔IgG抗體。通過生物素綴合的二級抗體來定位特異性抗體。這個步驟之后是添加結合二級抗體上存在的生物素的抗生蛋白鏈菌素-酶綴合物。然后利用沉淀顯色酶產物來顯現復合物。在每個溫育步驟的結束時，自動化玻片染色儀洗滌切片以除去未結合的材料，并施加液體蓋玻片，其將水性試劑從玻片的蒸發最小化。使用光學顯微鏡來解釋結果，并幫助病理過程的差異診斷，其可以或可以不與特定的抗原相關聯。作為具體的實例，通過以下方式完成pMEK的檢測。病理學家觀察H&E來證實組織的腫瘤存在，以及細胞系與組織的細胞生存力。初級抗體pMEK從CellSignalingTechnology,Inc.("CST，，)(Danvers，MA)獲得。對于pMEKIHC分析，在VentanaBenchmark⑧系列儀器上用CC1調節緩沖液在100。C進行細胞調節60分鐘，其中CC1是高pH細胞調節溶液Tris/Borate(硼酸鹽)/EDTA緩沖液，pH8(Ventana)。將載玻片與1/40稀釋度的儲備濃度的初級pMEK抗體(表l)在室溫溫育1小時。儲備抗體濃度是指抗體商業上銷售的濃度；此信息某些制造商是不提供的，并通過實驗確定適當的稀釋度。作為陰性對照，將根據制造商的說明書使用的Ventana抗體稀釋齊寸，在相同的條件下與相關的載玻片溫育。根據制造商的說明(VectorLaboratories,Burlingame,CA)使用VentanaiViewDAB檢測試劑盒(除了通用的二級抗體之外，其被載體生物素化的抗兔IgG替代)來4全測pMEK抗體，在37。C應用32分鐘。根據制造商的說明書和所使用的試劑盒(參見表l),使用抗生蛋白鏈菌素辣根過氧化酶綴合物(Ventana)，隨后在二氨基聯苯胺("DAB")和硫酸銅的存在下與過氧化氬反應來實現pMEK的酶學檢測/定位。除了載體生物素化的二級兔抗體之外，綴合物和所有顯色試劑也是iView檢測試劑盒的成分，并在制造商建議時應用。結腸直腸發展組織孩么陣列(TMA;CHTN2003CRCProg)從合作人組織網絡(CHTN)獲得。陣列的細節示于圖4，并在表2中概述。簡要地，這種福爾馬林固定的和石蠟包埋的("FFPE")結腸直腸癌癥發展陣列是通過從供體收集樣品而創建的。這種TMA代表有限數目的病例，其可以在差異基因表達中檢測到強的趨勢。未染色的組織切片為4微米厚，在帶電的玻璃載片上提供。CHTN2003CRCprogTMA含有多至20例的非新生物結腸粘膜、14例的腺瘤性息肉、14例的原發性結腸直腸腺癌、7例的向區域淋巴結轉移性的腺癌和7例向遠端位點轉移性的腺癌。每個病例用0.6mm核心采樣三次。表2.CHTN結腸直腸發展陣列的組成<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>人工計分由委員會證明的(board-certified)病理學家來進行。記錄染色強度、反應性細胞的百分比和細胞位置。對于IHC的病理學家評估，染色強度的分值從0(陰性)到3+(最陽性的)。光學成象利用具有根據轉變成數字分值的染色強度(表示為平均光密度，或平均OD)的圖像量化的數字應用。對于每個樣品捕獲高分辨率圖像，OD值是基于陽性染色的細胞的顏色范圍的特定分級器(classifier)。用于分析的圖像使用40x物鏡捕獲。在某些情況下，得到"組合的分值，，或乘法指數，其并入根據以下公式的陽性細胞的百分比和染色強度組合的分值=(%陽性)x(光密度分值)。使用ptyr活性作為活化的替代量度的組織化學組織評定的結果顯示，與來自癌癥和非癌癥病例的正常結腸粘膜相比，在瘤形成和發炎的非新生物組織中的表達增加(圖5)。TMA中EGFR途徑分子的表達水平的組織化學評估結果在圖6-9中顯示。個體病例中EGFR途徑分子的表達水平的組織化學評估結果在圖IO中示出。來自兩個實驗的結果都顯示，隨著結腸直腸癌癥發展通過連續的分期類別，pMEK、Ki67和pHERl蛋白水平提高，而EGFR、PTEN和pAKT蛋白水平降低(圖11)。這些發現鑒定了生物標記物分布，其在診斷和跟蹤結腸直腸腫瘤發展中是有用的，包括在早期小的腺瘤中高水平的EGFR(蛋白)、PTEN和低水平的pMEK，以及在包括惡性表型的發展的疾病狀態中低水平的PTEN和高水平的pMEK。實施例2利用原位雜交的結腸直腸癌癥腫瘤分期和EGFR基因拷貝數之間的相關性在來自個體病例的單玻片切片和多組織陣列上預先形成EGFR的焚光原位雜交(FISH),以評估結腸直腸癌癥發展中的基因狀態。利用雙色FISH，在福爾馬林固定的、石蠟包埋的(FFPE)單玻片切片中和在多組織陣列中評估每個細胞的EGFR基因拷貝的數目(圖12)。單玻片切片和多組織陣列的細節在實施例1中概述。使用來自Ventana(SpectrumOrange標記的)、Invitrogen(SPOTLightTM-EGFR，DIG標i己的)或Vysis(SpectrumOrangeEGFR和SpectrumGreenCEP7標記的探針)的任何探針來進行EGFR基因的原位雜交檢測。在VentanaDiscoveryXT上用完全自動化的規程來檢測來自Ventana和Zymed的EGFR探針。Vysis探針的檢測是半自動化的，具有離線進行的探針雜交，如制造商(Vysis,DownersGrove,IL)所述。根據制造商的包裝插頁(Vysis,Cat.No.32-191053)進行FISH規程。如Hirsch等JCO,21:3798-3807)中所述來進行FISH評估。圖12顯示來自顯示平衡的二體性、平衡的三體性、平衡的多體性和基因擴增的細胞的代表性顯微照片。通過病理觀察測定了EGFR和CEP7的每個細胞的基因拷貝平均數。在個體病例中和在TMA中的EGFRFISH分析的結果顯示從小的腺瘤到腺癌，EGFR基因狀態從平衡的二體性(正常)進化到平衡的三體性/多體性(異常)，如表3所示。具有提高水平的EGFR基因拷貝數(三體性+)的樣品都具有如IHC所分析的有高水平蛋白質的亞群(3+,>50°/。)(實施例1)。實施例1和2的發現還暗示了在早期癌癥階段中不一致的(discordant)基因擴增水平(正常)和蛋白質表達水平(高)。表3.結腸直腸癌癥發展中EGFR基因表達的概要分布<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例3腫瘤內EGFR途徑分子的表達水平中的異質性在結腸直腸癌癥病例研究中評估EGFR途徑分子的表達水平，以評價在單個胂瘤中這些分子的表達水平方面可能的異質性。呈現直腸出血和腹部絞痛(abdominalcramping)的41歲男性診斷具有3cm直腸胂塊。放療之后的末端結腸切除術顯示階段T3的良好分化的直腸腺癌。如實施例1中詳述的制備來自腫瘤的各個區域的單玻片切片。如實施例1中所述，進行IHC以測定EGFR、HER-2、pAKT、Ki67、存活蛋白和VEGF的表達水平。用來自Novus的抗體(NB500-201)通過在室溫溫育2小時來檢測存活蛋白。使用來自SantaCruz的抗體(SC-7269)通過在室溫包括1小時來檢觀寸VEGF。圖14-19顯示肺瘤生物標記物的表達水平在同一腫瘤內可顯著變化。這些結果顯示，患者可以受益于針對特定腫瘤的個體的表達標志修整的個體化的組合治療。應該理解的是，上述公開強調了本發明的某些特定的實施方式，而且與其等同的所有修改或替換在如所附的權利要求所闡述的本發明的精神和范圍之內。權利要求1.一種評估個體中結腸直腸癌癥發展的方法，包括分析獲自所述個體的組織或細胞樣品來檢測一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式，其中所述生物標記物是EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHER1、pERK或Ki67，其中所述一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式基本上類似于來自對結腸直腸發展的診斷是特征性的組織或細胞樣品的一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式。2.—種評估個體中結腸直腸癌癥發展的方法，包括分析獲自所述個體的組織或細胞樣品來檢測一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式，其中所述生物標記物是EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67，其中所述一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式不同于來自第二組織或細胞樣品的一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式。3.權利要求2的方法，其中所述第二組織或細胞樣品是非結腸直腸癌癥組織或細胞樣品。4.權利要求2的方法，其中所述第二組織或細胞樣品是來自發展的早期的結腸直腸組織或細胞樣品。5.權利要求4的方法，其中來自發展的早期的所述結腸直腸組織或細胞樣品是從所述個體獲得的。6.權利要求l的方法，其中分析獲自所述個體的組織或細胞樣品來檢測兩種或更多生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式，其中所述兩種或更多生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式基本上類似于來自對結腸直腸發展的已知診斷是特征性的組織或細胞樣品的兩種或更多生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式。7.權利要求6的方法，其中所述生物標記物是EGFR、PTEN、pMEK、Ki67和pHERl。8.權利要求1的方法，還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟。9.權利要求l的方法，其中所述方法評估個體中處在小的腺瘤階段的結腸直腸癌癥發展。10.權利要求9的方法，還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟，其中所述擴增、缺失或重排的程度在兩種樣品中是基本上類似的。11.權利要求9的方法，其中來自獲自所述個體的組織或細胞樣品的一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式包括與非腫瘤組織或細胞樣品中所表達的、所磷酸化的、或所表達和磷酸化兩者的情況相比，更大的EGFR的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者，更大的PTEN的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者，或降低的pMEK的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者。12.權利要求11的方法，還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟，其中在獲自所述個體的組織或細胞樣品中所述擴增、缺失或重排的程度是平衡的二體性。13.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式基本上類似于來自對小的腺瘤是特征性的組織或細胞樣品的一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式。14.權利要求13的方法，還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟，其中所述擴增、缺失或重排的程度在兩種樣品中是基本上類似的。15.權利要求1的方法，其中所述方法評估個體中處在腺癌階段的結腸直腸癌癥發展。16.權利要求15的方法，還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟，其中所述擴增、缺失或重排的程度在兩種樣品中是基本上類似的。17.權利要求15的方法，其中來自獲自所述個體的組織或細胞樣品的一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式包括與小的腺瘤組織或細胞樣品中所表達的、所磷酸化的、或所表達和磷酸化兩者的情況相比，降低的PTEN的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者，或更大的pMEK的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者。18.權利要求15的方法，還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟，其中在獲自所述個體的組織或細胞樣品中所述擴增、缺失或重排的程度是平衡的二體性和平衡的三體性。19.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式基本上類似于來自對腺癌是特征性的組織或細胞樣品的一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式。20.權利要求19的方法，還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟，其中所述擴增、缺失或重排的程度在兩種樣品中是基本上類似的。21.權利要求1的方法，其中所述方法評估個體中處在惡性腺癌階段的結腸直腸癌癥發展。22.權利要求21的方法，還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟，其中所述擴增、缺失或重排的程度在兩種樣品中是基本上類似的。23.權利要求21的方法，其中來自從所述個體獲得的組織或細胞樣品的一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式包括與小的腺瘤組織或細胞樣品中所表達的、所磷酸化的、或所表達和磷酸化的情況相比，降低的PTEN的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者，更大的pMEK的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者，并所述方法還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟，其中獲自所述個體的細胞樣品的組織的基因狀態是平衡的二體性和平衡的多體性。24.權利要求21的方法，還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟，其中在獲自所述個體的細胞樣品的組織中所述擴增、缺失或重排的程度是平衡的二體性和平衡的多體性。25.權利要求1的方法，其中所述一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式基本上類似于來自對惡性腺癌是特征性的組織或細胞樣品的一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式。26.權利要求25的方法，還包括使用標記的基于核酸的探針測量編碼EGFR的基因組DNA的擴增、缺失或重排的步驟，其中所述擴增、缺失或重排的程度在兩種樣品中是基本上類似的。27.權利要求1的方法，其中所述分析步驟包括在使用標記的特異性結合試劑染色之后對組織切片的計算機輔助的圖像分析。28.—種鑒定對化學治療劑有反應的結腸直腸癌癥腫瘤的方法，包括分析獲自所述結腸直腸癌癥腫瘤的組織或細胞樣品來檢測一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式，其中所述生物標記物是EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67，其中所述生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者將所述哺乳動物腫瘤鑒定為用化學治療劑可治療的。29.權利要求28的方法，其中所述化學治療劑是EGFR抗體。30.權利要求28的方法，其中所述化學治療劑是激酶抑制物。31.權利要求28的方法，其中所述化學治療劑既是EGFR抗體又是激酶抑制物。32.權利要求28的方法，其中所述方法包括分析獲自所述個體的組織或細胞樣品來檢測兩種或更多生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的模式。33.—種用于評估個體中結腸直腸癌癥發展的試劑盒，包括用于檢測一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的至少兩種試劑，其中所述生物標記物是EGFR、PTEN、pAKT、pMEK、pHERl、pERK或Ki67。34.權利要求33的試劑盒，其中所述試劑盒包括用于檢測一種或多種生物標記物的表達、磷酸化、或表達和磷酸化兩者的至少三種試劑。35.權利要求33的試劑盒，其中所述生物標記物是EGFR、pHERl、PTEN、pMEK、pERK或Ki67。36.權利要求33的試劑盒，其中所述生物標記物是EGFR、PTEN或pMEK。37.權利要求33的試劑盒，其中所述生物標記物是PTEN和pMEK。38.權利要求33的試劑盒，還包括用于檢測EGFR基因擴增、缺失或重排的試劑。39.權利要求38的試劑盒，其中所述生物標記物是EGFR、pHERl、PTEN、pMEK、pERK或Ki67。40.權利要求38的試劑盒，其中所述生物標記物是EGFR、PTEN或pMEK。41.權利要求38的試劑盒，其中所述生物標記物是PTEN和pMEK。全文摘要本發明提供了使用來自個體的含有組織或腫瘤細胞的樣品來評估腫瘤發展的試劑和方法。本發明還提供了用于評估對化療的反應的試劑和方法。文檔編號G01N33/574GK101384901SQ200780005752公開日2009年3月11日申請日期2007年2月16日優先權日2006年2月16日發明者加里·A·佩斯塔諾,琳達·K·薩馬德扎德申請人:文塔納醫療系統公司