專利名稱：：恙蟲病診斷制劑的制作方法
技術領域：
：本發明涉及恙蟲病的診斷試劑盒，其中使用東方恙蟲(CWe"r/"to加gaw^/n')的混合抗體檢測生物樣品中的抗東方恙蟲抗體。
背景技術：
：恙蟲病是由東方恙蟲引起的一種急性發熱疾病，東方恙蟲屬于立克次氏體科(Rickettsiaceae)恙蟲病屬(scrubtyphus)，并通過幼蟲期恙螨(trombiculidmite)的叮咬傳播。諸如發冷、發燒和頭疼的癥狀在被幼蟲期恙螨叮咬后大約10天(1到3周)發生，并且皮疹在癥狀發生后約一周開始出現在人體軀干上，隨后呈離心狀擴散到四肢。水泡在幼蟲期恙螨的叮咬部位出現，隨后是大小為0.5到0.8cm的潰瘍的形成。潰瘍被黑色的痂覆蓋，其稱為焦痂。一些患者會發生呼吸道癥狀，其中胸部X光檢查顯示患者中大約一半出現肺浸潤(pulmonaryinfiltration)。在一些嚴重的病例中，中樞神經系統可能被感染，導致失去知覺或死亡。恙蟲病在世界范圍內發生，但是在亞洲，包括日本、中國、馬來西亞、泰國、越南等地特別普遍(《韓國的恙蟲病(TsutsugamushidiseaseinKorea)》，WooHyunJang編輯，SeoheungCo.出版，第21-27頁，1994)。該疾病在10月發生最頻繁，通常在秋季，9月到12月早期(Kim等，Infection20;105-116,1988)。在野外工作或野營的人可能有患恙蟲病的風險。東方恙蟲的致病性是由于攻擊血管內皮細胞產生的系統性血管炎(systemicvasculitis)引起的。侵入血液后，東方恙蟲在血管內皮細胞中復制，引起血管損傷，或微血管血栓和血管周圍的炎癥。因此，該疾病在組織病理學上的特征為多種器官的血管被損傷，其可以引起皮膚壞死、皮疹、腦膜炎、脫發、心肌炎和心力衰竭。而且，已經報道了由于血管內凝結引起的低纖維蛋白原血癥(hypofibrinogenemia)的病例。在一些情況下，該疾病的癥狀或傳染病學特征根據東方恙蟲的每個血清變型而不同。屬于相同血清型的恙蟲菌彼此在血清學上相關，并且在屬于不同血清型的細菌之間沒有或僅有很弱的血清學交叉反應性。東方恙蟲被分類為一個種。然而，存在許多有不同抗原性的血清型，并且根據抗原性，它們被分類為各種血清型，諸如Gilliam、Karp和Kato菌株。在韓國的傳染性菌株中，已經分離出了具有與已知傳染性原型菌株(epidemicprototypestrain)Gilliam和Karp不同血清學反應性的Kangwon和Boryong。這樣的血清型多樣性取決于東方恙蟲的膜蛋白抗原，如種特異抗原(species-specificantigen)禾口血清型特異抗原(serotype-specificantigen)。抗原從東方恙蟲中純化，并隨后用聚丙烯酰胺凝膠電泳和免疫印跡法分析。結果，發現大小為70kDa、60kDa、54到56kDa和46到47kDa的主要抗原存在(TakahashiK等，Microbiol.Immunol.29:475,1985)，大小為46到47kDa、54到56kDa和70kDa的每種抗原都具有很強的抗原性，并且大小為70kDa和46到47kDa的每種抗原都是菌株特異性抗原(strain-specificantigen)(TamuraA等，Microbiol.Immunol.26:321,1982)。普遍認為恙蟲病不顯示嚴重的臨床癥狀，并且臨床診斷很容易從典型的癥狀和標志上辨識出。然而，非典型癥狀和標志已經在很多病例中有報道。因此，在恙蟲病的特定癥狀，如系統性淋巴增生和焦痂形成沒有觀察到的病例中，難以區分恙蟲病與其它急性發熱疾病，如細螺旋體病、鼠型斑疹傷寒和帶有腎綜合癥的出血熱。有一些通過使用培養物分離病原體或使用免疫熒光測試鑒定抗體來診斷恙蟲病的精確方法。然而在使用免疫熒光測試的診斷方法中，需要細胞培養以獲得立克次氏體抗原，而且長時間儲存這些抗原是困難的。診斷也需要熒光顯微鏡，該診斷僅能在擁有熒光顯微鏡的實驗室中進行。因此，對患者可能經常發生的農村地區的醫院來說進行免疫熒光測試是困難的。發明公開技術方案為了克服上述困難，發明人對恙蟲病的診斷試劑盒進行了詳盡的研究，其中不需要細胞培養，來自順序連接的三種血清型每個基因的嵌合重組蛋白是提高診斷靈敏性的基本抗原，這是與單一血清型基因的重組抗原相比，并且額外制備的來自其它兩種血清型的每一單個基因的重組蛋白作為抗原被加入以極大地提高靈敏性。因此，本發明的一個目的是提供恙蟲病的診斷試劑盒，其包括含有恙蟲混合抗原的測試條帶(teststrip)。本發明的另一個目的是提供恙蟲病的診斷試劑盒，其中兩個測試條帶在塑料裝置中相連，以同時檢測IgM和IgG抗體。附圖簡述圖1是顯示10。/。SDS-PAGE結果的圖片，以證實純化表達的重組抗原蛋白的過程。圖2是顯示使用點印記免疫測定方法顯示從轉化的大腸桿菌中純化的蛋白(cr56、r21和kr56的混合物)與來自患者的血清之間的反應性的圖片，以證實其作為診斷抗原的適合性。圖3顯示了依據本發明的診斷試劑盒中的測試條帶的結構，其通過引入免疫色譜技術制造。圖4顯示了用塑料蓋起的診斷試劑盒最終樣品的結構和在本發明的診斷試劑盒中分析其結果的方法。圖5是顯示本發明診斷試劑盒的靈敏性和特異性的圖，其中(A)顯示了使用來自由IFA診斷的患者(n=30)的血清評估快速診斷試劑盒靈敏性的結果，且(B)顯示了使用來自健康患者(n-10)的血清、來自患有鼠型斑疹傷寒患者(r^11)的血清、來自患有細螺旋體病患者(n=7)的血清、及來自患有腎綜合癥出血熱患者(n=8)的血清來評估特異性的結果。實施本發明的最佳方式在一種實施方式中，本發明涉及恙蟲病診斷試劑盒，其包括測試條帶，該測試條帶含有恙蟲的混合抗原。特別地，本發明涉及恙蟲病診斷試劑盒，其包括檢測生物樣品中抗東方恙蟲抗體的測試條帶，其中測試條帶包括(a)吸收樣品的樣品墊(samplepad);(b)與樣品中人類抗體結合的金結合墊(goldconjugationpad);(c)測試膜(testmembrane),包含含有恙蟲混合抗原的測試線(testline)和含有對照蛋白的對照線(controlline);和(d)吸收剩余樣品的吸收墊(absorptionpad)。如圖3所示，本發明用于恙蟲病的診斷試劑盒優選地包括含有樣品墊、金結合墊、測試膜和吸收墊的的測試條帶。樣品墊疊置在金結合墊上，形成第一重疊部分，并且金結合墊疊置在膜上，形成第二重疊部分。此外，膜和吸收墊形成第三重疊部分。當生物樣品被逐滴加入到樣品墊上時，該樣品通過毛細作用遷移穿過金結合墊，例如含有金標記的蛋白A的金結合墊。金標記的金顆粒優選地具有20到55nm的直徑，更優選地20到40nm，并且充當指示染料(indicatordye)。當生物樣品遷移通過金結合墊時，樣品中的抗體與金標記的蛋白A或類似物結合形成復合體(complex),并且該復合體沿膜遷移。術語"生物樣品"用在此處表示來自哺乳動物，包括疑似患有恙蟲病的人類的血清或血漿。生物樣品在逐滴加入到本發明診斷試劑盒的樣品墊上之前可以被稀釋或未被稀釋。在生物樣品中存在恙蟲抗體的情況下，當樣品遷移穿過診斷試劑盒中含有恙蟲混合抗原的測試線時，抗體與恙蟲混合抗原結合從而使得測試線上顏色發生變化，這種變化可以用肉眼觀察到。然而，在生物樣品中不存在恙蟲抗體的情況下，恙蟲混合抗原無法與抗體結合，因而不會使測試線上產生顏色變化。特別地，在本發明優選的實施方式中，恙蟲抗體在膜上與測試線中固定的恙蟲混合抗原結合。該抗原-抗體復合物通過金顆粒形成為指示染料。結果，觀察到紅紫色的條帶，這表示陽性反應，也就是說生物樣品中存在恙蟲抗體。術語"恙蟲混合抗原"用在此處表示從東方恙蟲Gilliam、Karp和Kato菌株中衍生的重組抗原蛋白、從Kangwon菌株中衍生的抗原蛋白和從Boryong菌株中衍生的抗原蛋白的混合物，其中每個菌株都會引起恙蟲病。也就是說，恙蟲的混合抗原是從重組融合基因中衍生的嵌合重組蛋白的混合物，其中編碼東方恙蟲Gilliam、Karp和Kato菌株的抗原表位的基因依次相連，并且每個重組蛋白是由編碼東方恙蟲Kangwon和Boryong菌株抗原的基因衍生得到的。特別地，在本發明中，可以通過一步方法生產、分離并純化融合蛋白抗原，其中編碼標準血清型Gimam、Karp和Kato菌株中56kDa蛋白片段的基因通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增，擴增的DI、A片段被依次連接，重組DNA被克隆進蛋白表達載體中以在大腸桿菌中表達，并且表達的蛋白被分離和純化，用作診斷恙蟲病的抗原，這是基于韓國專利申請號2002-0020281，其公開了東方恙蟲的56kDa蛋白具有抗原性，因此可以被有用地用作診斷蛋白。而且，在本發明中，除了東方恙蟲Gilliam、Karp和Kato菌株，編碼東方恙蟲Kangwon菌株的56kDa抗原蛋白的基因和編碼東方恙蟲Boryong菌株的21kDa抗原蛋白的基因通過PCR擴增，擴增的DNA片段被克隆進蛋白表達載體以在大腸桿菌中表達，并且表達的蛋白被分離和純化，與由東方恙蟲Gilliam、Karp和Kato菌株衍生的56kDa嵌合重組蛋白一起用作診斷蛋白，以便提高對恙蟲病的診斷靈敏性。在一種優選的實施方式中，在本發明的診斷試劑盒中，東方恙蟲Gilliam、Karp和Kato菌株的56kDa重組嵌合蛋白，東方恙蟲Kangwon菌株的56kDa重組蛋白和東方恙蟲Boryong菌株的21kDa重組蛋白以lmg/ml的濃度分別制備，隨后它們以5:2:1的體積比混合。將lmg/ml的恙蟲混合抗原被逐滴加入到測試線上。恙蟲病的陽性結果是除了對照線外，在測試線上顯示出顏色的情況。對照線是確定該診斷試劑盒是否工作的。在恙蟲病陰性反應中，僅在對照線上顯示出顏色。對照線含有與金標記抗體結合的對照蛋白。金標記抗體的例子包括兔抗山羊igG多克隆抗體，山羊抗人IgG多克隆抗體或山羊抗人IgM多克隆抗體。對照線可能含有0.1mg/ml到lmg/ml的對照蛋白。在一種優選的實施方式中，本發明的診斷試劑盒進一步包括含有不表達恙蟲抗原蛋白的大腸桿菌提取物的預測試線(pre-testline)。在使用大腸桿菌衍生的東方恙蟲抗原蛋白的本發明的診斷試劑盒中預測試線允許去除任何由非特異結果產生的誤診的可能性，所述非特異結果來自人體中的大腸桿菌衍生的抗體對在純化的恙蟲抗原蛋白中污染的大腸桿菌蛋白的反應。該預測試線可能含有濃度為0.5mg/ml到0.6mg/ml的大腸桿菌提取物。測試膜可以含有合適的材料，如標準尺寸為10x500nm的硝酸纖維素膜(MoliporeTMXA3J072100)。在測試膜中，預測試線、測試線和對照線優選地以這種順序排列。預測試線、測試線和對照線被排列為間隔2.0到4.5mm，優選地2.5到3.0mm。金結合墊可以含有合適的檢測標記。標記的實例包括金標記的蛋白A，金標記的抗人IgG抗體和金標記的抗人IgM抗體。金結合墊優選地被置于樣品墊附近。在金結合墊含有過量金標記的標記物的情況下，在恙蟲抗體的下限濃度中產生的被過度放大的信號增加，從而引起假陽性的結果。因此，在本發明中，金膠體溶液被稀釋到1到6的光密度(OD)，優選地2到4。吸收墊被置于膜上相對立的一端并通過毛細作用吸收沿膜遷移的生物樣品，如血清或血漿。在一種特定的實施方式中，本發明的診斷試劑盒可以包括測試條帶。可選地，如圖4所示，本發明的診斷試劑盒可以包括兩個條帶一一從樣品墊分開的第一條帶和第二條帶。此時，第一條帶可以被用于檢測人IgG抗體，且第二條帶可被用于檢測抗恙蟲抗原蛋白的人IgM抗體。第一條帶可以包括含有山羊抗人IgG抗體或蛋白A的金結合墊，和含有兔抗山羊IgG多克隆抗體的對照線。第二條帶可以包括含有山羊抗人IgM抗體的金結合墊和含有山羊抗人IgM多克隆抗體的對照線。如圖4所示，第一條帶和第二條帶優選地可以平行排列，但是并不限于這樣。第一條帶和第二條帶可以被順序連接，以相反方向或以多種方向排列。測試條帶可以用環形盒(surroundingcase)包裝以確保每一個本發明診斷試劑盒的安全性。診斷試劑盒可以長時間(至少12個月或更長)儲存在室溫下，而無診斷活性的任何損失。在一種特定的實施方式中，診斷耗費5到10分鐘，不超過15分鐘。診斷結果表明患者是否被恙蟲感染。舉例來說，如果生物樣品是從被恙蟲感染的患者收集的，那么本發明的診斷試劑盒給出陽性反應，借此該患者可以被診斷為患有恙蟲病。如果生物樣品是從未被恙蟲感染的患者收集的，那么本發明的診斷試劑盒給出陰性反應，借此該患者可被診斷為未患恙蟲病。使用間接熒光抗體技術、點印記免疫分析和酶聯免疫吸附測定(ELISA)，評估恙蟲混合抗原對恙蟲病的靈敏性和特異性。結果，發現從東方恙蟲Gilliam、Karp和Kato菌株衍生的56kDa重組融合蛋白和從東方恙蟲Boryong菌株衍生的21kDa蛋白具有95。/。或更高的靈敏性和特異性。而且，在使用含有上述蛋白和從東方恙蟲Kangwon菌株衍生的56kDa蛋白的試劑盒檢測顯示非常弱的陽性信號的血清的情況下，陽性信號變強，也就是說，其靈敏性得到提高(100%)。因此，本發明中使用的恙蟲混合抗原被發現具有優良的靈敏性和特異性。在一種實施方式中，本發明提供了恙蟲病的診斷組合物，其含有從東方恙蟲Gilliam、Ka卬和Kato菌株衍生的56kDa融合蛋白，從東方恙蟲Kangwon菌株衍生的56kDa蛋白，和從東方恙蟲Boryong菌株衍生的21kDa蛋白作為恙蟲混合抗原。在一種優選的實施方式中，在恙蟲混合抗原中從東方恙蟲Kangwon菌株衍生的56kDa蛋白具有SEQIDNO:6的氨基酸序列，從東方恙蟲Boryong菌株衍生的21kDa蛋白具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。—般地，人體中東方恙蟲的存在必須被確認，以便診斷疑似患有恙蟲病的人是否被感染。當前恙蟲病的診斷使用免疫熒光抗體技術進行。有利之處在于該技術具有高靈敏性和特異性，并通過分別測量IgG和IgM區分原發感染和再感染。然而，不利之處在于需要細胞培養的設備，由于其復雜的過程，只有高度熟練的專家才能進行，以及也需要高額成本和時間。相反，由于本發明的診斷方法通過抗原-抗體反應使用免疫色譜法進行，恙蟲病可在短時間內，約10分鐘，被準確且簡便地診斷。因此，本發明的診斷方法可以說比傳統診斷方法更好。使用上述恙蟲病診斷試劑盒檢測抗恙蟲病抗體的方法如下。首先，當待分析的生物樣品被逐滴加入到診斷試劑盒的樣品墊——吸收樣品的部分——時，該生物樣品通過毛細作用遷移至金結合墊。此時，生物樣品中的抗體與金結合墊中的標記物，如金標記的蛋白A、金標記的抗人IgG抗體或金標記的抗人IgM抗體結合，以形成膠體。待分析的生物樣品未被固定在金結合墊中，而是繼續遷移至測試線，恙蟲的混合抗原被固定在測試線中。在樣品來自感染恙蟲病的患者的情況下，該樣品與恙蟲混合抗原反應，以產生抗原-抗體反應。也就是說，與金結合墊中的特異性標記物結合的抗恙蟲抗體與固定在測試線中的恙蟲混合抗原結合形成紅紫色條帶。因此，該條帶可用肉眼觀察。金結合墊中未與測試線反應的剩余標記物遷移至對照線與對照蛋白反應。接著，形成紅紫色條帶，借此確保測試的一致性。如上文所述，本發明的診斷試劑盒通過抗原-抗體反應使用免疫色譜法進行，借此可用肉眼觀察結果而不需要任何儀器。而且，該診斷試劑盒的預測試線消除了任何誤診的可能性——其可能是由于人血清中而非東方恙蟲中存在的抗大腸桿菌抗體而出現，從而提高了恙蟲病診斷的準確性。在下文中，將根據實施例更詳細地描述本發明。然而，這些實施例僅僅是出于示例性的目的，并且本發明并非意欲被這些實施例限制。本發明的實施例實施例l:抗原蛋白的表達和分離1-1.56kDa嵌合重組蛋白(cr56)的表達含有東方恙蟲Gilliam、Karp禾卩Kato菌株主要表位的嵌合重組蛋白(cr56)按照與韓國專利號2002-0020281中公開的實施例相同的方式進行表達、分離和純化。特別地，東方恙蟲Gilliam、Karp和Kato菌株在小鼠L-929細胞中培養，收集并純化。純化的細胞用酶消化，隨后其DNA用苯酚和乙醇提取。基于東方恙蟲56kDa蛋白的基本序列，選擇Boryong和Gilliam、Karp及Kato血清型中具有30%或更高氨基酸序列同源性的每個DNA部分，并且為Gilliam、Karp和Kato菌株的每一個制備一對寡核苷酸引物。用每對引物和作為模板的東方恙蟲的純化DNA進行PCR，以擴增Gilliam、Karp禾tlKato菌株的DNA片段。PCR產物被純化并克隆，以連接在pTYB12載體的限制性酶消化位點。首先，Gilliam菌株的DNA片段被引入pTYB12載體以制備載體pTG3，隨后Karp菌株的DNA片段被引入pTG3載體以制備載體pTGPl。Kato菌株的DNA片段被引入pTGPl載體以制備載體pTGPT2。此外，與Gilliam、Karp和Kato菌株的DNA序列順序連接的DNA片段被從pTGPT2載體中切下。該DNA片段被引入pET22b(+)載體中以制備載體pETb7。用制備的表達載體轉化大腸桿菌，隨后培養轉化的大腸桿菌以誘導融合蛋白的表達。該融合蛋白使用電泳和蛋白質印跡法確認，分離并純化。1-2.東方恙蟲Boryong菌株的21kDa重組蛋白(r21)的表達東方恙蟲Boryong菌株中具有種特異抗原性的基因在大腸桿菌中表達，以根據以下方法分離并純化重組蛋白(r21)。(2)PCR擴增包括NdeI禾nXhoI限制性位點的修飾引物(表1)被加入到lOOng純化的儲存DNA中，至20pmol。用10xTag聚合酶緩沖液(lOOmMTris-HCl，15mMMgCl2，500mMKCl，lmg/ml明膠，pH8.3)、dNTPs和Tag聚合酶進行PCR。DNA的擴增通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳證實。克隆Boryong菌株21kDa重組蛋白的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*質粒pET22b表達組氨酸標記的融合蛋白氨基酸序列的一部分，84(250bp)到445(l,335bp),己知的Kangwon87-61的主要抗原結構域，被修飾以包含NcoI和SalI限制性位點。然后，制備一對引物(表2)并進行PCR反應。PCR產物和表達載體pET30a用限制性酶NcoI和SalI消化，并隨后彼此連接。用該質粒轉化大腸桿菌BL21細胞，隨后提取其蛋白。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2)基因克隆與表達由聚合酶鏈反應擴增的DNA(氨基酸84(250bp)到445(1,335bp)的362個氨基酸(共1,0866))通過用1.2%的瓊脂糖電泳分離，并隨后使用QIAGEN凝膠洗脫試劑盒(QIAGENInc.,USA)回收。具有正確大小的擴增DNA條帶被在紫外透射儀上切出。該條帶被轉移至微量管中并用Nal溶液(瓊脂糖凝膠體積的3倍)在6(TC完全溶解5分鐘。向其中加入玻璃乳(glassmilk)，并旋轉該微量管IO秒鐘。溶液在室溫下17,000g(Hanil，AL5S-24，12,000rpm)離心1分鐘以去除上清液。該微量管在室溫下放置5分鐘，并干燥。洗脫緩沖液被加入到其中，接著微量管被旋轉并在17，000g(12,000rpm)離心。新上清液被轉移到新的微量管中。純化的PCR產物和pET30a載體用限制性酶NcoI和SalI消化，并隨后使用GeneClean試劑盒II通過相同的方法回收。lOOng限制性酶切的載體和lOOng限制性酶切的PCR產物互相混合，隨后向其中加入10x連接酶緩沖液(250mMTris-HClpH7.8，100mMMgCl2，20mMDTT和4mMATP)和連接酶的混合物，接著在4°C反應18小時。(3)感受態細胞的制備與轉化在LB培養基中培養18小時的大腸桿菌BL21細胞用LB培養基稀釋100倍。大腸桿菌BL21細胞被重新培養至在600nrn處的吸收值為0.3。置于冰上30分鐘后，除去上清液。0.1MCaCl2被加入至培養基體積的一半，隨后細菌被懸浮。懸浮的細菌被置于冰上1小時，并在2,000g(4,100rpm)離心10分鐘。沉淀物在培養基體積十分之一的0.1MCaCl2中懸浮用于轉化。(4)轉化上面制備的連接產物與感受態細胞混合并置于冰上，隨后在42'C熱休克1.5分鐘。向其中加入LB培養基，并在37'C培養1小時。該培養基被涂布在LB瓊脂平板上在37i:培養。(5)從轉化的大腸桿菌中分離質粒DNA轉化的大腸桿菌的單克隆被接種在含有卡那霉素的LB培養基中，并隨后在37。C震蕩培養。使用AccuPrep質粒提取試劑盒(AccuPrepPlasmidExtractionkit)進行質粒DNA的提取。培養基在室溫下以750g(2,500rpm)離心10分鐘以回收細胞沉淀物。重懸浮緩沖液被加入到細胞沉淀物，并隨后旋轉。向其中加入裂解緩沖液，接著在室溫下放置5分鐘。向其中加入中和緩沖液，在室溫下放置，然后以17,000xg(12,000rpm)離心。上清液被轉移到結合柱管，然后在室溫下以17，000xg(12,000rpm)離心，去除提取的溶液。向其中加入80%的乙醇，離心，然后僅將結合柱放置在新試管中。向其中加入洗脫緩沖液，室溫放置，然后離心以將上清液轉移到新微量管中。(6)蛋白表達和分離轉化的大腸桿菌BL21細胞在37'C培養18小時，隨后稀釋約100倍至OD600為0.5。向其中加入IPTG至濃度為0.3mM，并培養2小時。轉化的大腸桿菌BL21細胞在5,800g(7,000rpm)離心。沉淀物在lx結合緩沖液(5mM咪唑，20mMTris-HClpH7.9，0.5MNaCl)中懸浮，用超聲發生器在18Hz聲波處理15秒6次。聲波處理的溶液以23,000g(14，000rpm)離心。上清液被用作可溶部分，而沉淀物被用作不可溶部分。對每個部分進行SDS-PAGE以確定哪個部分含有重組蛋白。(7)蛋白純化用2mlHisbind樹脂(Novagen)填充柱，并隨后用蒸餾水、lx負載緩沖液和lx結合緩沖液制備。抗原蛋白穿過該柱以后，用lx清洗緩沖液清洗該柱。洗脫緩沖液(300mM咪唑，0.5MNaCl，20mMTris-ClpH7.9)穿過該柱以回收每個lml的蛋白溶液。用Lowry分析確定每部分中蛋白的濃度。進行SDS-PAGE和蛋白質印跡以確定蛋白(SEQIDNO:6)(圖l)。實施例2:使用ELISA對純化的抗原蛋白進行診斷分析進行本測試是為了確保通過與恙蟲病患者血清中的抗體的抗原-抗體反應來診斷恙蟲病的可能性，其使用了通過三種東方恙蟲原型的融合在大腸桿菌中表達的cr56蛋白，以及由兩種血清型Kangwon和Boryong分別表達的kr56蛋白和r21蛋白。在僅適用cr56蛋白的情況下，在ELISA中其靈敏性和特異性分別為93.2%和94.2%，這是不夠的。而且，測量值經常在診斷標準極限的吸光度(OD)附近觀察到。結果，r21和kr56蛋白被加入與cr56蛋白混合。通過使用三種蛋白的混合蛋白解決了問題。純化的蛋白抗原用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)按表3稀釋。96孔板用稀釋的抗原包被，隨后反應18小時。該板用含有0.05%Tween20的磷酸鹽緩沖液清洗2次，隨后向孔中加入lOOpl的3%牛血清白蛋白在37r封閉(block)2小時。對患者的血清進行2倍連續稀釋。100pl稀釋的血清被用作一抗。過氧化物酶結合的山羊抗人IgG以1:6,000稀釋被用作二抗。100^1制備的二抗被加入孔中。洗滌3次以后，100^1含有lmg/mlOPD(鄰苯二胺二氯化氫(o-phenylenediaminedihydrochloride))和0.03%過氧化氫的檸檬酸鹽磷酸鹽緩沖液(pH4.9)被加入到孔中。該培養板在室溫下避光放置30分鐘，隨后向其中加入50pl的1M硫酸終止反應。用MicroELISA讀數計測量其在490nm下的吸光度。結果顯示于表3。發現cr56和r21的混合抗原具有95°/。或更高的靈敏性和特異性。而且，在加入kr56蛋白的情況下，患者血清中的弱陽性信號變強,也就是說，發現其靈敏性增強(100%)。因此，可以看出kr56蛋白的加入產生增強診斷靈敏性的效果。[表3]使用ELISA對純化抗原蛋白進行抗原性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(1)每種抗原蛋白(cr56和r21)被稀釋到1.25嗎/ml。cr56蛋白與相同量的r21蛋白混合。lOOpl混合的抗原蛋白被加入到每個孔中。健康人OD=0.085±0.042(2)cr56、r21和kr56抗原蛋白分別被稀釋到1.25嗎/ml、0.25昭/ml和0.5嗎/ml。cr56蛋白與相同量的r21和kr56蛋白混合。健康人OD=0.078±0.038(3)cr56:1.25)ig/ml,r21:0.25ng/ml。健康人OD=0.081±0.044(4)kr56:0.6嗎/ml。健康人OD=0.075±0.035實施例3:使用點印跡法對純化的抗原蛋白進行診斷分析進行本測試是為了確保通過與恙蟲病患者血清中的抗體的抗原-抗體反應來診斷恙蟲病的可能性，其使用了通過三種東方恙蟲原型的融合在大腸桿菌中表達的cr56蛋白，以及由兩種血清型Kangwon和Boryong分別表達的kr56蛋白和r21蛋白。l)ag純化蛋白抗原(l嗎爾l)被逐滴加到硝酸纖維素膜上，然后在37'C干燥1小時。干燥的膜用含5%脫脂奶的TBST溶液(含0.5%Tween20的Tris緩沖鹽水)封閉(block)l小時。患者的血清以1:3,000稀釋作為一抗，并接著加到膜上。反應進行1小時。過氧化物酶結合的山羊抗人IgG被用作二抗。結果顯示于圖2和表4。結果，cr56、r21和kr56蛋白的混合抗原被發現具有最高的靈敏性和特異性。[表4]使用點印跡法對純化的抗原蛋白進行抗原性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>(1)每種抗原蛋白以(cr56:r21=l:l)混合，并以l嗎&l/點的濃度使用。(2)每種抗原蛋白以(cr56:r21=5:l)混合，并以liag/pl/點的濃度使用。(3)kangwon:0.6嗎(4)每種抗原蛋白以(cr56:r21:kr56=5:l:2)混合，并以lpg/nl/點的濃度使用。實施例4:去除純化抗原中由大腸桿菌衍生的蛋白與人血清中抗體間反應的研究使用組氨酸結合親和層析(His-bindaffinitychromatography)純化抗原。然而，由大腸桿菌衍生的蛋白不能被完全除去。也就是說，通過純化難以完全除去由大腸桿菌衍生的蛋白。因此，不表達恙蟲抗原蛋白的大腸桿菌宿主細胞被培養以提取。提取的宿主細胞的蛋白被噴到測試線前的預測試線上，從而除去與人抗體反應的由大腸桿菌衍生的蛋白。實施例5:診斷試劑盒的桿狀樣品的制備為了確定恙蟲抗原蛋白(cr56、kr56、r21)作為恙蟲病診斷試劑的效力，使用從NANOENGCO.購買的分液器(dispenser)制造診斷用測試條帶樣品。該測試條帶，如圖3所示，由硝酸纖維素膜、樣品墊、吸收墊和金結合墊(玻璃纖維)組成。使用的硝酸纖維素膜是從Millipore購買的。為了避免膜損傷，膜的一部分與透明塑料連接。三種蛋白被噴在硝酸纖維素膜上。三種蛋白之一是混合的蛋白——其中在大腸桿菌中表達的cr56、kr56和r21抗原蛋白以合適的量混合，以檢測患者血清中抗恙蟲的抗體，并用作測試線。三種蛋白中的另一種被用作對照線，以確定發生系統是否工作良好。三種蛋白中的其它一種是不表達恙蟲抗原蛋白的大腸桿菌提取物，并用作預測試線以去除與從大腸桿菌衍生的蛋白反應的人抗體。每種蛋白用分液器以合適的量噴在預測試線、測試線和對照線上，隨后在37'C干燥2小時。玻璃纖維在5%海藻糖溶液中用膠體金偶聯物吸收，隨后在真空干燥烘箱中干燥2小時。樣品墊和吸收墊被切成預定的尺寸。樣品墊在含有1%Tween20的250mMTris溶液中浸泡以吸收血清或血漿孔，接著在37'C完全干燥4小時。然后，噴涂有膠體金偶聯物的金結合墊(玻璃纖維)被置于硝酸纖維素膜下，并且將樣品墊置于其下方。吸收墊置于硝酸纖維素膜的上方。最終的診斷桿(diagnosticstick)被切成4mm寬和60mm高。根據它們的用途制備兩種診斷試劑盒樣品。這里用的蛋白顯示于表5。樣品1和2僅能夠檢測到人血清中抗恙蟲抗原蛋白的IgG，而樣品3和4僅能夠檢測到IgM。因此，關于其用途，樣品1和2可以是檢測中晚期患者的診斷工具，而樣品3和4可以用作檢測早期患者的診斷工具。在本發明中，兩個條帶被置于一片塑料中，以便同時診斷。使用患者和健康人的血清對診斷試劑盒的樣品進行效力測試。結果，診斷試劑盒的樣品被發現對恙蟲病是快速、準確且簡便的診斷試劑盒。而且，從使用患其它急性發熱疾病(腎綜合癥出血熱、鼠型斑疹傷寒、細螺旋體病)患者的血清的檢測結果中沒有發現產生交叉反應性。因此，本發明中的診斷試劑盒被發現具有比傳統試劑盒更高的靈敏性。[表5]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>實施例6:診斷試劑盒條帶樣品的效果測試為了確定制造的診斷試劑盒的條帶樣品的效力，用65個人的血清進行測試，其中包括患恙蟲病的患者、健康人和患其它急性發熱疾病的患者。工作手冊如下。患者或健康人的血清用合適的溶液稀釋。400^1稀釋的血清被逐滴加到底部小孔，放置10分鐘。觀察測試線上(標記T的位置)和對照線上(標記C的位置)是否產生紅紫色。在兩條線都產生紅紫色的情況下，結果為陽性。在僅對照線上產生紅紫色的情況下，結果為陰性。結果在圖5中示出。發現由IFA診斷患有恙蟲病的30位患者的病例的測試結果均為陽性。因此，其靈敏性為100%。而且，30位患者中的11位(37%)的血清中觀察到了對IgM的強陽性反應，并在30位患者中的4位患者(13%)的血清中觀察到了對IgM的弱陽性反應。因此，可見診斷試劑盒的樣品對檢測早期病人明顯有效。用健康人的血清(n-lO)、鼠型斑疹傷寒患者的血清(n-ll)、細螺旋體病患者的血清(n=7)和腎綜合癥出血熱患者的血清(n=8)進行特異性測試。結果，在一位細螺旋體病患者的血清樣品中觀察到了對IgG的陽性反應，而在剩余血清樣品中未觀察到對IgG的陽性反應。特異性測試的樣品數量不足，因此無法斷言特異性測試是否準確。對IgG的特異性為97.2%。而且，從與IgM的交叉反應測試的結果可見，對IgM的特異性為100%(k特異)。工業應用在本發明的恙蟲病診斷試劑盒中，使用具有東方恙蟲Gilliam、Karp和Kato、Kangwon和Boryong菌株抗原性的蛋白，通過免疫色譜法進行診斷。因此，與傳統的免疫熒光抗體技術等相比，診斷結果可以用肉眼簡單、準確且快速地觀察。權利要求1.恙蟲病的診斷試劑盒，包括測試條帶，以檢測生物樣品中抗恙蟲抗原的抗體，其中所述測試條帶包括(a)吸收所述樣品的樣品墊；(b)與所述樣品中人類抗體結合的金結合墊；(c)測試膜，包括含有恙蟲混合抗原的測試線和含有對照蛋白的對照線；及(d)吸收剩余樣品的吸收墊。2.根據權利要求1所述的診斷試劑盒，進一步包括預測試線，其被置于所述測試膜上的所述測試線之前，其中大腸桿菌提取物不含恙蟲抗原蛋白。3.根據權利要求2所述的診斷試劑盒，其中所述預測試線、所述測試線與所述對照線按這樣的順序排列。4.根據權利要求2所述的診斷試劑盒，其中0.5mg/ml到0.6mg/ml的所述大腸桿菌提取物被吸收在所述預測試線中。5.根據權利要求1或2所述的診斷試劑盒，其中存在lmg/ml的所述恙蟲混合抗原和0.1mg/ml到lmg/ml的所述對照蛋白。6.根據權利要求1或2所述的診斷試劑盒，其中所述恙蟲混合抗原包含東方恙蟲(On'e""ato/"wgawtwW)Gilliam、Karp和Kato菌株的56kDa融合蛋白，東方恙蟲Kangwon菌株的56kDa蛋白，和東方恙蟲Boryong菌株的21kDa蛋白。7.根據權利要求6所述的診斷試劑盒，其中所述東方恙蟲Gilliam、Kaip和Kato菌株的56kDa融合蛋白，所述東方恙蟲Kangwon菌株的56kDa蛋白，和所述東方恙蟲Boryong菌株的21kDa蛋白分別以lmg/ml的濃度制備，并且以5:2:1的體積比混合，以制備lmg/ml的恙蟲混合抗原。8.根據權利要求l或2所述的診斷試劑盒，其中所述對照蛋白是兔抗山羊IgG多克隆抗體和/或山羊抗人IgM多克隆抗體。9.根據權利要求1或2所述的診斷試劑盒，其中所述金結合墊包括至少一種選自金標記的蛋白A、金標記的抗人IgG抗體和金標記的抗人IgM抗體的標記物。10.根據權利要求l或2所述的診斷試劑盒，其中所述人類抗體是IgG或IgM。11.根據權利要求1或2所述的診斷試劑盒，其中所述膜的所述預測試線、所述測試線和所述對照線以2.5到3.0mm的間隔排列。12.恙蟲病的診斷試劑盒，包含在一個塑料裝置中連接的兩條權利要求1所述的測試條帶，其中它們中的一條包含檢測抗所述恙蟲抗原蛋白的人IgG抗體的第一條帶，另一條包含檢測抗所述恙蟲抗原蛋白的人IgM抗體的第二條帶，所述第一條帶包括含有山羊抗人IgG抗體或蛋白A的金結合墊和含有兔抗山羊IgG多克隆抗體的對照線，并且所述第二條帶包括含有山羊抗人IgM抗體的金結合墊和含有山羊抗人IgM多克隆抗體的對照線。13.根據權利要求12所述的診斷試劑盒，其中所述第一條帶和第二條帶順序或平行連接。14.恙蟲病的診斷組合物，包括作為恙蟲混合抗原的東方恙蟲Gilliam、Karp和Kato菌株的56kDa融合蛋白，東方恙蟲Kangwon菌株的56kDa蛋白，和東方恙蟲Boryong菌株的21kDa蛋白。全文摘要本發明涉及使用恙蟲混合抗原的恙蟲病診斷試劑盒。更具體地，所述恙蟲病診斷試劑盒包括測試條帶，其包含吸收樣品的樣品墊；與樣品中人類抗體結合的金結合墊；測試膜，其包括含有恙蟲混合抗原的測試線和含有對照蛋白的對照線；吸收剩余樣品的吸收墊。在本發明的診斷試劑盒中，抗恙蟲的抗體能夠在不使用任何儀器的情況下被簡便地檢測，由此通過肉眼可以確定東方恙蟲(Orientiatsutsugamushi)的感染。文檔編號G01N33/53GK101379398SQ200780004789公開日2009年3月4日申請日期2007年3月30日優先權日2006年9月4日發明者全珠美,卞容煥,張仁愛,禹秀東,趙敏基,金佑昶,金允源,金泳辰,金翼祥申請人:株式會社疫免美德