H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體或其結合活性片段及其用途的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：5830092閱讀：1514來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體或其結合活性片段及其用途的制作方法
            
相關申請本發明申請要求源自2006年1月26日遞交的中國發明申請200610002312.1的優先權，該申請的全部內容包含于本發明申請之中。
            
發明領域   
            
本發明涉及可特異性結合H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之單克隆抗體，及其保守性變異體或活性片段，或其多肽或多肽類似物的相關編碼序列，或產生所述單克隆抗體的細胞株，及應用該抗體或片段用于診斷與治療的方法。
            
 
            
背景技術：
              
            
自H5型禽流感于1996年首先在我國廣東省農場的鵝群暴發以來(Xu，X.et al.，1999，Virology)，由此病毒演生出來的另一株H5病毒在香港的禽鳥農場(1997年4月)及市場(1997年11月)暴發，引起了歷史上禽流感病毒第一次直接由禽傳人事件，前后共18例確診病例中有6人死亡。2003年以來，H5病毒株在整個東亞及東南亞國家的相繼暴發，WHO及流感專家預測H5禽流感病毒將最有可能成為下一次人類大流感暴發的流行株。2004年初，H5型高致病性禽流感也先后在我國十幾個省暴發，并在中國香港、泰國、荷蘭等發現H5型禽流感傳染雞、鴨、蒼鷺、虎、貓等多種動物的事件。更令人擔憂的是，在泰國已經出現疑似人傳染人事件，馬來西亞也有多例報道。進入2005年，羅馬尼亞、俄羅斯、土耳其等歐洲國家相繼發現禽類感染H5型禽流感病毒致死事件，專家認為此乃帶毒候鳥遷移的結果，這使得控制高致病性H5型禽流感病毒的進一步擴散傳播變得更為困難。專家預測，隨著侯鳥的傳播，H5型禽流感病毒有可能通過歐亞、亞非大陸橋進一步傳播到衛生條件極差的非洲國家，使得H5型禽流感病毒獲得和其它人流感病毒充分重組的機會和時間，屆時將很可能形成一種對人類高度致命的全新流感病毒，其給人類帶來的各種損失將難以估計。根據WHO統計結果，截止2006年1月19日，全球因感染H5N1病毒死亡的人類個案已達80例，給全球公共衛生安全帶來極大的考驗。
            
 
            
最新研究結果(Li，K.S.et al.，2004，Nature)表明，華南水禽(家鴨)為H5型禽流感病毒的主要攜帶者及傳播者，H5型禽流感的爆發有明顯的季節性，并伴隨著生物多態型(多種基因型)的演變。然而，分子流行病學研究表明，目前鴨群種大約有30％的陽性感染并無任何癥狀，雞群中也有達10％的流行且無癥狀帶毒。這些受感染的動物又能夠不斷使人受到新的感染，對人類的健康構成巨大的威脅。有關專家一致認為要控制好H5型高致病性禽流感病毒在整個東亞、東南亞以及歐洲各國的流行，早期診斷是先決條件，然后才能做到早隔離、早處理，對人做到早治療。
            
 
            
采用傳統的病毒分離及血清診斷方法診斷禽流感病毒需時4—5天，且目前大部分人及動物疾控系統實驗室缺乏三級生物安全實驗室，故東南亞各國及地區對H5暴發的診斷明顯滯后。常見的情況是大量雞只死亡和撲殺行動完成后仍未有實驗室的確診報告，給控制病毒的暴發帶來很大不便。另外，因少數禽類(特別是水禽，如家鴨)存在著無癥狀帶毒情況，檢疫系統又無有效的檢測手段，這種情況的持續發展，引起了該病毒在多個國家地區反復暴發，遷延不斷的局面。
            
 
            
同時，由于H5型禽流感病毒(其中Goose/Guangdong/1/96為代表株)屬高致病性病毒，對目前常用的動物模型均有致死性，而采用基因工程方法表達的血凝素蛋白(HA)又不能完整取得抗原性，世界上多個著名實驗室先后嘗試制備針對該病毒系的單克隆抗體均未獲成功。目前對該病毒抗原性分析不得不采用特異性及反應性均明顯達不到診斷試劑要求的由A/chicken/Pennsylvania/1370/83(H5N2)和A/chicken/Pennsylvania/8125/83(H5N2)制備的單克隆抗體。
            
 
            
鑒于上述情形，目前迫切期望能有一種方便、快捷、實時的診斷方法和手段，從而及時把第一代跨種族傳染的病人隔離治療，防止病毒向人傳人發展，在病毒未適應人類之前就打斷其傳播鏈，從而從根本上消除該病毒對人類的大流感威脅。
            
 
            
中國國內，有關抗禽流感病毒H5亞型檢測研究已有文獻報道。揚州大學畜牧獸醫學院秦愛建等(秦愛建，邵紅霞，錢琨等，中國預防獸醫學報，2003，03期)研制了抗禽流感病毒H5和H9亞型血凝素特異性單克隆抗體，應用這些單克隆抗體進行間接免疫熒光試驗被證明能在24小時內迅速檢測出相應的禽流感病毒。北京出入境檢驗檢疫局利用熒光RT-PCR快速檢測高致病力禽流感病毒H5亞型，檢測時間縮短為4小時，于2005年12月10日通過臨床驗證。郭元吉在“人禽流感研究現狀”一文中綜述了H5亞型毒株抗體檢測需用微量中和實驗或特異性高的ELISA(郭元吉，中華實驗和臨床病毒學雜志，2004，03期)，但有關利用ELISA檢測H5亞型的研究性文獻卻未見相關報道。
            
 
            
國外有關利用ELISA檢測H5N1抗體的研究已有報道。Rowe等報道了應用重組血凝素蛋白作為抗原包被，利用間接ELISA檢測H5N1抗體，其ELISA的靈敏度為80％，特異度為62％(Rowe T.et al.，J.Clin.Microbiol.，April 1999；37(4)937-43)，但該文獻并非針對H5N1亞型血凝素HA基因特異的單克隆抗體。Zhou等(Zhou，E.M.et al.，AvianDis.，1998，42(4):757-61)、Shafer等(Shafer，A.L.et al.，Avian Dis.，1998，42(1):28-34)采用競爭ELISA法檢測禽流感病毒抗核心蛋白抗體，但檢測對象均為A型禽流感所有H1-H16亞型的NP蛋白抗體，不能確定亞型。Lu報道了基于單克隆抗體的Dot-ELISA檢測禽流感病毒(AV)，該方法直接檢測AIV抗原，其特異性在于不會與其它禽類病毒發生交叉反應(Lu H.，Avian Dis.，2003，47(2)361-9)。雖然Sala等建立了基于H7亞型表面糖蛋白特異的單克隆抗體的ELISA，但其亞型為H7；單克隆抗體為表面糖蛋白特異的單克隆抗體，并非H5亞型血凝素HA基因特異的單克隆抗體(Sala G，Cordioli P，Moreno-Martin et al.Avian Dis.2003，47(3 Suppl):1057-9)。
            
 
            
遺憾的是，現有禽流感病毒免疫學診斷手段使用的單克隆抗體大部分針對的是核蛋白(NP蛋白)，因而其檢測的是A型(也稱甲型)流感病毒，但實際上A型流感病毒包括H1～H16共16個亞型，其中相當大的亞型均無致病性或有低致病性，只有H5亞型禽流感病毒為危害最大的高致病性禽流感病毒。因而現有技術遠不能滿足臨床檢測的需要。
            
 
            
本發明的根本目的在于克服現有禽流感病毒免疫檢測技術的缺陷，所采用的單克隆抗體針對的為H5亞型的HA蛋白，因而能夠特異的檢測具有高致病性的H5亞型禽流感病毒。
            
 
            

            發明內容
            
   
            
本發明提供了可特異性結合H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之單克隆抗體，及可阻斷至少50％的單克隆抗體與H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白結合活性之單克隆抗體.本發明也提供了相關的雜交瘤細胞株，分離的核酸分子和短肽，以及其含該單克隆抗體的藥物組合物和醫藥診斷設備和試劑盒。本發明也提供了利用該單克隆抗體探測，診斷，預防，和治療禽流感病毒，特別是H5亞型禽流感病毒的方法.   
            

            

            
   
            
圖1為金標法H5亞型流感病毒HA抗原檢測試劑盒的測定結果，其中＂a＂出現兩條紅色線，認定為陽性；＂b＂只出現質控線，認定為陰性；＂c＂不出現紅色線，則認定為無效。
            
 
            
圖2為金標法H5亞型流感病毒anti-HA抗體檢測試劑盒的測定結果，其中＂a＂只出現質控線，認定為陽性；＂b＂出現兩條紅色線，認定為陰性；＂c＂不出現紅色線，則認定為無效。
            
 
            
圖3為H5亞型流感病毒HA抗原檢測試劑盒的測定結果，其中，“+”表示出現橢圓形顯色區域，認定為陽性；“-”表示未出現橢圓形顯色區域，認定為陰性。
            
 
            
圖4為6種嵌合抗體的表達質粒圖pcDNA3.1-Ak8H5、pcDNA3.1-AH8H5、pcDNA3.1-Ak10F7、pcDNA3.1-AH10F7、pcDNA3.1-Ak4D1和pcDNA3.1-AH4D1。
            
 
            
圖5為三種嵌合抗體對Ck/HK/Yu22/02毒株的血凝抑制實驗，其中，第1、2、3列PBS對照物；第4和5列10F7 cAb；第6列10F7 mAb；第7和8列4D1 cAb；第9列4D1 mAb；第10和11列8H5 cAb；第12列8H5 mAb。
            
 
            
圖6為嵌合抗體與表達H5血凝素的細胞反應的免疫熒光檢測實驗結果，其中，A為cAb 4D1(DAPI)；B為cAb 4D1(FITC)；C為cAb 10F7(DAPI)；D為cAb 10F7(FITC)；E為抗-HBV cAb(DAPI)；F為抗-HBV cAb(FITC)。
            
 
            
圖7為噬菌體多肽的ELISA檢測值OD(450/620)的矩形圖。
            
 
            
圖8為pTO-T7與pTO-T7-239-123的質粒示意圖。
            
 
            
圖9為pTO-T7與pTO-T7-239-125的質粒示意圖。
            
 
            
圖10為融合蛋白(或重組蛋白)239-123純化樣品的SDS-PAGE電泳圖，其中，1分子重量標簽；2表達239-123的E.coli全部溶胞產物；3239-123之超聲溶胞產物的上清；4緩沖液I中的239-123；52M尿素中的239-123純化融合蛋白；64M尿素中的239-123的純化融合蛋白；78M尿素中的239-123的純化融合蛋白。
            
 
            
圖11為融合蛋白239-125純化樣品的SDS-PAGE電泳圖，其中，1分子重量標簽；2表達239-125的E.coli全部溶胞產物；3全部溶胞產物之離心分離上清；4緩沖液I中的239-125；52M尿素中的239-125的純化融合蛋白；64M尿素中的239-125的純化融合蛋白；78M尿素中的239-125的純化融合蛋白。
            
 
            
圖12顯示了239-123融合蛋白的結合特性其ELISA檢測值OD(450/620)的色彩強度矩形圖，其中，239-123融合蛋白結合到水平軸所標識的各種毒株上。
            
 
            
圖13顯示了239-125融合蛋白的結合特性其ELISA檢測值OD(450/620)的色彩強度矩形圖，其中，239-125融合蛋白結合到水平軸所標識的各種毒株上。
            
 
            
圖14為在各種mAb稀釋下，239-123融合蛋白結合到8H5mAb(三角形點線)或8C11mAb(方點線)的ELISA檢測值OD(450/620)的色彩強度。
            
 
            
圖15為pC149-mut與pC149-mut-123的質粒圖。
            
 
            
圖16為pC149-mut與pC149-mut-125的質粒圖。
            
 
            
圖17為小量表達的重組蛋白的全胞溶胞產物的SDS-PAGE電泳圖，其中，1D123；2T123；3F123；4Q123；5D125；6T125；7F125；8Q125。
            
 
            
圖18為純化重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中，1D123；2T123；3F123；4Q123；5D125；6T125；7F125；8Q125。
            
 
            
圖19為類病毒顆粒的電鏡圖，該類病毒顆粒是由HBV cAg片段的融合蛋白和結合抗體的多肽組裝而成的。
            
 
            
圖20為顯示融合蛋白HBc-123/125與單抗8H5之間結合親和力的ELISA檢測值OD(450/620)的色彩強度矩形圖。
            
 
            
圖21為顯示融合蛋白HBc-Q123或HBc-D125與各種單抗之間結合親和力的ELISA檢測值OD(450/620)的色彩強度矩形圖；結果表明，融合蛋白HBc-Q123和HBc-D125 T特異性地結合單抗8H5。
            
 
            
圖22顯示了ELISA檢測HBc-123融合蛋白免疫鼠血清抗體滴度上升曲線，其中，時間為0-4周，抗體滴度通過ELISA檢測。
            
 
            
圖23顯示了ELISA檢測HBc-125融合蛋白免疫鼠血清抗體滴度上升曲線，其中，時間為0-4周，抗體滴度通過ELISA檢測。
            
 
            
圖24顯示了免疫熒光檢測免疫鼠血清與SF21細胞中表達的HA蛋白的反應。
            
 
            
圖25為HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129重組蛋白組裝的類病毒顆粒的電鏡圖。
            
 
            
圖26為顯示融合蛋白HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129與各種單抗之間的結合親和力的ELISA檢測值OD(450/620)的色彩強度矩形圖；結果表明，融合蛋白HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129特異性地結合到單抗8H5。
            
 
            
圖27顯示了由12肽融合蛋白組裝的的類病毒顆粒與H5N1病毒競爭結合8H5酶標抗體的結果，其中，縱軸是色彩強度(以OD(450/620)值表示)，水平軸是實驗中所用的各種類病毒顆粒和PBS對照物。
            
 
            
具體實施例方式 
            
本發明申請中涉及的有關術語的定義如下   
            
本發明中的“血凝素”一詞指禽流感病毒的包膜糖蛋白。血凝素蛋白介導流感病毒針對宿主細胞的吸附和進入。禽流感病毒的血凝素蛋白有16個血清學亞型，HA1—HA16，分別對應于16個病毒亞型，即H1—H16。
            
 
            
本發明中的“抗體”一詞指任意一種免疫球蛋白，包括能結合特異性抗原的單抗、多抗、雙特異性或多特異性抗體。一個完整的抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈含有一個可變區和第一、第二、第三等三個恒定區；每條輕鏈包含一個可變區和一個恒定區。抗體呈“Y”型，“Y”型結構的頸部含有兩條重鏈的第二和第三恒定區，其通過二硫鍵結合形成。“Y”型結構的每條臂含有其中一條重鏈的第一恒定區和可變區，和一條輕鏈的可變區和恒定區。輕鏈和重鏈的可變區決定抗原的結合；每條鏈的可變區均含有三個高變區，稱互補決定區(CDR)(輕鏈(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重鏈(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3(其由Kabat等人命名，見Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition(1991)，第1-3卷，NIH Publication 91-3242，Bethesda Md)。其中，三個CDR由構架區(FR)間隔開。構架區比CDR區更保守并形成一個架子狀結構支撐超變區。重鏈和輕鏈的恒定區與抗原結合無關，但具有多種效應功能。抗體依據重鏈恒定區的氨基酸序列可以分成幾類，主要是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些類還進一步分成亞類，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2等。
            
 
            
本發明中的“抗體”一詞，除特指完整的免疫球蛋白外，也指免疫球蛋白的片段(如至少是免疫球蛋白分子的一個免疫活性區段)，如Fab、Fab＇、F(ab＇)2、Fv片段、單鏈抗體分子或由含有一個或多個CDR區的免疫球蛋白分子的任意片段形成的多特異性抗體。另外，本發明涉及的抗體也可以是由一個特定的人免疫球蛋白中的一個或多個CDR區結合一個或多個不同的人免疫球蛋白的構架區形成的抗體。
            
 
            
抗體相關的“Fab”片段是指含有一條輕鏈的可變區和恒定區和一條重鏈的可變區和恒定區經二硫鍵結合起來的抗體分子的一部分。
            
 
            
“Fab"片段是指包含了部分鉸鏈區的Fab片段。
            
 
            
F(ab＇)2指的是Fab’的二聚體。
            
 
            
抗體的“Fc”指的是第一重鏈的第二、第三恒定區與第二重鏈的第二、第三恒定區經二硫鍵結合成的抗體的一部分。抗體的Fc段有多種不同的功能，但不參與抗原的結合。
            
 
            
抗體的“Fv”段指的是能結合完整的抗原結合位點的抗體的最小片段。一個Fv片段包括一條輕鏈的可變區結合到一條重鏈的可變區。
            
 
            
本發明中的“單鏈Fv抗體”或“scFv”指的是由輕鏈可變區與重鏈可變區直接相連或通過一個肽鏈連接而成的工程抗體(Houston 1988)。
            
 
            
本發明中的“單鏈抗體Fv-Fc”或“scFv-Fc”也包括scFv連接抗體的Fc段形成的工程抗體。
            
 
            
本發明中的“抗原決定簇”(或稱表位)指的是抗原分子中與抗體結合的那部分氨基酸或原子基團。
            
 
            
發明中的“單抗”或者“MAb”或者“mAb”指的是來自一群高度同源的抗體分子中的一個抗體或抗體的一個片斷，也即除僅在少數情況下可能出現的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對抗原上的單一表位具有高特異性。單抗與多抗不同，多抗是包含了識別抗原上的不同表位的抗體分子。雖然傳統的單抗是由雜交瘤細胞分泌的，但本發明涉及的單抗并不僅限于此制備方法。如，本發明涉及的單抗可采用Kohler等首次報道的雜交瘤技術獲得(Nature，256:495，1975)，也可采用重組DNA技術獲得(如參見U.S.P4,816,567)。
            
 
            
本發明中的“嵌合抗體”一詞指的是抗體輕鏈或/和重鏈的一部分是源自某一特定物種或屬某一特定抗體類或亞類的序列相同或同源的抗體，而抗體輕鏈或/和重鏈的另一部分是源自另一物種或屬于另一抗體類或亞類的序列相同或同源的抗體。不管怎樣，這種抗體片段仍保留了對目標抗原的結合活性(U.S.P 4,816,567 to Cabilly et al.；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851 6855(1984))。
            
 
            
本申請中，“人源化抗體”一詞指的是人源免疫球蛋白(受體抗體)的全部或部分CDR區被一非人源抗體(供體抗體)的CDR區替換后得到抗體或抗體片段，其中的供體抗體可以是有預期特異性、親和性和反應性的小鼠、大鼠或兔抗體。另外，人源免疫球蛋白的構架區(FR)的氨基酸序列也可被相應的非人源抗體的氨基酸序列所替換。而且，人源化抗體的氨基酸殘基也可以既非來源于受體抗體，也非來源于供體抗體的CDR區或構架區序列。這些人工修飾的目的是進一步完善或優化抗體性能。總之，人源化抗體是指含有至少一個、通常是兩個幾乎完整的可變區，其中對應的所有或幾乎所有的CDR區是來自非人源抗體，其中的全部或幾乎全部的FR區是來自人源抗體。理想的人源化抗體至少含有免疫球蛋白的Fc區的一部分，通常是人源免疫球蛋白的Fc區。更多詳細內容請參閱Joneset al.，Nature，321:522 525(1986)；Reichmann et al.，Nature，332:323 329(1988)；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2:593 596(1992)；and Clark，Immunol.Today 21397 402(2000)。
            
 
            
本申請涉及的“被分離”一詞，指的是天然狀態下經人工手段獲得的。如果自然界中出現某一種“被分離”的物質或成分，那么可能是其所處的天然環境發生了改變或從天然環境下離分出該物質，或二者情況均有發生。比如，某一活體動物體內天然存在的某種未被分離的多聚核苷酸或多肽，而從這種天然狀態下分離出來的高純度的相同的多聚核苷酸或多肽即稱之為被分離。這里的“被分離”不排除混有人工或合成的物質，也不排除存在不影響物質活性的其它不純物質。
            
 
            
本發明中“載體”一詞指的是，可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可通過轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。舉例來說，載體包括質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有復制起始位點。載體還有可能包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。
            
 
            
本發明中“宿主細胞”一詞指的是導入載體的細胞，包括如下許多細胞類型，如大腸桿菌或枯草菌等原核細胞，如酵母細胞或曲霉菌等真菌細胞，如S2果蠅細胞或Sf9等昆蟲細胞，或者動物細胞如纖維原細胞，CHO細胞，COS細胞，NSO細胞，HeLa細胞，BHK細胞，HEK 293細胞，或人細胞。
            
 
            
“中和抗體”一詞指的是能清除或顯著降低目標病毒抗原結合毒力的抗體或抗體片段。
            
 
            
“序列相同百分比”一詞指的是候選序列中的核酸或氨基酸分別與對應的核酸或多肽序列中核酸或氨基酸相同性的百分比。這里涉及到的與核酸序列或者多肽序列有關的術語“序列相似百分比”定義為候選核酸序列或氨基酸殘基序列分別與目的核酸序列或氨基酸序列的相似百分比。對于某一個序列，將它和目的序列進行比對，必要時可跳過突變缺口，以達到最大的基因相似百分比，而不去考慮相似序列的任意保守性突變。本領域的多種比對方法可用于確定核酸或氨基酸序列的相似性，如可用的計算機軟件包括BLAST，BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)等。熟悉本領域技術的工作人員懂得給比對設定合適的測量參數，包括為使用最大可比性的一些運算法則達到而全長序列的比較。
            
 
            
“特異性結合”一詞指的是，指兩分子間的非隨機結合反應，如抗體和產生該抗體的抗原間的反應。此處，結合第一種抗原的抗體對第二種抗原的結合親和力是檢測不到或很弱。在某些實施方式中，一個某抗原特異性抗體是指以親和力(KD)≤10-5M(如10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M等)結合該抗原，其中KD指解離率與結合率的比值(koff/kon)，其可以采用本領域技術人員熟悉的方法進行測定。
            
 
            
抗體   
            
本發明所述單抗能夠特異性結合H5亞型禽流感病毒。本發明的一個方面涉及能特異性結合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單抗及其相應的抗原結合片段。
            
 
            
本發明所述抗H5單抗是由小鼠雜交瘤細胞株8H5，3C8，10F7，4D1，3G4和2F2所分泌的。這些單抗的名稱以其相應的雜交瘤細胞株進行命名。也就是，這些抗H5單抗分別由雜交瘤細胞株8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2產生，并分別命名為8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2。單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2能特異性結合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白。小鼠雜交瘤細胞株8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2已在2006年1月17日于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，Wuhan University，Wuhan，China)進行保藏，保藏號是CCTCC—C200607(雜交瘤細胞株8H5)，CCTCC-C200605(雜交瘤細胞株3C8)、CCTCC-C200608(雜交瘤細胞株10F7)、CCTCC-C200606(雜交瘤細胞株4D1)、CCTCC-C200604(雜交瘤細胞株3G4)和CCTCC-C200424(雜交瘤細胞株2F2)。
            
 
            
本發明涉及單抗還包括能阻斷單抗8H5，3C8，10F7，4D1，3G4或2F2結合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單抗。這些單抗結合的血凝素上的表位可以與單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2所識別的表位相同。這些單抗所識別的表位也可以和單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2所識別的表位在空間上有重疊。這樣的單抗可以降低單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4或2F2與H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的結合力至少50％，或至少60％，或優選至少70％，或更優選至少75％，或更優選至少80％，或更優選至少85％，或更優選至少90％，或更優選95％，或最優選99％。
            
 
            
可以采用常規方法如A ntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中描述的方法，測定某一未知單抗降低某一已知單抗結合H5血凝素蛋白的能力。例如，先把抗原預包被在微孔板上，然后把系列稀釋的未標記的待測抗體和特定濃度的標記后的已知單抗共同加入上述預包被后的微孔板中孵育，洗滌后測定不同稀釋度的待測抗體下已知抗體結合到板上的數量。待測抗體競爭已知抗體結合抗原的能力越強，已知抗體結合抗原的能力就越弱。通常，抗原是預包被在96孔微孔板上，并利用放射標記法或酶標記法測定未標記單抗阻斷已標記單抗的能力。
            
 
            
可以采用Kohler等在Nature 256495(1975)中報道的雜交瘤制備方法來制備單抗。首先將免疫原(必要時候添加佐劑)免疫注射小鼠或其它合適的宿主動物。免疫原或佐劑的注射方式通常為皮下多點注射或腹腔注射。免疫原預先藕聯到某些已知蛋白，如血清白蛋白或大豆姨酶抑制劑上，可能會有助于增強抗原在宿主內的免疫原性。佐劑可以利用福氏佐劑或MPL-TDM等。動物受免疫后，體內會有分泌特異性結合免疫原的抗體的淋巴細胞產生。另外，淋巴細胞也可以利用體外免疫獲得。收集目的淋巴細胞與骨髓瘤細胞并用合適的融合劑，如PEG，進行融合以獲得雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)。
            
 
            
上述制備的雜交瘤細胞可以接種到合適的培養液中生長，培養液中最好含有一種或多種能夠抑制未融合的、母體骨髓瘤細胞生長的物質。例如，對缺乏次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸轉移酶(HGPRT or HPRT)的母體骨髓瘤細胞，在培養液中添加次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶(HAT培養基)等物質將可以抑制HGPRT-缺陷細胞的生長。
            
 
            
優選的骨髓瘤細胞應該具有融合率高，抗體分泌能力穩定，對HAT培養液敏感等能力。其中，骨髓瘤細胞首選鼠源骨髓瘤，如MOP-21 and MC-11小鼠腫瘤衍生株(THE SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，Calif.USA)，和SP-2或X63-Ag8-653細胞株(American Type Culture Collection，Rockville，Md.USA)。另外也有研究報道利用人骨髓瘤和人鼠異源骨髓瘤細胞株制備人單抗(Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)。
            
 
            
雜交瘤細胞生長的培養液用于檢測針對特異抗原的單抗的產生。測定雜交瘤細胞產生的單抗的結合特異性有免疫沉淀或體外結合試驗，如放射免疫試驗(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。例如，利用Munson等在Anal.Biochem.107220(1980)描述的Scatchard分析法可用來測定單抗的親和力。
            
 
            
當雜交瘤產生的抗體的特異性、親和力和反應性確定之后，目的細胞株可以通過(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103，Academic Press，1996)所描述的標準的有限稀釋法進行亞克隆化。合適的培養液可以是DMEM或RPMI-1640等。另外，雜交瘤細胞還可以腹水瘤的形式在動物體內生長。
            
 
            
利用傳統的免疫球蛋白純化方法，如蛋白A瓊脂糖凝膠、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析等，可以將亞克隆細胞分泌的單抗從細胞培養液、腹水或血清中分離出來。
            
 
            
本發明所述單抗還可以是通過基因工程重組技術獲得。利用特異性結合單抗重鏈和輕鏈基因的核酸引物進行PCR擴增，可以從雜交瘤細胞中分離得到編碼單抗重鏈和輕鏈基因的DNA分子。所得DNA分子插入表達載體內，然后轉染宿主細胞，如E.coli細胞、猿猴COS、CHO細胞、或其它不產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞。轉染后的宿主細胞在特定條件下培養并表達目標抗體。
            
 
            
本發明的抗體對H5血凝素蛋白結合具有高特異性和高親和力。這些抗體對其它亞型的血凝素蛋白可能會有弱的交叉反應性，優選地，這些抗體對其它亞型的血凝素蛋白完全沒有交叉反應性。一方面，本發明的抗體結合H5血凝素的KD值小于1×10-5M；優選地，KD值小于1×10-6M；更優選地，KD值小于1×10-7M，最優選地，KD值小于1×10-8M。
            
 
            
本發明的單抗可以是包含兩條重鏈和兩條輕鏈的傳統的“Y”型結構狀的抗體。另外，所述抗體也可以是保持了對血凝素蛋白親和力的傳統的“Y”型結構狀的抗體上的Fab片段、Fab＇、F(ab)2、Fv、或其它類型的部分片段，其結合血凝素蛋白的親和力可以高于或低于傳統的“Y”型結構狀的抗體。
            
 
            
本發明的抗體片段可以利用水解完整的抗體分子獲得(參見Morimoto et al.，J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-117(1992)and Brennan et al.，Science 229:81(1985))。另外，這些抗體片段也可以直接由重組宿主細胞產生(reviewed in Hudson，Curr.Opin.Immunol.11548-557(1999)；Little et al.，Immunol.Today，21364-370(2000))。比如，Fab＇片段可以直接從E.coli細胞中獲得或化學藕聯形成F(ab＇)2片段(Carter et al.，Bio/Technology，10:163-167(1992))。再如，F(ab＇)2片段可以用亮氨酸拉鏈GCN4連接獲得。另外，Fv、Fab或F(ab＇)2片段也可以直接從重組宿主細胞培養液中直接分離得到。本領域的普通技術人員完全知曉制備抗體片段的其它技術。
            
 
            
抗體核酸序列   
            
本發明涉及特異性結合H5血凝素蛋白的抗體或抗體片段的編碼核酸分子。編碼抗體的核酸分子可以從雜交瘤細胞中分離得到。本領域的普通技術人員完全知曉利用常規技術可以測定這些分子的核酸序列。本發明涉及的抗體核酸分子也可以利用傳統的基因工程重組技術或化學合成方法獲得。一方面，本發明涉及的抗體核酸分子的序列包含了抗H5抗體的重鏈可變區或抗體分子的部分核酸序列。另一方面，本發明涉及的抗體核酸分子的序列也包括抗H5抗體的輕鏈可變區或抗體分子的部分核酸序列。另一方面，本發明涉及的抗體核酸分子的序列還包括重鏈或輕鏈可變區的CDR序列。
            
 
            
本發明的一方面涉及編碼單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重鏈和輕鏈可變區序列的核酸分子。單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重鏈可變區序列(VH，Vh)的核酸分子分別對應于SEQ ID NO1、SEQ ID NO5、SEQ ID NO9、SEQ ID NO16、SEQ ID NO20和SEQ ID NO24。單抗8H5、3C8、10F7、4D1和2F2輕鏈可變區序列(VK，Vk)的核酸分子分別對應于SEQ ID NO3、SEQ ID NO7、SEQ ID NO11、SEQID NO18和SEQ ID NO26。本發明還涉及包含了單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重鏈和輕鏈可變區序列的核酸分子變異體或類似體。
            
 
            
另一方面，本發明還涉及各種分離的核酸分子的變異體，其序列與如下核酸序列相同SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQID NO11、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO24或SEQ IDNO26。具體地，核酸變異體的序列與如下核酸序列SEQ ID NO1、SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7、SEQ ID NO9、SEQ ID NO11、SEQ ID NO16、SEQ ID NO18、SEQ ID NO20、SEQ ID NO24或SEQ ID NO26的相同性至少達70％、優選至少達75％、更優選至少達80％、更優選至少達85％、更優選至少達90％、最優選至少達95％。
            
 
            
本發明還提供能特異性結合H5亞型禽流感病毒的抗體片段的編碼序列的核酸分子。
            
 
            
本發明更進一步還涉及編碼抗體重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NOs28-30、SEQ ID NOs34-36、SEQ ID NOs40-42、SEQ ID NOs46-48、SEQ ID NOs52-54和SEQ ID NOs58-60的所對應被分離的核酸分子。本發明還涉及編碼抗體輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NOs31-33、SEQ ID NOs37-39、SEQ ID NOs43-45、SEQ ID NOs49-51和SEQ ID NOs61-63的所對應的核酸分子。
            
 
            
本發明涉及含有所述核酸分子的重組表達載體，也涉及轉化了這些分子的宿主細胞。而且，本發明還涉及利用包含了所述核酸分子的宿主細胞在特定條件下培養并分離得到發明所述抗體的方法。
            
 
            
抗體多肽序列   
            
單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重鏈和輕鏈可變區氨基酸序列可以從對應的核酸序列中推導得到。單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2重鏈可變區氨基酸序列分別是SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO17、SEQ ID NO21和SEQ ID NO25。單抗8H5、3C8、10F7、4D1和2F2輕鏈可變區氨基酸序列分別是SEQID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO19和SEQ ID NO27。一方面，本發明提供的抗H5單抗包含的重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQID NO10、SEQ ID NO17、SEQ ID NO21和SEQ ID NO25。另一方面，本發明提供的抗H5單抗包含的輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO4、SEQ ID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO19和SEQ ID NO27。
            
 
            
另一方面，本發明提供的抗體的重鏈可變區的氨基酸序列與SEQ ID NO2、SEQID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO17、SEQ ID NO21或SEQ ID NO25的序列相似性至少達70％，優選是至少75％，優選是至少80％，優選是85％，再優選是至少90％，最好的是至少95％。
            
 
            
另一方面，本發明提供的抗體的輕鏈可變區的氨基酸序列與SEQ ID NO4、SEQID NO8、SEQ ID NO12、SEQ ID NO19或SEQ ID NO27的序列相似性至少達70％，優選是至少75％，優選是至少80％，優選是85％，再優選是至少90％，最好的是至少95％。
            
 
            
單抗8H5、3C8、10F7、4D1、3G4和2F2的重鏈和輕鏈可變區的CDR的氨基酸序列確定如下   
            
單抗8H5重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ IDNos28-30。單抗8H5輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ IDNos31-33。
            
 
            
單抗3C8重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos34-36。單抗3C8輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos37-39。
            
 
            
單抗10F7重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos40-42。單抗10F7輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos43-45。
            
 
            
單抗4D1重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos46-48。單抗4D1輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos49-51。
            
 
            
單抗3G4重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos52-54。
            
 
            
單抗2F2重鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos58-60。單抗2F2輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID Nos61-63。
            
 
            
另一方面，本發明提供了抗H5單抗重鏈或片段，其含有如下CDR(i)來自SEQID NOs28-30的一個或多個CDR；(ii)來自SEQ ID NOs34-36的一個或多個CDR；(iii)來自SEQ ID NOs40-42的一個或多個CDR；(iv)來自SEQ ID NOs46-48的一個或多個CDR；(v)來自SEQ ID NOs52-54的一個或多個CDR；或(vi)來自SEQ ID NOs58-60的一個或多個CDR。在一實施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個氨基酸序列為SEQID NOs28-30的CDR。在另一實施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個氨基酸序列為SEQ ID NOs34-36的CDR。在又一實施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個氨基酸序列為SEQ ID NOs40-42的CDR。在又一實施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個氨基酸序列為SEQ ID NOs46-48的CDR。在又一實施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個氨基酸序列為SEQ ID NOs52-54的CDR。在又一實施方式中，抗H5單抗重鏈或片段含有三個其氨基酸序列為SEQ ID NOs58-60的CDR。
            
 
            
另一方面，抗H5單抗的重鏈或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ IDNOs28-30、34-36、40-42、46-48、52-54和58-60上出現一個或多個氨基酸的突變或增添或缺失。優選的是，突變或添加或缺失的氨基酸不超過3個氨基酸。更優選的是，突變或添加或缺失的氨基酸不超過2個氨基酸。最優選的是，突變或添加或缺失的氨基酸不超過1個氨基酸。
            
 
            
另一方面，本發明提供了抗H5單抗輕鏈或片段含有如下CDR(i)來自SEQ IDNOs31-33的一個或多個CDR；(ii)來自SEQ ID NOs37-39的一個或多個CDR；(iii)來自SEQ ID NOs43-45的一個或多個CDR；(iv)來自SEQ ID NOs49-51的一個或多個CDR；(v)來自SEQ ID NOs61-63的一個或多個CDR。在一實施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個其氨基酸序列為SEQ ID NOs31-33的CDR。在另一實施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個其氨基酸序列為SEQ ID NOs37-39的CDR。在又一實施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個其氨基酸序列為SEQ ID NOs43-45的CDR。在又一實施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個其氨基酸序列為SEQ ID NOs49-51的CDR。在又一實施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個其氨基酸序列為SEQ ID NOs55-57的CDR。在又一實施方式中，抗H5單抗輕鏈或片段含有三個其氨基酸序列為SEQ IDNOs61-63的CDR。
            
 
            
另一方面，抗H5單抗的輕鏈或片段的CDR含有的氨基酸序列可能是在SEQ IDNOs31-33，37-39，43-45，49-51和61-63上出現一個或多個氨基酸的突變、增添或缺失。優選的是，突變、添加或缺失的氨基酸不超過3個氨基酸。更優選的是，突變、添加或缺失的氨基酸不超過2個氨基酸。最優選的是，突變、添加或缺失的氨基酸不超過1個氨基酸。
            
 
            
上述抗體或CDR的可變區的氨基酸發生突變、添加或缺失之后的變異體仍然保留特異性結合H5亞型禽流感病毒的能力。本發明也包含這樣的抗原結合片段的變異體。
            
 
            
本發明的單抗變異體可以通過傳統的基因工程方法獲得。本領域的技術人員完全知曉利用核酸突變改造DNA分子的方法。另外，編碼重鏈和輕鏈變異體的核酸分子也可以通過化學合成獲得。
            
 
            
嵌合抗體、人源化抗體合融合蛋白   
            
另一方面，本發明也提供了嵌合抗體，它是由鼠源單抗8H5，3C8，10F7，4D1，3G4或2F2或其變異體的重鏈和/或輕鏈完整的或部分的可變區結合人源單抗恒定區組成的。而且，本發明也包括了人源化抗體，它們是由鼠源單抗8H5，3C8，10F7，4D1，3G4或2F2或其變異體的的一個或多個CDR嫁接到人源抗體的框架上組成的。
            
 
            
另一方面，本發明還提供了藕聯了某種分子的完全或部分含有本發明所述單抗的一種融合蛋白。
            
 
            
嵌合抗體、人源化抗體和融合蛋白都可以利用傳統的基因工程技術獲得。如，編碼單抗的DNA可以通過突變的方法把人源抗體的重鏈和輕鏈的恒定區的序列替換成同源性的鼠源序列而改造成(Morrison，et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.816851(1984))，或通過把整個或部分免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白編碼序列進行共價藕聯而獲得嵌合或人源化抗體或融合蛋白。
            
 
            
中和抗體   
            
另一方面，本發明提供了能夠中和H5亞型禽流感病毒之病毒活性的抗H5抗體。在一實施方式中，這種中和抗體能夠中和H5亞型禽流感病毒之病毒活性的至少60％，或至少70％，或優選至少75％，或優選至少80％，或優選至少85％，或優選至少90％，更優選至少95％，最優選至少99％。
            
 
            
本領域普通技術人員完全知曉利用傳統的技術方法可以測定抗體中和H5亞型禽流感病毒的病毒活性。如本發明的實施例1中所描述的中和試驗的方法即可用于測定本發明中的某一個特定H5單抗的中和活性。
            
 
            
短肽   
            
本發明還提供了一種模擬單克隆抗體識別表位的短肽。
            
 
            
九個含7個氨基酸的短肽由于其與單克隆抗體8H5、3C8結合而被篩選出來.其中，五個與8H5單克隆抗體結合的短肽有氨基酸序列SEQ ID NOS64-68，4個與3C8單克隆抗體結合的短肽有氨基酸序列SEQ ID NOS70-73(表14)。
            
 
            
七肽8H5A(SEQ ID NO64)和8H5E(SEQ ID NO68)顯示了反應活性.8H5A七肽和8H5單克隆抗體結合得非常好，但與其他單克隆抗體結合得弱.8H5E七肽和8H5單克隆抗體結合得相對較差。
            
 
            
進一步地，本發明還提供了12個與單克隆抗體8H5結合有好而的特性的含12個氨基酸的短肽確(表16，SEQ ID NOS74-97)。
            
 
            
該12肽(SEQ ID NOS123，SEQ ID NOS125)可用于制成融合蛋白239-123和239-125，該融合蛋白分別和8C11及8H5單克隆抗體結合得很好.該12肽123或125可用于和HBVcAg制成融合蛋白，該融合蛋白和8H5單克隆抗體而非其他抗體結合有特性.融合蛋白HBc-122，HBc-124，HBc-128，HBc-129和8H5單克隆抗體而非其他抗體結合有特性.融合蛋白HBc-123，HBc-124，HBc-125，HBc-128，HBc-129還可模擬單克隆抗體識別表位而形成類似病毒顆粒的組裝。
            
 
            
檢測方法   
            
本發明還提供了一種利用本發明所述單克隆抗體檢測H5型禽流感病毒標本中的抗原和/或抗體的方法。
            
 
            
一方面，本發明提供了檢測H5亞型禽流感病毒的方法，包括以下幾個步驟(i)將本發明的某一株單克隆抗體或其某個片段與上述樣品中的病毒結合而成抗體病毒或抗體片段病毒復合物；(ii)檢測該樣品復合物以確定樣品中是否有病毒。
            
 
            
另一方面，本發明提供了一種檢測樣品中H5亞型禽流感病毒的方法，包括以下幾個步驟(i)將第一抗體吸附到固相支持物上；(ii)在上述支持物中加入可能含有H5亞型禽流感病毒的可疑待測樣品；(iii)在上述支持物中加入帶有標記物的第二抗體；(iv)檢測該標記物的存在從而判定H5亞型禽流感病毒是否存在。
            
 
            
本發明的另一個方面，提供了一種檢測樣品中H5亞型禽流感病毒的檢測方法，包括以下幾步(i)將抗體吸附到某一固相支持物；(ii)在該固相支持物中加入預混合H5血凝素標記物的可能含有H5亞型禽流感病毒的樣品；(iii)檢測是否存在H5血凝素標記物。
            
 
            
檢測方法可以使用酶聯免疫吸附(ELISA)、酶免疫檢測、化學發光免疫檢測、放射免疫檢測、熒光免疫檢測、免疫色譜法、競爭法及類似檢測方法。利用競爭法或夾心法方式，上述檢測方法可以用于檢測目標抗原或抗體。
            
 
            
競爭法是比較樣品中抗原和一種已知量的標記抗原競爭結合本發明所述單克隆抗體的數量關系。開展基于競爭法的免疫學檢測是將含有未知數量的目標抗原的樣品加入到事先用已知的物理或化學方法把本發明所述單抗包被到固相支持物上而得以進行的。同時加入預先定量的標記后的目標抗原進行反應。孵育后，沖洗固相支持物，檢測結合到該支持物上的標記物的活性。
            
 
            
在夾心法中，樣品中的目標抗原被夾在包被單抗和標記單抗之間，然后再加入標記物比如酶的底物，通過底物顏色的變化檢測并判定抗原的存在。開展基于夾心法的免疫學檢測，例如，先把含有一種未知數量目標抗原的樣品加入到用物理或化學方法預先包被了本發明中所述單克隆抗體的固相支持物上進行反應。然后，加入本發明所述的標記單抗進行反應。孵育后，沖洗該支持物，再對結合到該支持物上的標記物的活性進行檢測。標記物可以是放射性同位素如125碘、酶、酶的底物、發光物質如異魯米諾和吖啶酯、熒光物質如熒光素和羅丹明、生物素和有色物質如乳膠顆粒和膠體金等。標記用的酶可以是過氧化物酶(如辣根過氧化物酶HRP)、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。對于這些反應中合適的底物有2，2＇-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)、魯米諾-過氧化氫、鄰苯二胺-過氧化氫(針對過氧化物酶)、對硝基苯磷酸鹽、4-甲基磷酸傘型酮、3-(2＇-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3＂-磷酰基)苯基-1，2-二乙氧基烷(針對堿性磷酸酶)、對硝基苯-β-D-半乳糖和甲基傘形酮-β-D-半乳糖(針對β半乳糖苷酶)。其它的標記包括量子點標記、生色團標記、酶標記、親和配體標記、電磁自旋標記、重原子標記、標記有納米微粒光散射標記或其它納米微粒的探針、異硫氰酸熒光素(FITC)、TRITC、羅丹明、四甲基羅丹明、R-藻紅蛋白、Cy-3、Cy-5、Cy-7、得克薩斯紅、Phar-Red、異藻紅蛋白(APC)、表位標記如FLAG或HA表位、以及酶標記如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、I2-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶和半抗原偶聯物如洋地黃毒苷或二硝基苯酚、或能夠形成配合物的結合配對如鏈霉抗生物素蛋白/生物素、抗生物素蛋白/生物素或抗原/抗體配合物如包括兔IgG和抗-兔IgG；熒光基團如傘形三糖(umbelliferone)、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、綠熒光蛋白、藻紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀綠、二苯乙烯、熒光黃、Cascade藍、二氯三嗪基熒光素、丹磺酰氯、藻紅蛋白、熒光鑭系絡合物如包括銪和鋱、Cy3、Cy5、分子信標(molecular beacons)和其熒光衍生物、發光材料如魯米諾；光散射或細胞質基因組共振材料如金或銀顆粒或量子斑(quantumdot)或放射性材料如14C、123I、124I、131I、Tc99m、35S或3H；或球珠(spherical shell)，以及標記有本領域已知的任何其它信號產生標記物的探針。例如，可檢測的分子包括但不限于熒光基團以及前面所述其它已知的，如在Joseph R.Lakowicz(Editor)所編的Principles of Fluorescence Spectroscopy，Plenum Pub Corp，第二版(July 1999)和Richard P.Hoagland的第六版的Molecular Probes Handbook所描述的。在某些實施方式中，標記物包括半導體納米微晶如量子斑(即Qdots)，參見U.S.P 6,207,392。Qdots可從Quantum Dot Corporation購得。用于本發明的半導體納米微晶包括Group II-V半導體的納米微晶如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe和其混合物以及Group III-V半導體的納米微晶如GaAs、InGaAs、InP、InAs和其混合物。Group IV半導體如鍺或硅的使用，或有機半導體的使用，在某些條件下可能是方便可行的。半導體納米微晶也可以包括合金，其含有兩種或多種選自于Group III-V化合物、Group II-VI化合物、Group IV元素和其組合物的半導體。
            
 
            
在某些實施方式中，熒光能量受體連接到檢測探針作為標記物。在一實施方式中，熒光能量受體可以通過化合物與單線態氧反應形成熒光化合物而形成，或通過化合物與一輔助化合物反應并將其轉化為熒光化合物而形成。這類化合物可以包括于本發明裝置中的緩沖液中。在其它的實施方式中，熒光能量受體可以是包括化學發光劑或基團的化合物的一部分，例如，熒光能量受體可以包括稀土金屬如銪、釤、碲等金屬絡合物。這些材料因其具有尖銳的發光譜帶而特別具有吸引力；而且，鑭系標記物如銪(III)可以提供有效的長時間的信號發射，同時不易光漂白，因而可以使得含有處理/反應樣品的測試裝置在需要的情況下可以放置較長一段時間。在各種異源和同源免疫測定法中，已經使用長壽命的熒光銪(III)絡合物納米微粒作為標記物，例如可以參見Huhtinen et al.Clin.Chem.2004 Oct；50(10)1935-6。但這些內部標記的納米微粒與時間分辨熒光檢測一起使用時，測定性能可以改善。在異源測定中，低濃度下測定的動態范圍可以擴展；而且，通過使用檢測抗體涂敷的高特異活性納米微粒標記物，而不是使用常規標記的檢測抗體，測定的動力學特性也可以改善。在同源測定中，對于熒光共振能量轉移來說，銪(III)納米微粒是很有效的供體，從而可以進行簡單、快速和高效的篩選。在一實施方式中，標記物如此處披露的熒光標記物，包括與生物分子偶聯的納米微粒標記物。換句話說，納米微粒可以用作檢測或捕捉探針。例如，本發明中，可以利用連接到單抗或鏈霉抗生物素蛋白(SA)的銪(III)-標記的納米微粒來檢測樣品中特定的分析物，如納米微粒基的免疫測定。納米微粒可以作為附著特定結合劑的底物，這些特定結合劑是針對分析物和檢測(如標記物)或捕捉成分的。有關標記物的實例可以參見U.S.P 4,695,554；4,863,875；4,373,932；和4,366,241。U.S.P 4,313,734和4,373,932中則披露了膠體金屬和染色顆粒。而U.S.P 4,954,452中則披露了如何制備和使用非金屬的膠體；U.S.P 4,252,459中披露了用作標記物的有機聚合物乳膠顆粒。
            
 
            
把標記物結合到抗原或抗體上的方法，可以通過順丁烯二酰亞胺法(J.Biochem.(1976)，79,233)、生物素活化法(J.Am.Chem.Soc.(1978)，100，3585)、疏水結合法、酯活化法或異氰酸酯法(＂Enzyme免疫測定techniques＂，published in 1987 by IgakuShoin)。
            
 
            
如果上述標記物為放射性同位素，則需使用好的防輻射的工作臺面或液體防護設備。如果上述標記物為酶，需加入底物，酶的活性通過比色法或熒光計測定。如果上述標記物為熒光物質、發光物質或有色物質，測定方法可以相應的使用本領域熟知的方法進行測定。
            
 
            
本發明中，用于檢測H5亞型禽流感病毒的樣品包括但不限于動物或病人的排泄物、口腔和鼻腔分泌物、雞胚培養中的全病毒或裂解病毒等。
            
 
            
檢測裝置和試劑盒   
            
本發明還涉及一種檢測H5亞型禽流感病毒感染的診斷試劑盒，尤其是檢測樣品中H5亞型禽流感病毒抗原或抗體的診斷試劑盒。本發明所述診斷試劑盒包含至少一種本發明所述單克隆抗體。本發明所述診斷試劑所使用的本發明所述單克隆抗體并不做特別限制，可以是任何一株識別H5血凝素抗原的單抗，也可以是本發明所述的具抗原特異性的任一單抗的抗體片段，如F(ab＇)2、Fab＇、Fab等。
            
 
            
一方面，本發明涉及兩種檢測H5亞型禽流感病毒的試劑盒，這些試劑至少包括一種單抗或者是它們的活性片段或者是突變體。優選地，本發明的試劑盒還包含適合檢測抗原-抗體反應的檢測試劑。
            
 
            
另一方面，本發明涉及一種檢測抗H5亞型禽流感病毒抗體的試劑盒，它包括至少一種本發明所述單抗或其活性片段或其突變體。優選地，本發明中所述試劑盒包含適合檢測抗原-抗體反應的檢測試劑。
            
 
            
本發明的診斷試劑盒中涉及的固體支持物或固相支持物包括但不限于微孔板、磁微粒、免疫色譜用濾紙、聚合體例如聚苯乙烯、玻璃珠、玻璃濾器和其它不溶的載體。在一實施例中，一個包含多個隔間或區域的固相支持物中，至少有一個隔間用本發明的抗體所涂蓋。優選的是，至少一個隔間(或第一個隔間)用本發明的抗體所涂蓋，并且至少一個剩余的隔間(或第二個隔間)用可以和禽流感病毒除H5以外的亞型(例如，H1，H2，H3，H4，H6，H7，H9，H10，H11，H12，H13，H13，H14，H15orH16)可以特異性地結合的抗體所涂蓋，優選的是亞型H1，H3，H7，H9。
            
 
            
本發明的診斷試劑還包含一些其它成分，包括但不限于標記用的酶、相應底物、放射性同位素、反光物質、熒光物質、有色物質、緩沖液和板條以及前面提到的諸如此類的物質。
            
 
            
本發明的診斷試劑中，所使用的發明單抗必須預先包被在固相支持物上。在一優選的實施方式中，對包被的單抗進行方向定位會有助于提高抗原抗體結合效率。TaeWoonCha等(Proteomics 5,416-419(2005))已證實控制預包被蛋白分子的構象及設計固相支持物表面理想的化學環境將有助于保持和提高固相化蛋白的反應活性及效價。文獻已報道過多種方法能夠把抗體按預定構象方向結合在固相支持物上。Shawn Weng等(Proteomics 2，48-57(2002))曾報道過利用核酸連接蛋白的方法使蛋白分子以相同的空間定位結合在某個表面上。Soellner，M等(J.AM.CHEM.SOC.125，11790-11791(2003))報道了一種能把包括抗體和抗原在內的蛋白通過Staudinger連接反應而以一種相同的方式結合到某個表面上的方法。在Staudinger反應中，疊氮化合物和磷硫酯反應形成一種氨基化合物。HairongZhang等(Anal.Chem，78,609-616(2006))報道了一種通過抗體Fab＇片段上的自由硫醇反應將鍍金的磁珠上抗體定位到顆粒表面的方法，依據這個，所有抗體上的抗原結合位點都定位于一個理想的構象上。Hai Xu等(J.Phys.Chem.B，110，1907-1914(2006))曾報道將抗體吸附到親水硅氧化物/水表面的方法。Seung-yong Seong等(Proteomics，3，2176-2189(2003))概括了定向地將蛋白固定到某個表面的方法以及在這些方法中所用到的蛋白分子。所有這些參考文獻都被完整地歸納在這里。
            
 
            
本發明的診斷試劑盒中，所使用的單抗或抗原必須事先用上述提到的標記物標記。
            
 
            
本發明還涉及一種可自動化檢測樣品中的禽流感病毒的自動化檢測裝置。
            
 
            
現有技術中已經公開了各種利用免疫化學檢測生物液樣品中是否存在分析物的裝置。這類裝置可以利用所謂的“夾心法”測定，例如，目標分析物如抗原夾在標記的抗體和固定在固相支持物的抗體之間。通過觀察是否存在結合的抗原標記的抗體復合物和/或其數量而進行測定。這類裝置也可以采用競爭法免疫測定，其中，將結合于固相表面的抗體與含有未知數量抗原分析物的樣品以及與同樣類型的標記抗原進行接觸。然后，測定結合于固相表面的標記的抗原的數量，從而為樣品中抗原分析物的數量提供間接的測量。不同的測定可以利用適于測定不同分析物的裝置，例如，將不同的抗體或抗原結合于測試底物的設計區或可尋址區(如吸水或非吸水膜)。由于這些方法以及下面討論的其它的方法既可以檢測抗體，也可以檢測抗原，它們通常稱作免疫化學配體-受體測定或簡稱免疫測定法.   
            
固相免疫測定裝置，無論是夾心法類型還是競爭法類型，都可以對生物液樣品如血液或尿液中的分析物提供靈敏的檢測。固相免疫測定裝置包括固相支持物，其中，配體-受體對中的一員，通常是抗體、抗原或半抗原，結合于該固相支持物上。通常，早期的固相支持物的形式為平板、試管或聚苯乙烯珠，這在放射免疫測定和酶免疫測定中是熟知的。最近，人們采用各種多孔材料如尼龍、硝化纖維素、乙酸纖維素酯、玻璃纖維和其它的多孔聚合物作為固相支持物。人們也公開了許多自身帶免疫測定的試劑盒，其采用多孔材料作為免疫化學成分如抗原、半抗原或抗體的固相載體。通常這些試劑盒在設計上可以采用纖維素試紙、流通或或遷移。本發明中可以采用任何常規的、已知的裝置來完成免疫測定或特異性結合測定，以檢測流感。
            
 
            
在某些方面，本發明包括檢測由各種流感病毒或其亞型引起的感染H3的裝置。在某些實施方式中，將含有一種或多種流感病毒或抗流感病毒抗體的樣品送入裝置中，以測定樣品是否被一種或多種流感病毒或其亞型感染的主體。包含固相支持物的裝置可以包括置于其上的抗流感病毒抗體或流感病毒抗原，從而可以對懷疑含有流感病毒、流感病毒蛋白或抗流感病毒抗體的樣品進行測定。在許多實施方式中，本發明裝置中所使用的抗體包括但不限于多抗、單抗(MAb)或其保守性或功能性變體、嵌合抗體、變形抗體、人源化抗體、其生物活性片段或這些抗體的任意組合；此處功能性抗體或其片段，從整體上講就是指抗體。本發明的抗體可以適應任何裝置，以檢測流感病毒。例如，H5禽流感病毒可以通過靶定樣品中的H5蛋白或抗H5亞型抗體而予以檢測。在一實施方式中，H5是來自禽流感病毒(AIV)。
            
 
            
市場上購得的許多裝置可以很容易地安裝(或附加)此處所公開的抗體或抗原。這些裝置可以包括檢測方法中所使用的固相底物，包括但不限于微孔板、磁珠、免疫色譜用的濾紙、聚合物如聚苯乙烯、玻璃珠、玻璃濾器和其它不溶性的載體。底物通常可以是但不限于下列形狀帶狀、板狀、芯片、球狀、珠狀、孔狀如微滴定板上的孔、或任何其它合適的形狀。而且，結合其配合搭檔(即抗原或抗體)的可以是任何形狀，例如，微滴定盤、試管、纖維素試紙、微離心管、珠、自旋盤等等。合適的材料包括玻璃、塑料(如聚乙烯、PVC、聚丙烯、聚苯乙烯等)、蛋白、紙、碳水化合物和其它的固相支持物。其它可以使用的材料包括陶瓷、金屬、metalloids、半導體材料、水泥等。在某些實施方式中，免疫測定法(如ELISA)微滴定板包括96孔、384孔板或1536孔的形式，或更多的孔，如其它商用板。
            
 
            
一些可以使用的裝置包括纖維素試紙、側流裝置、cartridge、多重裝置、微滴定板、微流裝置、板或陣列或高通量的平臺，如在下列美國專利中所公開的U.S.專利號6,448,001；4,943,522；6,485,982；6,656,744；6,811,971；5,073,484；5,716,778；5,798,273；6,565,808；5,078,968；5,415,994；6,235,539；6,267,722；6,297,060；7,098,040；6,375,896；7,083,912；5,225,322；6,780,582；5,763,262；6,306,642；7,109,042；5,952,173和5,914,241。例如，微流裝置可以是U.S.P 5,707,799和WO2004/029221中所公開的。
            
 
            
纖維素試紙   
            
在一些很平常的纖維素試紙測定中，如家用懷孕和排卵檢測試劑盒中，免疫化學成分如抗體是結合在固相上。檢測裝置在懷疑含有未知抗原分析物的樣品中蘸一下，然后保溫培育。或者也可將少量的樣品置于樣品接受區中。然后加入標記的抗體，并檢測標記物，作為感興趣的分析物是否存在的指示。在某些情況下，標記物是酶，這樣，需要加入酶標記的抗體，其可同時加入或在保溫培育后加入。然后，清洗裝置，并將其再插入到含有酶的底物的第二溶液中。如果存在酶標記，其會與底物發生相互作用，使得產生帶色的產物，該產物要么作為沉淀物沉積到固相上，要么在底物溶液中產生可見光的變化。Baxter等在EP-A 0 125 118中公開了這樣的夾心形纖維素試紙的免疫測定.Kali et等在EP-A 0282 192中公開了一種可以用于競爭法測定的纖維素試紙裝置。T纖維素試紙的材料、形式以及標記物是已知的，而且可以用于流感檢測中。纖維素試紙裝置的實例包括U.S.P4,235,601、5,559,041、5,712,172和6,790,611中所描述的。在某些實施方式中，本發明的抗體可以置于纖維素試紙裝置上。例如，可以使用固相支持物纖維素試紙，檢測樣品中的抗H5亞型AIV抗體，其中可以在一處或多處基質(matrix)點位安裝該試紙。一處基質可附著有非特異性控制的抗體或其功能性片段。這些基質點位可以是蛋白結合位和/或抗原結合位，而且通常是由硝化纖維素制得的，但也可以使用本領域已知的任何適當的媒質，如某些尼龍和聚偏乙烯類。在某些實施方式中，可以在固相支持物附著多中基質，每一基質含有針對多種亞型流感病毒的抗原或抗體。
            
 
            
連續流   
            
連續流型免疫測定裝置的設計可以避免纖維素試紙測定中所需要的大量的培育和清洗。Valkirs等在U.S.P 4,632,901中公開了一種包括抗體(對目標抗原分析物具有特異性)的裝置，該抗體結合于多孔性膜或濾器中，而該裝置中加入液體樣品。由于液體流經或連續流過膜中，目標分析物結合到抗體上。在加入樣品之后，可以再加入標記的抗體。標記抗體的目視檢測可以指出樣品中是否存在目標抗原分析物。Korom et等在EP-A 0 299359中公開了一種在連續流裝置上的改進，其中，標記的抗體附載到一膜中，該膜起到試劑傳送體系的作用。這樣的裝置可以包括對樣品中的成分起過濾器作用的層，并包括檢測中所使用的試劑。當樣品從一層流向另一層時，其與特定的結合試劑接觸并發生反應，在某些情況下，標記體系中的組分可以提供是否存在目標分析物的指示。
            
 
            
免疫過濾裝置   
            
免疫過濾裝置可以從市場上購得(如Pierce，Rockford，IL)，而且可以很容易地進行改造，以附載本發明的抗體。在酶聯免疫流動測定法(ELIFA)中，在96孔樣品板和真空室之間使用硝化纖維素膜。反應劑加到樣品板上，真空使得反應劑通過該硝化纖維素膜。套管將沒有結合的產物轉移到收集室中。為了進行檢測，在添加酶底物前，在收集室中放置一微量培養板(微孔板)。真空使得帶色的產物轉移到微量培養板的孔中，以便在自動化的微量培養板讀取裝置上進行分析。ELIFA體系包括精確切割的聚甲基丙烯酸甲酯有機玻璃，并帶有密封墊圈，從而能夠提供從一個孔到另一個孔之間恒定的流率。套管可以精確地將帶色的產物轉移到微量培養板的孔中，以便進行分析。本發明的捕捉抗體基本上是點在底物上(如微滴定板、膜或芯片)。施加懷疑帶有流感病毒或流感病毒抗原的生物樣品并進行孵育，使得捕捉抗體與其結合。隨后，加入檢測抗體。U.S.專利申請2003/0108949公開了一種高通量的免疫過濾裝置。這樣的裝置可以包括起過濾器作用的層和/或包括檢測中所用的試劑。當樣品與特定的結合試劑發生反應，在某些情況下，標記體系中的組分就可以提供是否存在某一分析物的指示。
            
 
            
側流裝置   
            
在側流測定中，利用某些或全部的檢測用試劑來浸漬膜。提供分析物檢測區，并在該區檢測標記的分析物。例如，可以參見Tom等的U.S.P 4,366,241和Zuk的EP-A O143 574。已知對于側流檢測裝置可以進行許多改進。這類裝置可以包含某些特異性結合檢測中的試劑(樣品在施加到側流帶之前可以與某些試劑反應，或者可以依次地在側流帶上添加額外的試劑)，或者側流帶可以包含用于特異性結合檢測的所有必須的試劑。側流裝置經常包含試劑，這些試劑可以附著在彩色標記上，從而可以直接觀察到檢測結果，而不需要進一步添加其它物質。例如，可以參見Bernstein的U.S.P 4,770,853、May等人的WO88/08534和Ching等人的EP-A 0 299 428。這類裝置通常如此構建，使其包括施加樣品的位置、試劑區和檢測區。此類裝置通常是由吸水材料制得的，這樣可以使得樣品從樣品施加區經試劑或反應區連續流至檢測區。盡管某些反應在樣品施加到帶上之前可能就已發生，在某些實施方式中，反應區包括用于免疫測定的試劑。一種特異性結合試劑如抗體，其可以擴散性地結合到樣品施加區或反應區的帶上，使得其能夠結合樣品中的抗原，并與樣品一起沿帶流動。在檢測區，可以直接用抗原或抗體的另一特異性結合搭檔，捕捉抗原-抗體復合物，或者，也可以用另外的特異性結合搭檔，如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白和生物素，間接地予以捕獲。類似地，標記物可以直接地或間接地附著在抗原或抗體上。側流裝置的實例可參見U.S.P 4,818,677，4,943,522，5,096,837(RE 35,306)，5,096,837，5,118,428，5,118,630，5,221,616，5,223,220，5,225,328，5,415,994，5,434,057，5,521,102，5,536,646，5,541,069，5,686,315，5,763,262，5,766,961，5,770,460，5,773,234，5,786,220，5,804,452，5,814,455，5939，331和6,306,642。而U.S.P 4,703,017，6,187,598，6,352,862，6,485,982，6,534,320和6,767,714中則公開了其它的側流裝置，其可以改進，以便用于檢測液體樣品中的多個分析物。
            
 
            
常規技術中，可以在一單一的測試帶中為每個分析物建立單獨的檢測區，從而可以檢測一個樣品中的多個分析物。通過使用不同的標記物或者在不同檢測區檢測同一標記物，可以區分不同的分析物。可以采用任何常規的裝置，完成對多個分析物的測定。
            
 
            
免疫測定利用免疫體系的機制，其中，當存在致病的抗原或外來異物時，肌體就會作出反應，產生抗體。這些抗體和抗原，也即免疫反應物，能夠彼此結合，從而產生一種高特異性的反應機制，該機制可以用來確定測試樣品中是否存在特定的抗原以及其濃度。
            
 
            
這樣的側流裝置通常包括一多孔性膜，其任選地負載于剛性材料上。一般地，該多孔性膜可由許多材料制得，其能夠允許流體通過即可。例如，用于形成多孔性膜的材料包括但不限于天然材料、合成材料、或自然存在但經合成改性的材料如多糖(如纖維素材料如紙、纖維素衍生物如乙酸纖維素酯、硝化纖維素)；聚醚砜；聚乙烯；尼龍；PVDF；聚酯；聚丙烯；二氧化硅；無機材料如滅活氧化鋁，硅藻土，亞硫酸鎂，或其他無機微細材料，這些材料均勻地分布于多孔聚合物基體中，聚合物如氯乙烯，乙烯氯丙烯共聚物，乙烯氯乙烯醋酸鹽共聚物，自然生成的織物(如棉花)或合成的(如尼龍或人造纖維)；多孔滲水膠質，如硅膠，瓊脂糖，右旋糖苷和凝膠；聚合薄膜，如聚丙烯酰胺或其類似物。在一個特別實施方式中，所述多孔滲水膜有硝化纖維素和/或聚醚砜材料形成。應該理解的是所述術語“硝化纖維素”指纖維素硝酸酯，它可以只是硝化纖維素或是它與硝酸酯或其他酸酯的混和物，如帶有1-7個碳原子的脂族羧酸。
            
 
            
這樣的設備也可包括一個含有吸收襯墊的條帶，此條帶處于所述測試/檢測或對照區的上游或下游。如本領域技術人員所熟知，所述吸收襯墊可幫助促進毛細管作用力式液體流通過所述膜。在某些實施方式中，吸收襯墊可含有可移動的免疫測定試劑(如，抗體)。當然，需要理解的是，所述可移動或固定的免疫測定試劑也可以被處理在所述測試/檢測或對照區的上游的任何位置，就像在檢測系統的單獨組分中一樣。
            
 
            
在許多實施方式中，有些合適的材料可被用于形成所述樣品襯墊，包括但不限于，硝化纖維素，纖維素，多孔聚乙烯襯墊，纖維玻璃試紙。如果需要，樣品襯墊也可包括一種或多種預處理的分析試劑，它們或共價地或非共價地結合到襯墊上。所述待測樣品從樣品襯墊上轉移到與樣品襯墊一端連通的結合襯墊上。所述結合襯墊由一種可供液體流通的材料形成。例如，在一實施方式中，所述結合襯墊有纖維玻璃形成。應當理解的是其他結合襯墊也可用于本發明。可選擇地，在某些實施方式中，結合物或其他免疫試劑可被包括在一個組分內，所述組分在應用到檢測帶之前與樣品混合。
            
 
            
為方便檢測待測樣品中被分析的存在與否，可在所述結合襯墊上應用多種檢測探針。當這些檢測探針在結合襯墊上，當被分析物從樣品襯墊流到結合襯墊時(或在流體狀態)，這些探針仍然可供被分析物結合。一旦結合到被分析物，檢測探針隨后被用來識別被分析物的存在與否。檢測探針既可用于檢測又可用于校正。但在另一個實施方式中，單獨的標準探針可被應用到結合襯墊上，以與所述檢測探針結合以便同時標準化并檢測，所以可以消除常規分析標準系統通常導致的錯誤。然而，需要理解的是檢測探針和校正探針可以同時或分別應用在檢測中任何一個位置，并且不需要使用結合襯墊。此外，檢測探針和校正探針也可以應用在相同或不同的結合襯墊上。或者，檢測探針和校正探針也可以安置在診斷檢測單元的不同區域，例如在自帶性檢測設備上，如在液體，流動水槽或擦拭子上。
            
 
            
在一些情況下，可能需要以某種方式修飾所述檢測探針以便它們更容易結合到被分析物上。在這種情況下，所述檢測探針可被特定的特異性結合元件所修飾，所述特異性結合元件粘合到檢測探針上以形成結合探針。特異性結合元件一般指特異性結合配對的一個元件，如，兩種不同的分子，其中一個分子化學性和/或物理性地結合于另一個分子上。例如，免疫反應性特異結合元件可包括抗原、半抗原、配合體、抗體(初級的或二級的)和它們的腐惡貨物，包括那些由重組DNA方法或合成肽方法形成的物質。抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，重組蛋白或它們的混和物或片斷，或抗體于其他特異性結合元件的混和物。準備這樣的抗體的細節及它們作為特異性結合元件使用的合適性在此公開。其他普通特異性結合配對包括但不限于，生物素和抗生物素蛋白(或其衍生物)，生物素和鏈鎖狀球菌抗生物蛋白，糖類和血凝素，補充的核苷酸序列(包括探針和在檢測目標核酸序列的DNA雜交測定中使用的捕獲核酸序列)，補充的肽序列，包括那些由重組方法形成的肽序列，效應分子和受體分子，激素和激素結合蛋白，酶輔因子和酶，酶抑制物和酶，等等。而且，特異性結合配對包括與原始特異性元件相似的元件。例如，被分析物的衍生物或片斷，例如，被分析物類似物，都可被應用，只要它含有至少一個與被分析物相同的表位。
            
 
            
例如，在一實施方式中，含有檢測樣品的流體被運送到金標墊，在金標墊處分析物和被一種特殊結合元件修飾過的檢測探針混合以形成分析物復合物。因為金標墊與多孔滲水膜之間流動暢通，所以，所述復合物可以從金標墊出轉移至多孔滲水膜上的檢測區。或者，可以通過整合不同抗原(如，不同流感病毒或來自不同流感病毒的病毒抗原)的特異抗體來利用多個檢測區域。所述檢測區域可含有固定劑，所述固定劑一般可以和分析物和/或分析物復合物(如，分析物和檢測探針的復合物)形成化學或物力連接。在某些實施方式中，所述試劑可以是一種生物試劑，如本文公開的抗體。其他生物試劑已為本領域的技術人員所熟知，它們包括但不限于，抗原、半抗原、抗體、蛋白質A或G、抗生物素蛋白、鏈霉抗生素蛋白或它們的復合物。在某些情況，人們希望這些生物試劑具有和分析物和/或分析物與檢測探針的復合物結合的能力。
            
 
            
這些試劑用于檢測探針/分析物復合物的固定結合位點。在某些情況下，分析物，如抗體、抗原等，含有兩個結合位點。一旦到達檢測區，其中的一個結合位點被復合探針的特異結合元件占據。但是，分析物的未被占據的位點可以和固定劑結合。一旦和固定劑結合，復合探針就形成一種新的三重夾心式復合物。
            
 
            
檢測或測試區一般可以提供任意數量的不同檢測區域，以便使用者可以更好地決定待測樣品中特定分析物的存在與否。每個區域都含有相同的試劑或含有固定多種分析物的不同試劑。例如，檢測區可能包括兩個或更多的不同檢測區域(如，線狀、點狀等)。檢測區域可能被處理成線狀的形式，其方向與待測樣品流動通過分析裝置的方向實質上垂直。同樣，在某些實施方式中，檢測區域可能被處理成線狀的形式，其方向與待檢測樣品流動通過分析裝置的方向實質上平行。
            
 
            
在某些情況下，所述膜也可以確定一個對照區(未示)，它可用來給使用者一個分析正常進行的信號。例如，所述對照區(未示)可以含有一種固定劑，所述固定劑一般具有和探針或固定在探針上的試劑化學和/物理結合的能力。這種試劑包括但不限于，例如，抗原、半抗原、抗體、蛋白質A或G、抗生物素蛋白、鏈霉抗生素蛋白、二級抗體或它們的復合物。另外，也可能希望使用各種不同的非生物材料作為對照區試劑。例如，在某些實施方式中，所述對照區試劑可能包括一種聚合電解質，如上所述的，可能結合到未被固定的探針上。因為所述對照區的試劑只對探針是特異性的，無論分析物是否存在都會有信號形成。所述對照區可以被放置在沿著膜的任何位置，但優選位于檢測區的上游。
            
 
            
使用這種分析裝置檢測某種分析物是否存在可以使用各種不同的形式。例如，在上述實施方式中，利用了一種夾心式的方式。其他利用此夾心式測定的例子參見Grubb等人的美國專利第4,168,146號，以及Tom的美國專利第4,366,241號，這些文獻在此被完全飲引用。另外，也可使用其他方式，如競爭式。在競爭式分析中，標記探針通常和一個與分析物相同或相似的分子配對。所以，標記探針就和待測分析物競爭可以利用的試劑。在檢測分析物如半抗原時通常用競爭式測定，每個單價半抗原只可結合一個抗體分子。競爭式免疫測定的例子參見Deutsch等人美國專利第4,235,601號，Liotta的第4,442,204號及Buechler的第5,208,535號專利，在此這些文獻被完全引用。其他形式的設備參見Lambofte等人的第5,395,754號專利、Jou等人的第5,670,381號專利及Malick等人的第6,194,220號專利。這些專利文獻在此被完全引用。
            
 
            
微流控制裝置   
            
在本發明的某些方面，本文所公開的抗體可被整合到一個微流控器件中。此設備是一個微流體流動系統，可以結合一個或更多分析物。結合上的分析物可直接在設備上分析或從設備上分離下來，例如作更進一步的分析或處理。可選擇的，未結合到設備上的分析物可被收集起來，例如，作進一步的處理或分析。
            
 
            
示范性的設備是一種帶有可供樣品流通的平板通道的流動式儀器。此類設備參見美國專利第5,837,115號。樣品可以通過重力、毛細管或一種主動力被轉移到此設備中，如通過輸液泵將一種樣品如血液灌輸到微流控器件中。其他已知輸送方法也可以使用。微流控器件可任意地依靠設備中的一排結構體來固定分析物。所述結構體可通過多種方法制造，包括但不限于，激光照射、壓紋、x光微影(LIGA)、電鍍、電鑄、影印石版術、活性離子蝕刻、離子束處理法、壓縮模塑法、鑄造、動力噴射造型法、噴射造型法、顯微機械加工材料。需了解的是，制造本發明設備所使用的方法不是關鍵的，只要所用方法導致大量的同樣的結構體和設備。而且，這種方法必須導致所述結構體的大表面積且相互排列緊密以產生一個狹窄的通道。所述通道允許分析物在液體中分散以提高在固定位點固定分析物和/或標記試劑的效率。
            
 
            
所述大批量生產的結構體優選由任意數量的聚合材料制成。這些材料包括，但不限于，聚烯烴類如聚丙烯、聚乙稀，聚酯如聚乙稀對苯二酸酯，含聚合物的苯乙烯如聚苯乙烯、苯乙烯丙烯腈、丙烯腈丁二烯乙烯苯均聚物，聚碳酸酯，丙烯酸聚合物如聚甲基丙烯酸甲酯和聚丙烯酸腈，含聚合物的氯化物如乙稀聚合物的氯化物和聚偏二氯乙烯，乙縮醛同質聚合物和共聚物，纖維素及其酯類，纖維素硝酸鹽，含聚合物的氟化物如聚偏二氟乙烯，聚四氟乙烯，聚酰胺，酰亞胺，聚醚醚酮，含聚合物的硫化物如聚亞苯基硫化物和聚醚硫化物，聚亞安酯，含聚合物的硅化物如聚二烷基硅氧烷。另外，所述結構體可由共聚物、上述材料的混合物和/或碾壓物、金屬箔如鋁箔、金屬處理的膜或沉積在上述材料的金屬制成，也可由玻璃或陶瓷材料制成。在其中的一種方法中，一種激光如受激準分子激光器可被用來照射光掩膜，以便從光掩膜穿過的光融化底層材料以在材料基層形成通道(Sercel，J.，et al.，SPIE Proceedings，Vol.998，September，1988)。
            
 
            
通常，微流控器件可包括一個供待測樣品進入的入口。通常所述通道為毛細管，用來轉移所述待測樣品從進口到設備中，還包括一排結構體用來提供固定位點，以及一個通口，如排放氣體的出口。另外，定制此設備時還可以增加反應槽(chambers)和額外的毛細管。通常，待測樣品依靠毛細管作用力移動通過設備。另外，可以使用一個或多個毛細管帶動待測樣品從進口到通道中。此外，可以使用一個或多個毛細管脫離設備的結構體面積(structures area)。但是，也可使用不同壓力驅動液體在設備中流動，以此來代替或增加毛細管動力。
            
 
            
可供液體流動的通道由相鄰結構體之間產生。通道和結構體設計對于優化結構體表面和流體分子的接觸是重要的。代表性地，通道的深度約從1μm到1mm。通道的平均寬度一般約從0.02μm到20μm。通道可以包括各種形狀的結構體，包括菱形、六邊形、環形或方形，其高度一般約從1mu.m到1mm，平均寬度約從1μm到1mm。
            
 
            
固定劑可以像在毛細管和/或反應槽里一樣共價地或非共價地結合到結構體的表面。所述試劑可以是限時釋放試劑，空間隔離試劑，或被包被和干燥于表面。放置固定劑到所述表面的技術已為本領域的技術人員所熟知。在一個實施方式中，所述固定劑是本文所公開的以流感病毒抗原(如H5 AIV)為靶標的抗體。
            
 
            
使用本發明設備的方法包括利用特異性結合元件。檢測的方法包括與有色標記物入熒光染色劑獲有色顆粒的結合。可選擇地，檢測步驟可包括與一種可產生有色產物的酶的結合。
            
 
            
本發明的設備中可以使用一個或多個代替的流動途徑。毛細管從進口運輸待測樣品后分支成不同的通路通向結構體的主要通路和代替通路。代替通路可以允許多個固定位點的存在，且允許在單個測試位點上同時實現分析物的存在與否或多個分析物的數量。在一個優選實施方式中，在檢測設備中多個分析物(不同流感亞型)被確定。
            
 
            
替代通路可包括混合所述試劑盒待測樣品的區域。例如，反應槽可作為添加試劑的區域。另外，此設備通道中也可包括誘捕設備(trapping device)用以清除一定尺寸以上的流體成分。例如，在本發明的設備中可包括一個分離器，例如從全血中分離出血漿或血清。例如，一種疏水燒結多孔滲水材料的粘合物質(matrix)可使一種血紅細胞粘合劑應用到其表面上。所述粘合物質可被放置在設備中所述結構體的前面。全血樣品中的血紅細胞陷入到所述粘合物質的空隙中，而實質性的血細胞自由的血漿和血清穿過所述粘合物質，并被毛細管作用力輸送到設備中的結構體上。此處全盤引用美國專利第4933092號。
            
 
            
自動化   
            
本發明的抗體很容易適應自動化免疫化學分析儀。為方便本發明方法的自動化，以及減少轉變時間，本發明的免疫測定中的一個固定抗體需和磁性顆粒結合。
            
 
            
通過可獲得的商業方法將抗體與這樣的磁性珠結合，如Dynal公司[LakeSuccess，N.Y.(USA)]的M-280羊抗兔IgG包被的Dynabeads和目標蛋白的兔抗體，或使用Dynal公司的M-450 Tosylactivated Dynabeads，公家結合上一個相關抗體。可選擇地，試劑如戊二醛可用來使目標抗體共價結合到一個固體支持物上，優選磁性珠。代表性的結合試劑可包括有機化合物如硫脂，碳化二酰亞胺，琥珀酰亞胺酯，二異氰酸酯，戊二醛，重氮苯，六亞甲基二胺。
            
 
            
優選的自動化的/免疫分析系統是ACS180.RTM.自動化學發光系統[美國紐約塔里敦和馬薩諸塞州馬菲爾德拜耳公司；包括ACS:180 PLUS系統；ACS:180 SE系統和ACSCENTAUR.RTM.系統]。ACS:180.RTM.自動免疫測定系統參見文獻Dudley，B.S.，J.Clin.immunoassay，14(2)77(Summer 1991)。此系統利用化學發光標記物作為示蹤劑以及順磁性顆粒(PMP)作為固相試劑。ACS:180系統提供競爭式結合和夾心式結合兩種測定方式，其中每個步驟都是自動化的。ACS:180系統使用微米級順磁性顆粒以使可用的表面積最大化，而且提供一種不需離心就可從未結合的示蹤劑中快速磁分離已結合的示蹤劑的方法。試劑可被同時加入或稍后加入。其他標記物，如酶標物，也可代替如吖啶酯等化學發光標記物使用。優選用光度計檢測發光信號。優選使用拜耳公司的免疫1.TM.免疫測定系統。其他可適應使用本發明的抗體的運行免疫測定法的示范性自動化設備包括美國專利第5,807,522號和第6,907,722號。
            
 
            
在另一個實施方式中，本發明的抗流感抗體可被整合到自動多孔板以便使用免疫測定方法。多孔分析模具(如平板)可適應于在多孔分析模具的一個或多個孔或反應槽(如，多孔分析板的孔)內的誘導的基于化學發光的測定。多孔分析板可包括幾個元件，包括例如，平板頂部，平板底部，孔，工作電極，計算電極，參考電極，絕緣材料，電連接的接觸面，電連接所述電極和接觸面的傳導通孔，粘合劑，分析試劑，識別標記或記號。平板上的孔可以是平板頂部的開口，開口的內壁可以是孔壁。平板底部可與頂部粘合在一起(可以直接粘合或借助其他成分粘合)作為孔的底部。
            
 
            
所述多孔分析模具(如平板)可含有任意數量、任意形狀或尺寸、以任意形狀或構象排列及有多種不同材料組成的孔和/或反應槽。在本發明的一個優選實時方式中，所述多孔分析板為利用工業標準生產的多孔板，具有標準形式的平板和孔的數量、大小、形狀和構象。標準式樣實例包括96-，384-，1536-和9600-孔板，所述孔以二維排列。其他式樣包括單孔，雙孔，6-孔和24-孔和6144-孔板。優選地，所述孔和/或反應槽至少有一個整合在其中的第一電極，更優選地，包括至少一個第二電極。根據優選的實時方式，所述孔和/或反應槽至少含有一個整合在其中的工作電極，更優選地也包括至少一個計算電極。根據一個特別優選的實施方式，工作電極、計算電極，和任選地，參考電極都被整合到孔和/或反應槽中。所述分析平板優選平坦的，但也可以是彎曲的(不平坦的)。
            
 
            
而且，孔中、反應槽中和/或分析模具的分析區域中(例如，在多孔分析板的孔中)可包含一種或多種分析試劑。例如，在微滴板的不同區域可使用含有不同流感病毒抗體或一種流感病毒多肽的不同表型抗體的分析試劑。這些分析試劑可以被固定或被放置在一個或多個孔和/或反應槽的表面(優選在電極的表面，最優選在工作電極的表面)，并且可被固定于或被放置在一個或多個分析區域中(例如，以一定式樣排列的試劑被固定于或被放置在一個或多個孔和/或反應槽的表面，優選在工作電極和/或計算電極的表面，最優選在工作電極的表面)。所述分析試劑也可通過所述孔和/或反應槽的輪廓而被包含或定位在其內。例如，一定式樣的絕緣材料可限定或定位流體。
            
 
            
在一實施方式中，本發明的儀器可被用于促使并測量在分析模具中的發光，優選的是多孔分析板。可以整合在一起的有，例如，一個或多個光子偵測器；不透光外殼；用于接觸分析模具的電連接器；傳送多孔分析模具進出儀器的機械裝置(更具體地，是進出不透光外殼的機械裝置)；聯合并定位多孔分析模具和光子偵測器以及電連接器的機械裝置。觀察和辨別模具的裝置(如，一個或多個條形碼掃描器(如，一個條形碼掃描器掃描平板或模具的一側，另一個掃描平板或模具的另一側))；方位傳感器；使與模具有電連接器的機械設備，一個或多個引導在模具中發光的電源；和合適的電子裝置和軟件。
            
 
            
所述儀器也可包括儲存、堆放、移動和/或分布一個或多個分析模具的機械設備(如，多孔板棧式存儲器)。所述儀器可以方便地使用光子偵測器陣列(例如，光電二極管陣列)或成像光子偵測器陣列(例如，CCD照相機)以測量發光。這些探測器允許這些儀器測量從多孔(和/或反應槽)中發出的光，同時也/或使從單個孔(和/或反應槽)中發出的光的強度和空間分布成像。
            
 
            
優選地，所述儀器可以測量從分析模具的一個或多個區發出的光，優選的分析模具為多孔分析板。在某些實施方式中，一個區包括一群孔(和/或反應槽)，數量從一個到少于分析模具總孔(和/或反應槽)數(例如，一個多孔板中孔的一行，一列或二維子陣)。在一個優選的實施方式中，一個區包括多孔板孔數的4％-50％的孔。在一個特別優選的實施方式中，多孔分析板被分成柱狀部面(例如，一個區有一行或一列孔)或方形部面(例如，一個標準尺寸的多孔板杯分成六個等尺寸的方形部面)。在某些實施方式中，一個區包括一個或多個孔并在孔中有不止一個的流體容納區域。所述儀器，優選地，可以在一個給定的模具(優選平板)中逐步誘導ECL并/或逐步測量從所述區中而來的ECL。
            
 
            
所述儀器也可整合微處理器和電腦來控制器具中的某些功能，以及幫助存儲，分析和顯示數據。這些微處理器和電腦可位于儀器之內，或位于遠處而和儀器相連(例如通過網絡連接)。
            
 
            
膜/表面   
            
在本發明的諸多方面，整合了流感病毒抗原或抗流感病毒抗體的設備包括一個表面或膜。多種表面或膜可以為各種普通免疫測定設備提供一個表面，在其上抗體或抗原被固定或被處理。這樣，膜可以提供包括檢測區域和使用免疫試劑使檢測結果(例如，無論樣品含一中或多種病毒)可視化的對照區域。在多種實施方式中，含有流感病毒抗原或在其上處理有抗流感病毒抗體的膜被依次處理到固體支持物上(例如側向流動或纖維素試紙裝置)。
            
 
            
抗原/抗體可以結合到其上的膜或表面由一種材料組成，此材料包括但不限于纖維素、硝化纖維、尼龍、帶有一個四價氨基的陽離子尼龍(Zata探針)，被轉換成DPT的氨苯基硫醚(aminophenylthioether，APT)試紙，疊氮衍生物(和酶檢測標記物使用時不被染色)或親水聚偏二乙烯氟化物(PVDF)(可由Mass.，Billerica，Millipore得到)。術語“消化纖維”指任何纖維素的硝酸酯。所以合適的材料可包括與纖維素的羧酸酯結合的硝化纖維。硝化纖維膜的孔徑可有很大的變化，但通常是約在5-20微米，優選約8-15微米。但是，本領域技術人員可預期其他所熟知材料也可被使用。在某些實施方式中，所述測試區域包括由Millipore生產的被積壓到一個光亮的聚酯薄膜背襯的硝化纖維卷制成的硝化纖維網狀組件。在另一個實施方式中，此含有抗原/抗體區域(或“測試區域”)由尼龍制成。在另一個實施方式中，所述測試區域包括一種可以固定橡膠或其他可以攜帶另一個可特異性結合分析物的試劑的顆粒，因此可以確定一個測試區，例如壓制的尼龍粉末，或玻璃纖維。在某些實施方式中，所述測試區域包括一種在干燥狀態不透明而在潮濕狀態透明的材料。
            
 
            
測試和對照區   
            
設備可包括含有測試和對照區的膜或表面，測試區域可由上述材料的任何一種構成。通常測試區和對照區可確定測試區域的成分。在一個實施方式中，所述測試和對照區包括和測試區域相同的材料。通常，術語“測試區域”在此用來解釋在設備中/上包括至少一個測試和對照區的區域。在有些實施方式中，設備使用吸水材料而在某些實施方式中，為提供非吸水性的流體，這些材料要被終止液處理以打斷造成吸水膜吸水性的作用力。合適的終止液包括牛血清白蛋白，甲基化的牛血清白蛋白，動物的全血清，酪蛋白，脫脂奶粉，大量的清潔劑和聚合物，例如，PEG，PVA及其類似物。在某些實施方式中，在未處理的吸水膜上的干擾位點由于終止液的存在而完全破壞已允許費吸水性流體可以通過。如此處指出的，本發明的測試設備是一個帶有多個測試和對照區的設備。
            
 
            
檢測區域一般包括一個或多個對照區，這樣對于驗證樣品流動是否是預期的很有用處。每一個對照區都包括一個空間上不同的區域，在此區域里常有一個特異性結合配對的固定元件，該元件可和標記的對照試劑反應。在某個實施方式中，程序上的對照區包括一個待測分析物的可靠樣品，或樣品的一個片斷。在這個實施例中，使用了一種標記試劑，所述的液態樣本攜帶標記試劑到達測試和對照區；沒有被結合到被分析物上的標記試劑就將結合到定位在對照區的待測被分析物的可靠樣品上。在另一個實施例中，對照線含有抗體，該抗體對標記試劑是特異性的或者為了固定的標記試劑而提供的。在操作中，標記試劑被限制在每一個單個的或多個的對照區，即使在待測樣本中任何一個或者所有感興趣的分析物都不存在。
            
 
            
在某些實施方式中，固體支持物包括一定式樣的區域，所述區域包括抗原/抗體結合粘合物質領域，此領域可被設計成任何想要的形狀(例如，方形，橢圓形，圓形，垂線或水平線)。例如，抗原結合粘合物質(matrix)領域被處理到一個固體支持纖維素試紙上，所述纖維素試紙可由塑料或聚酯薄膜材料制成。通過使用本發明，通過整合每個在單個測試帶或單個固相支持物纖維素試紙的不同位置上含有不同特異性抗原的多個方形粘合物質，有可能在一個單獨的測試中測定到多個抗H5 AIV抗體亞型。
            
 
            
在各種實施方式中，含有本發明的抗體并應用在免疫分析中的裝置可被包括在一個試劑盒中。為了特殊的形式的免疫分析應用，該試劑盒包括了必要的反應試劑。該試劑盒包括一個纖維素試紙和單獨的隨其應用的試劑，其上固定了分析流感多種亞型所需的抗體的橫向流動設備，或者任何帶有必要試劑的常規裝置。例如，通過一個纖維素試紙頻繁的浸沾一系列的在試劑盒中提供的試劑的過程，在樣本中有或沒有特定的抗-亞型流感病毒(例如，H5 AIV抗體)或者流感病毒抗原(例如，H5抗原)可以被簡單快速地確定。該試劑盒適合專家或業內人員使用。利用本發明的試劑盒可以快速進行從體液獲得的流感病毒(例如，AIV)的血清診斷，體液可以是血液、尿液、唾液、精液、糞便，唾液、膽汁、腦脊液，鼻涕、泌尿生殖器的液體、鼻呼氣，脊髓液，等等。
            
 
            
在另一實施方式中，固相的支持纖維素試紙或者橫向流動裝置安置在一個測試試管或者類似的容器中，該測試管或者類似容器添加了被懷疑感染了流感病毒(例如，AIV)的病人或者動物樣本。樣本和結合在纖維素試紙中的抗原/抗體反應。然后取出纖維素試紙并輕輕地清洗。固相支持纖維素試紙被從清洗液中取出并被放入另一個試管中，該試管含有高度稀釋的，經親和分離純化的免疫球蛋白，該免疫球蛋白對從其中獲得樣本的物種是特異性的，并可和堿性磷酸酶或者其他適宜的酶結合。接著纖維素試紙從第二抗體溶液取出并放入一個帶有清洗液的容器中。一旦纖維素試紙從清洗液中取出就被放入帶有顯色劑或者其他合適的底物溶液的最終的試管中。陽性反應可以通過簡單的觀測對照標準(上面的線)和陽性線(下面的線)的比較而評定出來。如果陽性線顏色比標準線深，那么檢測結果就是陽性。共價連接到經親和純化的免疫球蛋白的酶和底物反應，所述底物在酶-底物反應的結束時產生一個有色反應產物。通過這種方式連接的密切相關的純化的免疫球蛋白就可以很容易的檢測出來，該檢測顯示在樣品中存在對流感病毒(如，H5抗體)特異性的抗體。這個技術整合了已知的ELISA技術，在此處也有揭露。
            
 
            
應到理解的是，選擇合適的酶和底物和合適的反應條件的技術已為本領域的技術人員所熟知。這些酶在和免疫球蛋白結合后要仍然有活性。每個酶-底物配對的化學反應都要得到一個有顏色的產物。另外，有多種可選擇的配對方式，其中酶和底物都可以和經親和純化的免疫球蛋白結合，但是只有在純化的免疫球蛋白已經連接到樣本抗體之后，酶和底物的反應才能產生有顏色的反應產物。
            
 
            
當然，通過使用不同的抗體/抗原，樣本可以很容易的篩選出一組不同的病毒和不同的亞型。本領域的技術人員應當明白，通過這里描述的免疫測定法需分析不同的組。參見CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY(Coligan，John E.et.al.，eds.1999)。
            
 
            
陣列   
            
本發明的抗體可以很容易的被應用在設備中，用該設備檢測分析物的方法是一種快速檢測方法，該方法包括檢測樣本中的一個或多個流感病毒蛋白(例如，H5)或者一個或多個的抗-流感病毒抗體。這種方法包括抗體以含其他抗體的陣列的形式展示的實施方式，所述其他抗體其以多種不同的病毒如其他的流感病毒亞型(如，AIV)為靶標。在其他的實施方式中，抗體可以以相同的抗原為目標或者特異性的和一個既定的多肽上的不同的抗原決定基結合。
            
 
            
在本發明進一步的實施方式中，抗體的陣列包括底物，大量的離散排列的小片段(patch)，在底物表面部分的已知區域上，其中(i)每一個片段包括固定在底物上的抗體，其中所述既定片段中抗體可結合特定的病毒表達產物、產物的片斷，或者宿主蛋白，例如抗病毒抗體，和(ii)陣列包括很多不同的抗體，每一個抗體都可以結合不同的病毒表達產物、病毒產物片斷，或者宿主蛋白，如抗病毒抗體。
            
 
            
優選地，抗體共價地固定在陣列的片斷上，可以直接固定也可以間接固定。在多數情況下，陣列至少包括10個片斷。在一個優選的實施例中，陣列至少包括50個片段。在一個特別優選實施例中，陣列包括至少100個片段。在一個選擇性的優選實施例中，抗體陣列可以包括超過103，104，或者105個片段。
            
 
            
被每一個片段覆蓋的底物表面區域優選不超過0.25mm2。優選地，每個片段覆蓋的底物表面區域在大約1μm2到1000μm2。在一個特別優選實施例中，每個片段覆蓋的底物表面區域在大約1μm2到2500μm2。在一個可選擇的實施例中，在陣列上的一個片段可覆蓋底物表面的面積有2500nm2這么小，雖然如此小的片段在陣列的應用當中一般是沒有必要的。
            
 
            
陣列中的片段可以是任何幾何形狀。例如，片段可以是矩形的，圓形的。陣列中的片段也可以是不規則的形狀。片段也可以隨意的從下層底物中間布局(median plan)開始增加。
            
 
            
隔開陣列上的片段的距離可以是不同的。優選地，陣列上的片段間相鄰之間的距離大約1μm到500μm。典型地，如果片段的直徑大于10μm，隔開陣列上片段的距離約與片段的直徑或側面長度成比例。如果片段比較小，這時隔開片段的距離一般都比片段本身的直徑要大。
            
 
            
在陣列的一特別實施方式中，陣列的所有片段都被包含在底物表面上大約1cm2或更小的區域。因此在一個優選的陣列的實施例中，陣列在底物表面上總面積大約1cm2或更小的區域內包括了100個或更多片段。可選擇地，一個特別優選的陣列在底物表面上總面積大約1cm2或更小的區域內包括了103個或更多的片段。優選的陣列在底物表面上總面積大約1cm2或更小的區域內，甚至可以隨意包括104或者105或者更多的片段。在本發明的其他實施例中，所有的陣列的片段都包含在底物的表面上面積大約為1mm2或更小的區域內。
            
 
            
代表性地，在陣列的一個片段上只有一個抗體。如果在一個片段上不止一個的抗體，那么在那個片段上的所有的抗體必須共用一個普通的結合伙伴。例如，一個片段可包括很多種流感病毒蛋白的抗體(雖然，抗體潛在地可以結合既定流感病毒上的不同抗原決定基)。在優選實施例中，所述流感病毒蛋白/抗原是H5且流感病毒是AIV。
            
 
            
本發明中的陣列可以含有日呢以數量的不同的抗體。典型地，所述陣列包括至少10種不同的抗體。優選地，所述陣列包括至少50種不同抗體。更優選地，所述陣列包括至少100種抗體。可選擇的優選陣列包括超過103種不同抗體或者超過104種不同抗體。所述陣列甚至可隨意包括超過105種不同抗體。
            
 
            
在陣列的一個實施例中，陣列的每一個片段包括一種不同的抗體。例如，一個陣列包括大約100個片段可以包括大約100個不同的抗體。類似地，一個含約10000個片段的陣列溘包括大約10000種不同抗體。然而，在一個可選擇的實施例中，每一個不同的抗體被固定在陣列的多個片段上。例如，每一個不同的抗體可以隨意的在2-6個不同的片段中出現。因此，本發明的一個陣列，可包括大約3000抗體片段，但僅包括大約1000種不同的抗體，因為每一個不同的抗體在3個不同的片段中出現。
            
 
            
典型地，可被陣列上的大量不同抗體結合的不同蛋白的數量至少有10個。然而，優選地，在陣列上的大量不同的抗體可以用來結合大量數量的不同蛋白，例如，至少大約50或者至少大約100個。在進一步優選的實施例中，在陣列上大量不同抗體可以結合至少大約103個蛋白。
            
 
            
利用本實施例中的抗體陣列可隨意包含在流動反應槽中以每25mm2表面積1-10uL液體體積的形式放置二維陣列。覆蓋在流動反應槽中的陣列上的罩殼可以是透明或半透明的。在一個實時方式中，所述罩殼可包括耐熱玻璃或石英玻璃。在其他的實施方式中，所述罩殼可能是檢測系統的一部分，以監測固定在陣列上的抗體與溶液，如細胞抽提液中蛋白質之間的反應。所述流動反應槽應該保持含有適當的液體溶液以保護抗體。鹽度、溫度和其他條件優選與正常生理條件保持相似。在流體溶液中的樣品可能滲入上述流動反應槽中，它們肯定和固定的抗體反應。需要提供足夠的時間以允許抗體及其結合伙伴發生結合。這所需的時間取決于抗體對其結合伙伴的親和力。流體輸送到陣列中不需要專門的微流泵、閥門或混合技術。
            
 
            
檢測方法   
            
使用本發明的抗體適用的任何裝置中，可獲得很多類的檢測成分來檢測結合伙伴的存在。檢測可以是數量上的也可以是質量上的。本發明的陣列可和光學檢測方法如可視光或紫外光的吸收、化學發光和熒光(包括有效期、偏振、熒光關聯能譜法(FCS)、熒光共振能量轉移法(FRET))合用。而且，其他檢測模式，如基于光波的，參見PCT公開文本(WO 96/26432和美國專利第5,677,196號)，基于表面胞質團共振分析技術(surfaceplasmon resonance)的，基于表面電荷傳感器的，基于表面作用力傳感器的都可以和本發明的許多實施方式兼容。可選擇地，基于Brewster角度顯微鏡方法(Brewster Anglemicroscopy)(BAM)的(Schaaf et al.，Langmuir，3:1131-1135(1987))和橢圓光度法(U.S.Pat.Nos.5,141,311 and 5,116,121；Kim，Macromolecules，22:2682-2685(1984))的科技也可被應用。水晶微平衡作用(microbalances)和解吸附過程(參見例如美國專利第5,719,060號)也提供了其他適合本發明陣列某些實施方式的檢測方法。參見美國專利第5,313,264號可見一種光學生物傳感器系統可與本發明的一些矩陣相兼容，也可與多種未標記的檢測方法如表面胞質團共振分析技術、內反射熒光顯微鏡(TIRF)、Brewster角度顯微鏡方法、光波發光模式光譜法(OWLS)相兼容。
            
 
            
在某些實施方式中，所述整合了本發明抗體的設備可被整合到一個系統中，所述系統包括閱讀器(reader)，特別是設置在電腦中的閱讀器，如基于反射和/或熒光的閱讀器，以及包括一個使用數據還原(data reduction)和曲線擬合算法的數據處理軟件，優選地與被訓練的神經網絡(trained neural network)連用以準確地確定在生物樣品中分析物的存在與否及其濃度。如這里所使用的閱讀器是指一種檢測和/或定量數據的工具，如在包括在使用本發明抗體的測試設備中測試帶(test strips)上。數據應是裸眼可視的，但不需要如此。所述方法包括在病人樣品上執行免疫測定的步驟，使用基于反射和/或熒光的閱讀器讀取數據的步驟，使用利用數據還原的數據處理軟件來處理所得數據。優選的軟件包括曲線擬合算法，可任意地與被訓練的神經網絡連用，以確定在待測樣品中被分析物的存在與否及其濃度。從閱讀器中獲得的數據可以被進一步地通過醫學診斷系統處理輸出數據以提供風險評估或醫學條件的診斷。在可擇實施方式中，所述輸出數據可被用于輸入到后續的結論支持系統，如神經網絡，它可被訓練以評估這些數據。
            
 
            
在多各種實施方式中，所述閱讀器可以是反射閱讀器，發射閱讀器，熒光閱讀器，化學生物發光閱讀器，磁力閱讀器或電流測定閱讀器(或兩個或更多的結合)，這取決于要從設備中檢測的信號。而且，某些檢測方法一般用于傳統的免疫測定法，該法需要使用標記物，這些檢測方法可應用到本發明的陣列中。這些技術包括非競爭式免疫測定法，競爭式免疫測定法，雙標記物法，比值免疫測定法。這些特定的技術主要適用在當帶有不同特異性的不同抗體的數目很小(約小于100)時和抗體陣列一起使用的時候。在所述競爭式方法中，結合位點的占據是間接確定的。在這種方法中，陣列的抗體被暴露在標記的顯影試劑中，所述顯影試劑通常是帶有標記的分析物或其類似物。所述顯影試劑與分析物競爭結合在抗體上的位點。顯影試劑結合到單個片斷的抗體上可形成在不同片斷上抗體的少量占據。
            
 
            
在非競爭式方法中，結合位點的占據是直接確定的。在這種方法中，所述列陣的片斷暴露于標記的顯影液中，所述顯影液可以結合到被結合的分析物上或在蛋白固定試劑中的以被占據的結合位點上。例如，所述顯影液可以是與被占據位點直接對應的被標記的抗體(例如，“夾心式分析”)。可選擇地，雙標記法，當所述抗體被一種標記物標記，顯影液背另一個標記物標記時采用比值法(Ekins，et al.，Clinica Chimica Acta.，194:91-114，1990)。在前述的技術中可以使用很多不同的標記方法，包括放射性同位素法、酶法、化學發光法和熒光法。在某些實施方式中，優選熒光檢測法。檢測的方法包括但不限于，顏色的改變、光吸收或光傳輸的改變，PH的改變，傳導性的改變，熒光性的改變，物理相的變化或類似方法。
            
 
            
待測樣品應提供檢測系統的可檢測成分或者這種成分可被加入。所述成分的差異很大，這取決于檢測系統的性質。其中一種檢測方法包括使用顆粒，顆粒被用于提供散光或改變流動速度。所述顆粒可以是，但不限于，細胞、不能融合于液體系統的多聚顆粒、橡膠顆粒、陶瓷顆粒、核酸顆粒、粘合顆粒或其類似物。顆粒的選擇取決于檢測方法、在流體變化時分散的分布情況和穩定性，活躍性，參與度等諸如此類。在固定位點分析物與特異性結合元件結合可通過檢測設備中待測樣品的壓力來隨意檢測。例如，與待測樣品連接的壓力檢測器進入或退出通道時將能檢測到壓力降低，所述壓力降低是由于分析物的結合，它會導致通道內流速放緩。
            
 
            
例如，為確定已存在的可檢測的標記物(例如，抗體結合)的量，及抗原存在的量，可以使用Hazelgrove等人的方法和儀器(參見Anal.Biochem 150:449-456，1985)。這種方法是基于與電腦連接的電視攝影機。所述標記通過電視攝影機成像而顯示在一個發光盒子上，且被一種數字化平板(Techmar公司)數字化。數字化后，電腦會讀取出每個標記的位置、寬度、高度和相對面積。光密度測量也用于測定蛋白質的絕對濃度。
            
 
            
在另一實施方式中，將包括Dot-ELISA測試的裝置用于檢測直接來自任何樣品的目標蛋白。因而，本發明的抗體可以用于包括下列步驟的方法中   (a)提供一固相支持物，以便進行單抗的測定；   (b)將懷疑帶有流感病毒的樣品施加到該固相支持物上；   (c)將含有有機酸如檸檬酸或乳酸的溶液施加到固相支持物上；   (d)將含有溶粘液劑(mucolytic agent)和去污劑的溶液施加到該固相支持物上；   (e)將該固相支持物與初級單抗(primary Mab)、嵌合單抗、其變體或片段接觸足夠的時間，使得初級單抗、嵌合單抗、其變體或片段和H5 AIV蛋白結合在一起，形成結合抗原的初級單抗；   (f)將上述與酶標記的抗-單抗綴合物(conjugate)接觸足夠的時間，使得該結合抗原的初級單抗便于結合到該綴合物上；以及   (g)將顯色試劑施加到該固相支持物上，其中，該顯色試劑被酶催化而形成帶色的標志，從而使得能夠目視檢測樣品中是否存在H5 AIV蛋白。
            
 美國專利申請2006/0246429中公開了一種Dot-ELISA方法，此處將其整體作為對比文獻。
            
 
            
在某些實施方式中，本發明的裝置或試劑盒可以用于護理(care setting)領域，其中，可以利用顯色檢測系統如采用堿性磷酸酶的系統。例如，分離出若干小瓶，其含有在緩沖液、NBT或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)中的鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物，并將其設計成可依次達到所期望的色彩，從而使其可作為試劑盒的組分。利用顯色檢測系統，其結果可以用肉眼觀察而不需要任何設備的幫助。在一實施方式中，檢測裝置可以利用堿性磷酸酶定量確定存在的AIV量。當與光密度計一起使用時，這種包含堿性磷酸酶的裝置可以給出準確的定量結果。
            
 
            
在一實施方式中，檢測H5 AIV蛋白或抗H5亞型AIV抗體的試劑盒可以包括檢測標記物如結合在其上的鏈霉抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物；含NBT或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯(BCIP)的試劑；以及參比標準。
            
 
            
在本申請描述的任一實施方式中，測試樣品可能是來自但不限于生理來源。可以用于本發明裝置的測試樣品包括懷疑帶有抗原或抗體的樣品，這些樣品可以是來自非人類的動物體或者人體；可以用于本發明裝置的測試樣品包括但不限于生理體液如血液、血清、血漿、唾液、眼睛分泌物、腦脊液、膿、滲出液、乳汁、汗液、眼淚、耳流出物、痰、淋巴液、尿液、糞便、口鼻分泌物；組織如肺、脾和腎；雞胚培養中的全病毒或裂解病毒的液；以及其它懷疑含有流感病毒蛋白或抗流感病毒抗體的樣品，只有其是可溶的或可懸浮于適當的流體中。測試樣品可以經過預先處理，如萃取、添加、分離、稀釋、濃縮、過濾、蒸餾、透析等等。除了生理液之外，也可以使用其它的液體測試樣品，而且感興趣的成分既可以是液體，也可以是固體，只要該固體能被溶解或可以懸浮于一液體介質中即可。在一實施方式中，樣品取自鼻腔。本發明的裝置通常帶有可以附著一種或多種抗原或抗體的表面。
            
 
            
治療方法和藥物組合物   
            
本發明提供了一種預防和治療禽流感病毒相關病毒感染患者的方法，包括對患者干預一定量的包含了一種或多種本發明所述單抗的有藥物活性的藥物成分。本發明還提供了一種含有本發明所述的一種或多種單抗的藥物成分或在此基礎上得到的鹽類藥物。
            
 
            
本發明所述藥物成分的干預方式可以是傳統的干預途徑，包括口服、口腔、舌下、眼球、局部、腸胃外、直腸、葉鞘內、內胞漿網槽內、腹股溝、膀胱內、局部(如，粉劑、藥膏或滴劑)，或鼻腔途徑，但不僅局限于此。
            
 
            
適合腸胃外途徑注射的藥物成分可能含有符合藥物制備要求的無菌水或非水溶液、氣霧劑、懸浮液或乳劑，可在臨用時重懸成可注射的溶液或氣霧劑的無菌粉劑。如適合的水性和非水性載體，工具和各種稀釋液如水、乙醇、多羥基化合物(如丙烯乙二醇、聚乙烯二醇、丙三醇及其類似物)，合適的混合物，菜油(如橄欖油)，和可用于注射的有機脂，如乙烷油酸。如使用卵磷脂衣殼維持藥物的合適流動性。如使用氣霧劑、表面活性劑以維持合適的顆粒尺寸。
            
 
            
本發明所述的藥物組合物還可含有一些起保護性、保濕、乳化和氣霧化的佐劑，也可以含有預防微生物污染的速溶成分，如各種抗細菌試劑、抗真菌試劑，如parabens，chlorobutanol，苯酚，山梨酸及類似物。也可以包括維持滲透壓的試劑，如糖、NaCI及其類似物。可使用延長吸附的試劑來延長注射用藥物成分吸附時間，如單硬脂酸鹽和凝膠等。
            
 
            
口服固相劑型包括膠囊、片劑、粉劑、顆粒劑等。這些固相劑型中的活性成分至少混有一種傳統的惰性藥物賦形劑(或載體)如檸檬酸鈉、磷酸鈣，或(a)填充劑或添加劑如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(b)粘合劑，如羧甲基纖維素、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯樹膠；(C)濕潤劑，如甘油；(d)碎裂劑，如瓊脂，碳酸鈣，馬鈴薯粉或木薯粉；(e)緩凝劑，如石蠟；(f)促吸收劑，如四氨基混合物；(g)保濕劑，如十六烷基醇和單硬脂酸甘油酯；(h)吸附劑，如高嶺土和斑脫土；(i)潤滑劑，如滑石，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，硫酸十二烷醇鈉，或其上述物質的混合物。在片劑和膠囊劑型中，可能還含有緩沖劑。
            
 
            
固相劑型可以通過做成改良釋放或脈沖釋放劑型，是在上述提到的各種直接釋放賦形劑中添加一些能改變藥物釋放速率的賦形劑而形成，可以包含在劑型中也可以做成外衣的形式。速率釋放改造劑包括羧丙基甲基纖維素，甲基纖維素，碳甲基纖維素鈉，纖維素乙烷，醋酸纖維素，聚乙烯氧化物，黃原膠糖，異丙烯酸氨共聚物，氫化調味油，巴西棕櫚蠟，石蠟，鄰苯二酸醋酸纖維素，鄰苯二甲酸羧丙基甲基纖維素，甲基丙烯酸共聚物或上述物質的混合物。改良釋放和脈沖釋放劑型可能含有一種或一組具有改良釋放速率的賦形劑。
            
 
            
本發明所述藥物成分還可由快速的霧化劑或消溶劑(FDDFs)組成，包含如下成分天冬氨酰苯丙氨酸甲酯，磺胺鉀，檸檬酸，croscarmellose sodium，crospovidone，抗壞血酸，乙烷基丙烯酸鹽，乙烷基纖維素，明膠，氫氧基丙基甲基纖維素，硬脂酸鎂，甘露醇，甲基乙丁烯酸鹽，調味薄荷，聚乙二醇，氣化硅膠，二氧化硅，乙醇酸淀粉鈉，硬脂酸延胡索酸鈉，山梨醇，木糖醇。這里用于描述FDDFs的“霧化和消溶”一詞，依賴于所用藥物的溶解性，如藥物是不可溶的，可制成快速的霧化劑型，如藥物是可溶的，則可制成快速的溶劑型。
            
 
            
類似形式的固相成分也使用諸如乳糖或牛奶糖或其它高分子量的聚乙二醇及類似的賦形劑制成軟明膠或硬明膠的填充劑型。
            
 
            
諸如片劑、糖衣劑、膠囊劑和顆粒劑等之類的固體劑型可以通過諸如腸衣或其它本領域普通人員均知曉的外包衣殼的方式制成。也可以是含有乳濁劑、也可以是含有能起緩慢、延遲、控制活性藥物釋放的類似的成分。也可以使用多聚物和石蠟等成分進行包埋。如果合適，也可用上述一種或多種賦形劑把活性成分制成微囊的形式的劑型。
            
 
            
用于口服的液體劑型，包括符合藥物要求的乳狀劑、溶液、懸浮液、糖漿和西也劑等。除了活性成分，液體劑型也可含有本領域常用的一些惰性溶液，如水或其它溶劑，可溶性試劑和乳化劑，如乙烷基醇，異丙基醇，乙烷基碳酸鹽，苯基安息香酸鹽，丙稀乙二醇，1，3-丁烯乙二醇，油，特別是，棉籽油，落花生油，玉米油，橄欖油，調味油和芝麻油，甘油，氫糠基醇，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及上述物質的混合物或類似的物質。
            
 
            
除了這些惰性稀釋液，藥物成分也可包括保濕劑、乳化劑、懸浮劑、糖化劑、調味劑和香味劑等佐劑。另外，藥物成分還可包括乙氧基化均聚乙醇，聚氧乙烯烷基山梨醇和山梨聚糖脂，微晶纖維素，間氫氧化鋁，膨潤土，瓊脂聚合物和黃芪膠，或這些物質的混合物之類的懸浮劑。
            
 
            
本發明所述藥物成分也制成適合獸用治療的混合物，或符合獸用的鹽類，或符合獸用的溶劑或初成藥，并根據普通獸醫和獸醫從業者的要求制成一種最適合某種特定動物的給藥劑量和途徑藥物的合適劑型。
            
 
            
本發明所述一個或多個單抗可以結合其它抗病毒試劑用于預防和或治療H5禽流感病毒感染相關疾病。單抗可以和這些抗病毒試劑同時、分開或連續給藥。其它抗病毒試劑包括利巴韋林，金剛烷，羧基脲，IL-2，IL-12和五羧鏈胞酸，但不僅限于這些。
            
 
            
多肽篩選方法和抗體識別的多肽及疫苗   
            
本發明提供了一種篩選本發明所述單抗識別的模擬表位多肽的檢測方法。而且，本發明也提供了本發明所述單抗識別的表位模擬多肽。一方面，本發明公布的短肽含有氨基酸序列SEQ ID Nos64-68、70-73、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94和96。這些多肽能夠結合本發明所述單抗。因此，這些多肽擁有和H5血凝素相同的抗原特異性。這些多肽也可用于制備H5亞型禽流感疫苗，也可以用于診斷抗H5血凝素抗體的存在。
            
 
            
另一方面，本發明所述的篩選方法包括如下步驟(i)在特定條件下培養一個適合多肽表達的多肽展示文庫；(ii)把培養溶液和本發明的單抗混合；(iii)篩選特異性結合上述單抗的噬菌體克隆。用于篩選的單克隆抗體不僅限于單抗8H5，3C8，10F7，4D1，2F2和/或3G4。本申請實施例11-13中詳細描述了一種利用噬菌體展示多肽文庫成功篩選結合本發明所述單抗的短肽檢測方法。
            
 實施例   
            
下面結合具體實施例與附圖，對本發明進一步加以描述，但這些描述并不構成對本發明的限制。
            
 
            
實施例1抗H5亞型禽流感病毒HA基因單克隆抗體的制備   
            
抗原的制備   
            
以病毒株Ck/HK/Yu22/02(H5N1)(簡稱Yu22)，接種9天齡受精雞胚，30℃孵育2天后，收集雞胚液，得到擴增后的Yu22病毒。收集活病毒，在4℃下以0.03％福馬林福爾馬林滅活，滅活病毒經HA檢測，確定滅活病毒液的滴度(注HA滴度測定和HI檢測的具體方法參見WHO操作指南，我們選擇HA＝1024，該病毒株由香港大學微生物系提供)。
            
 
            
小白鼠   
            
6周齡雌性Balb/c鼠購自廈門大學抗癌中心，并在該中心飼養實驗。
            
 
            
雜交瘤的制備   
            
我們使用標準的體內免疫方式和PEG融合方法獲得單克隆抗體，詳細方法參見Ed Harlow et al.，“Antibodies A Laboratory Manual”，Cold Spring Harbor Laboratory 1988.簡要過程如下   
            
小鼠免疫將上述預處理的病毒液與福氏完全佐劑(CFA)等體積混合乳化，經四肢肌肉多點注射，每只每次注射300ul。首次免疫后第15天和第29天，分別用同樣劑量的病毒液加弗氏不完全佐劑(IFA)進行加強免疫。第二加強后采血檢測HI的抑制效價，當效價達到1640后，取小鼠脾臟做融合。融合前72小時再次加強免疫，經尾靜脈注射病毒液1次，50ul/只。制備10塊融合板。
            
 
            
融合取血清HI滴度最高的小鼠脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞相融合，先把脾臟研磨得到脾細胞懸液，然后與細胞數低十倍的處于對數生長期的SP2/0小鼠骨髓瘤細胞混合，經PEG1500作用1分鐘將兩種細胞融合一起，然后把融合細胞液100ml分裝到10塊96孔板中培養。融合培養基為含HAT和20％FBS的RPMI1640完全篩選培養基。抗原特異性克隆通過血凝抑制(HI)實驗篩選，經3次克隆化后，得到穩定的單克隆抗體細胞株。
            
 
            
雜交瘤的篩選融合后細胞在96孔細胞板上培養10天后，吸取細胞上清做血凝抑制(HI)檢測，陽性孔繼續克隆化，直至細胞株所分泌的抗體能夠穩定抑制Yu22株病毒與雞血發生凝集為止。
            
 
            
篩選結果獲得六株單克隆抗體2F2、3G4、3C8、4D1、8H5、10F7。
            
 
            
雜交瘤的培養穩定的雜交瘤單克隆抗體細胞株先在二氧化碳培養箱中擴增培養，經96孔轉移至24孔，再轉移至50ml細胞瓶經擴增培養。然后收集細胞瓶內的細胞注射到小鼠腹腔內，7—10天后從小鼠腹腔中吸取腹水。
            
 
            
單克隆抗體的純化   
            
腹水先用50％的硫銨沉淀處理，然后對PBS，pH7.2透析，之后用DEAE柱在HPLC下純化，得到純化后的單克隆抗體，經SDS-PAGE鑒定純化后的單克隆抗體純度。
            
 
            
單克隆抗體的血凝抑制實驗活性驗證   
            
選用34株來源于越南、印尼、馬來西亞、泰國、香港、中國和歐洲等地的屬于不同變異亞系的(Chen et al.，PNAS，103:2845，2006)H5N1病毒和14株非H5病毒(H1～H13，雞NDV)，利用血凝抑制試驗方法(HI)鑒定所述單抗與病毒的反應性，結果如表1和2，可見5株單抗均具有很好的特異性，與非H5病毒株均無反應；而對H5病毒株的反應，不同單抗株對不同病毒株的反應性存在差異，除了3G4反應譜最小外，其余的四株單抗和病毒的反應譜基本都接近或達到100％。
            
 
            
表1 單抗對H5和非H5病毒的血凝抑制試驗陽性反應比     
            
      
            
表2 單抗對34株H5型病毒的血凝抑制滴度     
            
      注<，滴度小于100。
            
 
            
單抗對病毒的中和實驗   
            
利用微孔中和實驗檢測所述單抗對H5N1病毒的中和活性(Hulse-Post et al.PNAS，102:10682-7(，2005))，結果見表3，可見單抗8H5對所有H5N1病毒株均顯示出很好的中和活性。
            
 
            
表3 單抗對H5N1病毒的中和實驗滴度     
            
        
            
      注/，無數據；<，滴度小于100   
            
實施例2H5亞型流感病毒HA抗原檢測試劑盒(酶聯免疫法，ELISA)的組裝   
            
本試劑盒使用雙抗體夾心法檢測標本中的H5亞型流感病毒的HA抗原。首先在試劑盒的聚乙烯微孔板條上預包被抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體，當裂解后的H5型流感病毒HA抗原加到微孔后，預包被的單克隆抗體能將其捕獲，隨后加入的酶標單克隆抗體也能與之結合，而后通過酶催化底物顯色程度判斷結果。當標本中不含流感病毒抗原或不是H5型流感病毒時，底物不會顯色。可檢測的標本包括排泄物、口鼻腔分泌物、雞胚培養的完整病毒或裂解病毒等。
            
 
            
酶標板的制備   
            
在試劑盒的聚乙烯微孔板條上預包被抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體隆抗體，單克隆抗體包被使用10mM磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4)，在37℃下包被過夜；然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween 20)洗滌一次，扣干后再加入封閉液(10mM PBS+2％明膠)，37℃封閉2小時，再扣干并真空抽干包裝成成品試劑盒酶標板(8×12孔)。
            
 
            
試劑盒其它成分的配置   
            
病毒裂解液組成   裂解液A(LB-A)6％CHAPS+2％Tween-20+1％Tween-80；   裂解液B(LB-B)100mM PMSF，使用異丙醇溶解，工作終濃度為2mM；   裂解液C(LB-C)10mM PBS，pH7.4。
            
 
            
酶標試劑以HRP標記抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體隆抗體，得到稀釋度合適的酶標試劑   
            
陽性對照使用合適滴度的H5N1—Yu22株滅活病毒作為陽性對照   
            
陰性對照以裂解液A為陰性對照。
            
 
            
顯色劑A液13.4g/L Na2HPO4.12H2O+4.2g/L檸檬酸.H2O+0.3g/L過氧化氫脲；   顯色劑B液0.2mM/L四甲基聯苯胺3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺。
            
 
            
終止液2M濃硫酸   
            
濃縮洗滌液20xPBST   
            
封板膜2張   
            
自封袋1個   
            
說明書1份   
            
檢測過程   
            
配液將50ml濃縮液(20×)用蒸餾水或去離子水稀釋至1000ml備用   
            
編號將樣品對應微孔板按序編號，每板應設陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步相同)。
            
 
            
樣品處理及加樣   
            
當樣品為液體時(包括原始標本、雞胚培養標本、細胞培養標本)按每孔需要100ul LB-A+4ul LB-B預配適量的LB-A與LB-B的混合液并振蕩混合。然后在微孔上每孔先加入100ul待測標本，再加入100ul配好的上述裂解液進行反應。
            
 
            
當樣品為干拭子原始標本時取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一個標本管中，振蕩溶解標本，室溫靜置30分鐘后，重新振懸后，6000rpm離心5分鐘，吸取上清檢測，每孔加100ul進行反應。
            
 
            
當樣品為干糞便原始標本時取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一個標本管中，將干糞便配置成10％(w/v)的糞懸液標本，振蕩溶解標本，室溫靜置30分鐘后，重新振懸，6000rpm離心5分鐘，吸取上清檢測，每孔加100ul進行反應。
            
 
            
每次檢測均需要設置陰陽性對照孔，每孔加100ul對照液。
            
 
            
孵育用封口膜封板后置微量振蕩器上中等速度室溫(25～28℃)震蕩60分鐘。
            
 
            
洗滌小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干。
            
 
            
加酶分別在相應孔中加入酶標試劑100ul。
            
 
            
孵育用封口膜封板后，置37度溫育30分鐘。
            
 
            
重復步驟6   
            
顯色每孔加入顯色劑A、B液各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色30分鐘。
            
 
            
測定每孔加終止液1滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，用酶標儀單波長450nm(需設空白對照孔)或雙波長450nm/630nm測定各孔OD值。
            
 
            
結果判定   
            
a)陰性對照的正常范圍正常情況下，陰性對照孔≤0.1(陰性對照孔OD值若大于0.1應舍棄，如果所有陰性對照孔OD值都大于0.1，應重復實驗。若陰性對照孔小于0.03，則按0.03計算)。
            
 
            
b)陽性對照的正常范圍正常情況下，陽性對照孔OD值≥0.50。
            
 
            
c)臨界值(CUTOFF)計算陰性對照孔OD均值+0.15。
            
 
            
d)陽性判定樣品OD值≥臨界值(CUTOFF)者為禽流感病毒H5型HA抗原反應陽性。
            
 
            
e)陰性判定樣品OD值<臨界值(CUTOFF)者為禽流感病毒H5型HA抗原反應陰性。
            
 
            
臨床標本測定實驗   
            
利用本試劑盒檢測各種H5和非H5病毒標本，結果見表4，可以看出本試劑盒具有很好的檢測靈敏度和特異性。
            
 
            
表4 利用H5抗原ELISA檢測試劑盒檢測H5和非H5病毒標本     
            
      注-，不確定；a，檢出陽性數量；b，檢測樣本數量；HA滴度是計算流感病毒滴度的標準單位。
            
 
            
實施例3H5亞型流感病毒anti-HA抗體檢測試劑盒(酶聯免疫法，ELISA)的組裝   
            
本試劑盒采用競爭法檢測血清標本中的H5型流感病毒HA抗原特異性抗體。首先在試劑盒中微孔板條上一次包被抗H5亞型流感病毒HA的單克隆抗體，二次包被H5亞型流感病毒HA基因的重組表達抗原。在加入血清標本和酶標單克隆抗體后，標本中的特異性抗體與酶標單克隆抗體競爭結合酶標板上的抗原，如果加入的血清標本能明顯抑制酶標單克隆抗體與抗原的結合，則表明標本中含流感病毒H5型HA抗原的特異性抗體。當標本中不含流感病毒抗體或不是H5型流感病毒抗體，不會抑制酶標單克隆抗體與抗原的反應。
            
 
            
酶標板的制備   
            
在試劑盒的聚乙烯微孔板條上一次預包被抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體隆抗體，單克隆抗體包被使用10mM磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4)，在37℃下包被過夜；然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween 20)洗滌一次，扣干后再加入封閉液(10mMPBS+2％明膠)，37℃封閉2小時。扣干后進行二次包被，使用10mM PBS，pH7.4溶液稀釋重組表達抗原后按每孔100ul加入到一次包被處理后的微孔板上，37℃包被2小時，洗滌一次后再37℃封閉2小時，最后扣干并真空抽干包裝成成品試劑盒酶標板(8×12孔)。
            
 
            
試劑盒其它成分的配置   
            
a)酶標試劑以HRP標記抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體，得到稀釋度合適的酶標試劑。
            
 
            
b)陽性對照使用合適濃度的抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體作為陽性對照。
            
 
            
c)陰性對照使用100％小牛血清(NBS)作為陰性對照。
            
 
            
d)顯色劑A液13.4g/L Na2HPO4.12H2O+4.2g/L檸檬酸水溶液+0.3g/L過氧化氫脲   
            
e)顯色劑B液0.2mM/L四甲基聯苯胺3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine(TMB)+20mM/L二甲基甲酰胺   
            
f)終止液2M濃硫酸   
            
g)濃縮洗滌液20×PBST   
            
h)封板膜2張   
            
i)自封袋1個   
            
j)說明書1份   
            
檢測過程   
            
a)配液將50ml濃縮液(20x)用蒸餾水或去離子水稀釋至1000ml備用。
            
 
            
b)編號將樣品對應微孔板按序編號，每板應設陰性對照3孔，陽性對照2孔和空白對照1孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步相同)。
            
 
            
c)加樣分別在相應孔中加入待測樣品或陰性、陽性對照50ul。
            
 
            
d)加酶在相應孔中加入酶標試劑50ul。
            
 
            
e)孵育混勻后用封口膜封板，置37度溫育60分鐘。
            
 
            
f)洗滌小心揭掉封板膜，用洗板機洗滌5遍，最后一次盡量扣干。
            
 
            
g)顯色每孔加入顯色劑A、B液各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。
            
 
            
h)測定每孔加終止液1滴(50ul)，輕輕振蕩混勻，用酶標儀單波長450nm(需設空白對照孔)或雙波長450nm/630nm測定各孔OD值。
            
 
            
結果判定   
            
a)陰性對照的正常范圍正常情況下，陰性對照孔≥0.1。
            
 
            
b)陽性對照的正常范圍正常情況下，陽性對照孔OD值≤0.1。
            
 
            
c)臨界值(Cutoff值)計算Cutoff值＝陰性對照孔OD均值/2。
            
 
            
d)陽性判定樣品OD值<Cutoff值判H5型流感病毒HA抗原特異性抗體陽性。
            
 
            
e)陰性判定樣品OD值≥Cutoff值判H5型流感病毒HA抗原特異性抗體陰性。
            
 
            
臨床標本測定實驗   
            
利用本H5抗體試劑盒檢測人血清和雞血清標本，結果見表5，說明本試劑盒具有很好的靈敏度和特異性。
            
 
            
表5 利用H5抗體ELISA試劑盒測定血清標本     
            
      注-，未確定；a，檢出陽性數量；b，被測樣本總數量.   
            
實施例4H5亞型流感病毒HA抗原檢測試劑盒(金標法)的組裝   
            
本試紙條是采用膠體金免疫層析技術研制的新一代診斷試劑，可檢測的標本包括排泄物、口鼻腔分泌物、雞胚培養的完整病毒或裂解病毒等。本品設計精巧，一次性使用，操作簡便、安全、可靠、無污染，自帶質控對照，不需任何附加試劑，顯示結果明確，反應迅速，整個操作時間僅需30分鐘。
            
 
            
本試紙條分別在硝酸纖維素膜上檢測區包被anti-HA的單克隆抗體，對照區包被羊抗鼠IgG。檢測時樣品中H5型流感病毒與標記膠體金的anti-HA單克隆抗體(Ab--Au)形成復合物(Ag-Ab-Au)，由于層析作用復合物沿膜帶移動，可與包被在檢測區的anti-HA的單克隆抗體形成雙抗體夾心免疫復合物。如為陽性樣品，則可分別在檢測區及對照區各凝集形成一條紅色線；如為陰性樣品，則只在對照區形成一條紅色線。
            
 
            
試劑盒測試條的制備同常規方法。
            
 
            
試劑盒組成測試條、裂解液、說明書。
            
 
            
操作過程   
            
a)樣品處理及加樣   
            
i.樣品為液體時(包括原始標本、雞胚培養標本、細胞培養標本)   
            
按每孔需要100ul LB-A+4ul LB-B預配適量的LB-A與LB-B的混合液并振蕩混合。然后在微孔上每孔先加入100ul待測標本，再加入70ul配好的上述裂解液進行反應。
            
 
            
ii.樣品為干拭子原始標本時   
            
取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一個標本管中，振蕩溶解標本，室溫靜置30分鐘后，重新振懸后，6000rpm離心5分鐘，吸取上清檢測，每孔加70μl進行反應。
            
 
            
iii.樣品為干糞便原始標本時   取1ml LB-A+40ul LB-B+1ml PBS混合后，加入一個標本管中，將干糞便配置成10％(w/v)的糞懸液標本，振蕩溶解標本，室溫靜置30分鐘后，重新振懸，6000rpm離心5分鐘，吸取上清檢測，每孔加70ul進行反應。
            
 
            
b)在加樣處緩慢加樣70ul，平置于室溫。
            
 
            
結果判定30分鐘內觀察結果。
            
 
            
出現兩條紅色線，認定為陽性；只出現質控線，認定為陰性；不出現紅色線，則認定為無效，結果參見圖1。
            
 
            
實施例5H5亞型流感病毒抗·HA抗體檢測試劑盒(金標法)的組裝   
            
本試紙條分別在硝酸纖維素膜上檢測區包被anti-HA的單克隆抗體，對照區包被羊抗鼠IgG。玻璃纖維上凍干有anti-HA單克隆抗體標記膠體金和H5型流感病毒重組HA表達抗原，采用競爭法來檢測待測樣品中的H5型流感病毒anti-HA抗體。如樣品中含anti-H5的抗體則與anti-HA單克隆抗體標記膠體金競爭從而阻斷復合物的形成不能顯色；若為陰性，則形成復合物顯色。
            
 
            
試劑盒測試條的制備同常規方法。
            
 
            
試劑盒組成測試條、說明書。
            
 
            
檢測過程   
            
將密封袋打開，取出所需試紙條，在加樣處緩慢加入血清樣品70ul，平置于室溫，30分鐘內觀察結果，超出30分鐘，結果無效。
            
 
            
結果判定   
            
只出現質控線，認定為陽性；出現兩條紅色線，認定為陰性；不出現紅色線，則認定為無效，參見圖2。
            
 
            
實施例6H5亞型流感病毒HA抗原檢測試劑盒的組裝   
            
本試劑盒在滲慮檢測裝置的硝酸纖維素膜上的樣品檢測區預包被anti-H5(HA)的單克隆抗體和在對照區包被羊抗鼠IgG。加入經裂解的含H5亞型流感病毒HA標本后，預包被的單抗體將其捕獲，形成抗原抗體復合物(Ab-Ag)，隨后加入酶標單抗(Ab-HRP)與抗原抗體復合物結合，最終形成抗體-抗原-酶標抗體復合物(Ab-Ag-Ab-HRP)，而后通過酶催化底物顯色進行結果判定。當標本中不含H5亞型流感病毒時，檢測區不顯色，只在對照區形成一個顯色點。
            
 
            
滲漏檢測裝置的制備   
            
硝酸纖維素膜和吸水濾紙置于一平的底部支持上。一個形狀合適的蓋子蓋在底部支持之上，后而蓋子中部有一個開口。一個形狀合適蓋子中部開口的流量控制單位插入開口。該流量控制單位有二個孔分別為裝載樣品和對照。流量控制單位的底部緊緊地被按在底部支持之上以限制樣品流動使之保持在硝化纖維素膜和濾紙上。抗-H5(HA)單克隆抗體被涂在流量控制單位的測試區，而goat anti-mouse IgG被涂在流量控制單位的對照區。試紙在空氣中風干1小時，然后包裝在真空成為滲漏檢測裝置.   
            
試劑盒組成   
            
a)滲慮檢測裝置   
            
b)樣品處理裝置一個瓶子由過濾器蓋帽擰緊；過濾器蓋帽中部包含過濾器使得溶液可以解過濾通過.   
            
c)酶標試劑以HRP標記抗H5型流感病毒HA基因的單克隆抗體隆抗體，得到稀釋度合適的酶標試劑。
            
 
            
d)裂解液3％NP40+1％Triton X—100+40mM PBS，pH7.4。
            
 
            
e)洗滌液2％Triton X—100+20mM EDTA+0.25％ Tween 20+0.1％ Proclin300+150mM NaCl+5mM PBS，pH7.4。
            
 
            
f)顯色液3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid底物System forMembranes。
            
 
            
g)終止液50mM檸檬酸水溶液   
            
h)說明書   
            
檢測過程   
            
a)樣品處理及加樣   每個樣品處理裝置中加入200μl待測樣品，隨后滴加8滴裂解緩沖液，充分混勻.然后，所有裂解樣品被在樣品處理器中緊壓通過過濾器蓋帽裝入檢測孔。待樣品完全吸收后(約25分鐘)，摘掉流量控制單位。
            
 
            
b)洗滌加入5滴洗滌緩沖液，使之完全吸收；   
            
c)加酶滴加4滴酶標試劑，待酶完全滲慮干凈后反應2分鐘；   
            
d)洗滌分2次洗滌，第一次滴入8滴洗滌液，洗液完全滲慮干凈后再滴入5滴洗滌液，讓洗滌液滲慮干凈；   
            
e)顯色滴加2滴顯色液，待顯色液吸干后2分鐘進行結果判定，超過5分鐘的結果無臨床意義，結果判定示意圖參見圖3。
            
 
            
臨床標本測定實驗利用本H5快速檢測試劑盒測定臨床標本，獲得表6的數據結果，顯示本試劑盒具有很好的靈敏度和特異性。
            
 
            
表6 利用H5抗原免疫滲慮法對臨床病毒標本的測定     
            
      注-，未確定；a，檢出陽性數量；b，受測樣本總數量。
            
 
            
實施例7單克隆抗體輕鏈基因和重鏈基因可變區的分離   
            
半貼壁培養107個雜交瘤細胞，吹管吹起貼壁細胞使懸浮，轉移到新的4ml離心管中，1500rpm離心3分鐘，收集沉淀的細胞，重懸于100ul無菌PBS(pH7.45)中，轉移到一新的1.5ml離心管中。加入800ul Trizol(Roche，Germany)，輕輕顛倒混勻，靜置10分鐘。加入200ul氯仿，劇烈振蕩15s，靜置10分鐘，4℃ 12000rpm離心15分鐘，轉移上層液體至一新的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10分鐘。4℃12000rpm離心10分鐘，棄上清，加入600ul 75％乙醇洗滌，4℃ 12000rpm離心5分鐘，棄上清，沉淀于60℃真空抽干5分鐘。透明的沉淀溶于70ul DEPC H2O中，分裝成兩管。每管加入1ul反轉錄引物，其中一管加入的反轉錄引物為MVJkR(5’-CCg TTT(T/g)AT(T/C)TC CAg CTT ggT(g/C)CC-3’)，用于擴增輕鏈可變區基因，另一管加入的反轉錄引物為MVDJhR(5’-C ggT gAC Cg(T/A)ggT(C/g/T)CC TTg(g/A)CC CCA-3’)，用于擴增重鏈可變區基因。每管再加入1ul dNTP(上海生工)，置72℃水浴10分鐘，立即放到冰浴中置5分鐘，加入10ul 5x反轉錄緩沖液，1ul AMV(10u/ul，Pormega)，1ul Rnasin(40u/ul，Promega)，混勻后于42℃將RNA反轉錄成cDNA。
            
 
            
抗體基因可變區的分離采用聚合酶鏈式反應(PCR)法，使用根據Novagen公司的Ig-Prime kits合成的引物組以及另外設計合成的兩條下游引物MVJkR、MVDJhR(上海博亞公司合成)，MVJkR為輕鏈可變區基因擴增的下游引物，MVDJhR為重鏈可變區基因擴增的下游引物。模板即為以上合成的兩種cDNA。PCR條件為在94℃下5分鐘，在94℃下40秒，在53℃下1分鐘，在72℃下50秒，共35次循環，在72℃下15分鐘。回收目的片段并克隆至pMD 18-T載體，送至上海博亞公司測序，序列經blast比對后確定抗體可變區序列，并推測出相應的氨基酸序列。
            
 
            
依上述方法從6株禽流感單抗雜交瘤細胞株中克隆出其抗體可變區基因，并推測出相應的氨基酸序列。表7所示為所用的上游引物序列，表8所示6株單克隆抗體可變區核甘酸和氨基酸序列編號。互補決定區(CDR)如表9所示。表7 擴增禽流感單抗可變區基因的上游引物序列     
            
        
            
     表8 6株單克隆抗體可變區核甘酸和氨基酸序列編號     
            
      表9 6株單克隆抗體CDR氨基酸序列     
            
        
            
      
            
實施例8 8H5單鏈抗體的表達及活性檢測   
            
將8H5抗體基因的重鏈和輕鏈可變區通過(GGGGS)3短肽連接成單鏈抗體DNA片段。以8H5 HF1/8H5 HR1為引物對擴增出8H5重鏈可變區片段，以8H5 KF1/8H5 KR1為引物對擴增出8H5輕鏈可變區片段，引物序列見表10。分別回收兩個片段，再以這兩個片段互為引物及模板在新的PCR系統中進行重疊延伸，得到少量完整單鏈抗體片段，然后以完整片段為模板，以8H5H F1/8H5 KR1為引物進行大量擴增，回收單鏈抗體片段，以BamH I/Sal I酶切回收到單鏈抗體片段，克隆到相同酶切的pTO-T7原核表達載體中。以ER2566大腸桿菌作為表達菌株，采用常規方法表達，結果表達的蛋白質是以不溶性的包涵體形式存在。以常規方法洗滌純化包涵體，結果單鏈抗體主要溶解于8M尿素中。將溶解于8M尿素中的單鏈抗體蛋白逐步對1×PBS透析復性，12000rpm離心10分鐘去除沉淀，將最終得到的初步純化的單鏈抗體溶液進行活性測定。
            
 
            
表10 單鏈抗體及嵌合抗體克隆用引物     
            
        
            
        
            
      
            
采用競爭ELISA法檢測初步純化出的8H5單鏈抗體的活性。在聚苯乙烯板條的孔中包被禽流感多克隆抗體，并用BSA封閉，待測孔中加入50μl上述單鏈抗體溶液以及50μl禽流感H5病毒，陰性對照孔中則加入50μl 1x PBS溶液及50μl禽流感H5病毒，陽性對照孔中加入50μl禽流感多克隆抗體及50μl禽流感H5病毒，三孔重復。各孔稍混勻后于37℃反應1小時后，以HRP標記的禽流感多克隆抗體為二抗再反應半小時，加入A、B顯色液于37℃顯色15分鐘，終止反應后用酶標儀讀數。結果陰性對照平均數值為1.871，陽性對照平均數值為0.089，待測孔平均數值為0.597，說明初步純化出的8H5單鏈抗體蛋白具有較高的活性。
            
 
            
選用26株H5N1病毒，利用血凝抑制試驗方法(HI)鑒定所述8H5單鏈抗體與病毒的反應性。在96孔血凝板中，每孔加入25μL PBS，在第一孔中加入25ul8H5單鏈抗體溶液(0.08mg/ml)并混勻，取25μL到第二孔，如此向后倍比稀釋。取25μl病毒加入單鏈抗體中，室溫孵育30分鐘，再加入0.5％雞紅細胞50μL，室溫孵育30分鐘，觀察紅細胞凝集。結果8H5單鏈抗體對其中的16株病毒都有HI活性(表11)。
            
 
            
實施例9 10F7、4D1單鏈抗體的表達及活性檢測   
            
方法如實施例8所述，將抗體基因的重鏈和輕鏈可變區通過(GGGGS)3短肽連接成單鏈抗體DNA片段。以10F7 VHF/10F7 VHR為引物對擴增出10F7重鏈可變區片段，以10F7 VKF/10F7 VKR為引物對擴增出10F7輕鏈可變區片段。以4D1 VHF/4D1 VHR為引物對擴增出4D1重鏈可變區片段，以4D1 VKF/4D1 VKR為引物對擴增出4D1輕鏈可變區片段。
            
 
            
以10F7 VHF/10F7 VKR為引物進行大量擴增重疊的10F7單鏈抗體片段，以4D1 VHF/4D1 VKR為引物進行大量擴增重疊的4D1單鏈抗體片段。以BamH I/SaI I酶切回收到單鏈抗體片段，克隆到相同酶切的pT0-T7原核表達載體中。同樣以ER2566大腸桿菌作為表達菌株，表達過程同上，表達的蛋白質以不溶性的包涵體形式存在。超聲沉淀經相同純化過程，結果單鏈抗體主要溶解于8M尿素中。將溶解于8M尿素中的單鏈抗體蛋白逐步對1xPBS透析復性，12000rpm離心10分鐘去除沉淀，將最終得到的初步純化的單鏈抗體溶液進行活性測定。
            
 
            
選用26株H5N1病毒，利用血凝抑制試驗方法(HI)鑒定所述初步純化的10F7、4D1單鏈抗體的活性。方法同上，單鏈抗體10F7的濃度為1.06mg/ml，4D1的濃度為0.34mg/ml。結果4D1單鏈抗體對其中的23株病毒都有HI活性，10F7單鏈抗體對其中的14株病毒有血凝塑活性(表11)。
            
 
            
表11 三種單鏈抗體對25株H5N1禽流感病毒的血凝抑制實驗結果     
            
        
            
      
            
注HI滴度為稀釋2的n次方，n為表中數值   
            
采用中和實驗測定初步純化的10F7單鏈抗體的活性。選取7株2002年至2006年期間，在香港、印尼、青海等地，從雞、鴨及數種野生鳥類中分離到的毒株，利用血凝抑制實驗鑒定所述10F7單鏈抗體于病毒的反應性，結果該單鏈抗體對其中5株病毒都表現出了較好的中和活性(見表12)。針對Ck/HK/Yu22/02毒株，scFv經64倍稀釋后仍然能夠抑制病毒感染細胞。
            
 
            
表12 10F7 scFv中和實驗結果     
            
      
            
實施例10 嵌合抗體的表達及活性檢測   
            
將4D1、10F7和8H5單抗的重鏈可變區和輕鏈可變區基因，分別加上信號肽序列，再克隆到含有人gamma 1重鏈和kappa輕鏈恒定區序列的真核表達質粒中。其中pcDNA3.1-AH含有人gamma 1重鏈恒定區序列，pcDNA3.1-Ak含有人輕鏈kappa恒定區序列。
            
 
            
以8H58CHF1/8H5VHR為引物對擴增出8H5部分重鏈信號肽序列及可變區片段，以該PCR產物為模板，8H58CHF2/8H5VHR為引物對，擴增出帶完整信號肽的8H5重鏈可變區序列，克隆至Bam H I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-AH質粒，從而獲得表達人鼠嵌合重鏈的表達質粒pcDNA3.1-AH8H5。以8H58CKF1/8H5VKR1為引物對擴增出8H5部分輕鏈信號肽序列及可變區片段，以該PCR產物為模板，8H58CKF2/8H5VKR1為引物對擴增出帶完整信號肽序列的8H5輕鏈可變區片段，克隆至EcoR I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-Ak質粒，從而獲得表達人鼠嵌合輕鏈的表達質粒pcDNA3.1-Ak8H5。
            
 
            
以10F78CHF1/10F7VHR為引物對擴增出10F7部分重鏈信號肽序列及可變區片段，以該PCR產物為模板，10F78CHF2/10F7VHR為引物對，擴增出帶完整信號肽的10F7重鏈可變區序列，克隆至Bam H I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-AH質粒，從而獲得表達人鼠嵌合重鏈的表達質粒pcDNA3.1-AH10F7。以10F78CKF1/10F7VKR為引物對擴增出10F7部分輕鏈信號肽序列及可變區片段，以該PCR產物為模板，10F78CKF2/10F7VKR為引物對擴增出帶完整信號肽序列的10F7輕鏈可變區序列，克隆至EcoR I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-Ak質粒，從而獲得表達人鼠嵌合輕鏈的表達質粒pcDNA3.1-Ak10F7。
            
 
            
以4D1VH F1/4D1VHR為引物對擴增出4D1部分重鏈信號肽序列及可變區片段，以該PCR產物為模板，4D1VHF2/4D1VHR為引物對，擴增出帶完整信號肽的4D1重鏈可變區序列，克隆至Bam H I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-AH質粒，獲得表達人鼠嵌合重鏈的表達質粒pcDNA3.1-AH4D1。以4D1VKF/4D1VKR為引物對擴增出4D1輕鏈信號肽序列及可變區片段，克隆至EcoR I/Xho I雙酶切的pcDNA3.1-Ak質粒，從而獲得表達人鼠嵌合輕鏈的表達質粒pcDNA3.1-Ak4D1。
            
 
            
圖4為3種嵌合抗體的表達質粒圖。
            
 
            
通過磷酸鈣轉染法將含嵌合重鏈和嵌合輕鏈的雙質粒共轉染293FT細胞，收集培養上清，經飽和硫銨沉淀獲得初步純化的嵌合抗體(cAb)。調整嵌合抗體和鼠單抗(mAb)的初始濃度至0.7ug/ml，用Ck/HK/Yu22/02毒株進行血凝抑制HI活性檢測，結果表明，三種嵌合抗體的HI活性均與相應鼠單抗一致(圖5)。
            
 
            
選用23株H5N1病毒，利用血凝抑制試驗方法(HI)鑒定所述初步純化的10F7、4D1嵌合抗體的活性，方法同上。結果兩種嵌合抗體對這23株病毒都有HI活性(表13)。
            
 
            
表13 兩種嵌合抗體對23株H5N1禽流感病毒的HI結果     
            
        
            
      
            
進一步采用免疫熒光方法測定cAb的活性。在24孔細胞培養板中放置蓋玻片，在其中培養昆蟲細胞SF21，通過昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統，在SF21細胞中表達禽流感病毒的HA蛋白。表達后的細胞經過PBS洗滌，4％多聚甲醛固定，山羊多抗血清封閉后，與4D1或10F7嵌合抗體室溫孵育1小時，以HBV特異的人鼠嵌合抗體為陰性對照。以熒光標記的羊抗人抗體(Sigma，St.Louis，MO，USA)為二抗，室溫反應半小時，取DAPI(Sigma，St.Louis，MO，USA)染細胞核，室溫10分鐘，然后制片于正置熒光顯微鏡(Nikon)下觀察。由圖6的結果可知，4D1、10F7嵌合抗體均能特異地與SF21細胞中表達禽流感病毒的HA蛋白結合。
            
 
            
實施例11 從噬菌體7肽庫中篩選模擬單克隆抗體識別表位的短肽   
            
選用New England Biolabs公司的7肽噬菌體展示文庫(ph.D.C7C peptidelibrary)篩選與單克隆抗體8H5、3C8結合的7肽，按操作說明書進行。大體如下   
            
吸取50μl Protein A-瓊脂糖介質(50％的水懸液)于微量離心管中，加1ml TBS+0.1％ Tween(TBST)溶液。輕彈管壁或溫和震蕩重懸介質。低速離心30秒，沉淀介質，小心吸去上清。介質重懸于1ml封阻緩沖液中，4℃作用60分鐘，偶爾混勻。在此期間，用TBS緩沖液將2×1011個噬菌體粒子(相當于10μl的原始文庫)和300ng抗體稀釋至終體積200μl，抗體終濃度為10nM。室溫作用20分鐘。封阻反應后，低速離心沉淀介質，并用1ml TBS洗4次，每次均需沉淀介質。將噬菌體-抗體混合物加入洗過的介質中，溫和混勻，室溫作用15分鐘并不時混勻。低速離心沉淀介質，棄上清，用1ml TBTS洗10次。重懸沉淀介質于1ml 0.2M的Glycine-HCl(pH 2.2)，1mg/ml BSA中，室溫作用10分鐘，洗脫結合的噬菌體。離心洗脫混合液1分鐘，小心將上清轉入另一新的微量離心管中。立即用150μl 1M Tris-HCl，pH 9.1的緩沖液中和洗脫液。取出約1μL滴定噬菌體滴度。將剩余的噬菌體溶液加入20mL對數生長前期的ER2738宿主菌液中，37℃震蕩培養4.5小時。將菌液移入50mL離心管中，10000rpm離心20分鐘。吸取上部80％上清，加入1/6體積的PEG/NaCl(20％PEG-8000，2.5M NaCl)溶液，4℃靜置1小時。10000rpm 4℃離心15分鐘。倒掉上清，用1mL PBS溶解沉淀噬菌體。4℃離心5分鐘，吸取上清，加入1/6體積的PEG/NaCl溶液，4℃靜置1小時。10000rpm 4℃離心15分鐘。倒掉上清，用200μL PBS溶解沉淀噬菌體，4℃保存。重復上述步驟，進行再一輪的篩選。
            
 
            
將過夜培養的ER2738宿主菌按照1:10的比例稀釋到LB培養基中，并將菌液分裝到培養管中(1mL/管)。每種單克隆抗體挑取10個經過3輪篩選的LB/IPTG/Xgal培養板上蘭色的噬菌斑單克隆，接種到上述菌液中。37℃震蕩培養4.5小時。將菌液移到1.5mL離心管中，10000g離心后，取200ul上清保存，余下的按照小量M13抽提純化試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)操作手冊提取ssDNA。經上海博亞生物技術有限公司測序，獲知插入的7肽序列如表14。
            
 
            
表14 與單克隆抗體8H5、3C8結合的7肽序列(核苷酸序列SEQ ID Nos 13，14和15分別為氨基酸序列SEQ ID Nos 64，68和70的編碼序列)。
            
   
            
      
            
實施例12噬菌體7肽的活性檢測   
            
將含有8H5A、8H5E、3C8A7肽的三種噬菌體進行大量擴增，經PEG沉淀后，溶于PBS，測定滴度為1011-1012之間。以5ug/ml濃度分別包被4種鼠單抗8H5、4A1、9N7、4D11，5％脫脂奶PBS封閉。將分別加入進行梯度稀釋后的三種噬菌體，反應1小時后，洗滌5次，加入15000羊抗M13酶標抗體(Amersham Pharmarcia Biotech，UK)，反應半小時后讀數。結果如表15所示，可知8H5A與8H5單抗的反應具有較好的特異性，而與其它三種單抗的反應性很弱。8H5E對8H5單抗的特異反應性較差。
            
 
            
表15 噬菌體7肽的特異性結合活性檢測結果     
            
      
            
實施例13 從噬菌體12肽庫中篩選模擬8H5識別表位的短肽   
            
選用New England Biolabs公司的12肽噬菌體展示文庫(ph.D.12pe ptide library)篩選與單克隆抗體8H5結合的12肽，按操作說明書進行篩選。具體步驟參照實施例11。
            
 
            
第三輪篩選后，取出約1ul洗脫下來的噬菌體進行滴定。挑取單一噬菌體空斑至對數期的ER2738菌中，37℃培養4.5～5小時，離心收集噬菌體上清進行ELISA檢測。包被10ug/ml濃度的鼠單抗8H5，以噬菌體上清為一抗，Anti-M13/HRP抗體(AmershamPhmarcia Biotech，UK)以1:5000稀釋為二抗，取禽流感相關抗體4D1mAb、10F7mAb以及抗HEV E2蛋白的不相關抗體8C11mAb為鼠單抗對照。圖7顯示其中較好的12個噬菌體多肽的檢測結果。由圖中結果可知，大部分噬菌體肽針對目標抗體8H5的讀值高于對照抗體3倍以上，有較好的特異性。
            
 
            
根據噬菌體ssDNA抽提試劑盒(Omega，USA)的常規操作抽提DNA，以該DNA模板進行測序(Invitrogen，Shanghai，China)，獲得以上12株噬菌體展示12肽的核苷酸及氨基酸序列(見表16)。
            
 
            
表16 與單抗隆抗體8H5結合的12肽序列     
            
        
            
      
            
實施例14.12肽123和125與239蛋白融合表達及活性檢測   
            
239-123和239-125融合表達載體的構建   
            
本實驗室在大腸桿菌中表達了HEV ORF2的一個片段(a.a.368—606)，獲得的重組蛋白239可組裝成為類病毒顆粒，具有良好的免疫原性。我們通過PCR方法，構建出239序列的C端融合12肽序列的原核表達載體pTO-T7-239-123(圖8)和pTO-T7-239-125(圖9)。首先，針對239序列和12肽序列設計引物(表17)，以239基因為模板，應用引物239-123F/239-123R1和239-125F/239-125R1進行第一輪PCR擴增。產物回收、純化后作為模板，應用引物239-123F/239-123R2和239-125F/239-125R2進行第二輪PCR擴增，擴增出239-123和239-125片段。然后，分別回收PCR產物239-123和239-125，Nde I和EcoR I雙酶切后克隆入載體pTO-T7中。連接物轉化大腸桿菌ER2566，小量表達及質粒酶切鑒定，陽性克隆即為重組原核表達載體pTO-T7-239-123和pTO-T7-239-125。
            
 
            
表17 239-123和239-125克隆引物序列     
            
      
            
239-123和239-125融合蛋白的表達和純化   
            
挑取轉化pTO-T7-239-123或pTO-T7-239-125質粒的ER2566單菌落，于2mL含有Kn抗性的LB培養基中，37℃震蕩培養至OD600約0.5，然后按照11000的比例轉接擴大培養至500mL LB(含有Kn抗性)中，培養至OD600約1.0時，加入IPTG 500μL，37℃誘導4小時。4℃下收集菌體，8000rpm離心10分鐘。棄上清，菌體沉淀用20mL/瓶的裂解液重懸。冰水浴，采用超聲破碎儀處理破碎細胞。超聲條件如下工作時間10分鐘；脈沖打2秒鐘，停5秒鐘；輸出功率70％。12000rpm離心10分鐘，保留上清，沉淀用20mL 2％Triton重懸，震蕩30分鐘。12000rpm離心10分鐘，保留上清，沉淀用20mL Buffer I重懸，震蕩30分鐘。重復Triton/Buffer I處理一次。12000rpm離心10分鐘，保留上清，沉淀用20mL 2M Urea/Buffer I重懸，震蕩30分鐘。12000rpm離心10分鐘，保留上清，沉淀用20mL 4M Urea/Buffer I重懸，震蕩30分鐘。12000rpm離心10分鐘，保留上清，沉淀用20mL 8M Urea/Buffer I重懸，震蕩30分鐘。12000rpm離心10分鐘，保留上清。各保留上清制成蛋白上樣樣品以進行SDS-PAGE分析(圖10、圖11)。由SDS-PAGE分析得知，蛋白主要溶解于8M Urea中，純度可達90％。將8M Urea中的蛋白梯度透析至PBS中(8M Urea-4M Urea-2M Urea-PBS)。
            
 
            
239-123和239-125融合蛋白的活性檢測   
            
直接ELISA法檢測   
            
初步純化的239-123和239-125融合蛋白以10μg/mL的濃度包被96孔板，37℃2小時。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結合位點，37℃2小時后4℃過夜。去封閉液后，每孔加入100μL不同的鼠單抗，包括8C11、7H8、3C8、8H5、1A6、13E1、1D8、1G2、3G41、13A2、11H8、4D1、10HD4、14H12、6CF3、7D1、7E8、10DE2、16A12、3FC1、8E2、3D2、10D122、13E7共24株單抗。其中8C11為239蛋白特異單抗，8H5為12肽篩選所用單抗，其余22株單抗為針對禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)單抗。37℃孵育1小時。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分鐘。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10分鐘，終止液終止，酶標儀讀值。由圖12、圖13結果可知，239-123和239-125融合蛋白只與抗體8C11和8H5反應，與其它單抗均無反應。說明239-123和239-125融合蛋白的反應特異性非常好。
            
 
            
實施例15 12肽123和125與HBV cAg蛋白融合表達   
            
融合表達載體的構建   
            
利用HBVcAg的a.a.1-149在大腸桿菌中能以類病毒顆粒形式表達的性質，本實驗室將該149個氨基酸插入大腸桿菌表達載體pTO-T7中，并以連接子替代HBVcAg B細胞優勢表位區段的第79、80兩個氨基酸，構建了突變型HBVcAg表達質粒pC149-mut。HBVcAg有著很強的T細胞免疫原性，外源多肽在HBVcAg內部MIR(mayorimmunodominant region，a.a.78-83)的融合不會改變其顆粒的多聚特性，且可使外源表位暴露于顆粒表面。
            
 
            
將123和125分別以1至5個拷貝插入HBcAg的第79和80位氨基酸，得到系列融合蛋白，分別統稱為HBc-123、HBc-125。根據12肽序列，以及pC149-mut的載體序列，分別設計含12肽序列的正向引物及通用反向引物149MRP(表18，下劃線表示插入的多肽序列)。以pC149-mut為模板，應用引物HBc123F2/HBcR和HBc123F2/HBcR進行第一輪PCR擴增。產物回收、純化后作為模板，應用引物HBc123F1/HBcR和HBc123F1/HBcR進行第二輪PCR擴增，擴增出連有12肽序列的C149 a.a.81-149，經BgI II和EcoR I酶切后回收純化得到片段。同時以BamH I和EcoR I雙酶切載體pC149-MUT，回收載體后與片段連接。連接物轉化大腸桿菌ER2566進行表達鑒定及質粒酶切鑒定，鑒定正確的質粒即插入了一個12肽，分別命名為pC149-mut-123和pC149-mut-125。此質粒再用BamH I和EcoR I雙酶切得載體，與之前經BgI II和EcoR I酶切的含有12肽序列的片斷連接，陽性克隆即為含有2個12肽拷貝數的重組原核表達質粒，分別命名為pC149-mut-D123和pC149-mut-D125。用類似方法，構建出分別含有3個拷貝、4個拷貝及5個拷貝數的重組原核表達載體pC149-mut-T123、pC149-mut-F123、pC149-mut-Q123和pC149-mut-T125、pC149-mut-F125、pC149-mut-Q125。構建質粒圖如圖15、圖16所示(僅以pC149-mut-123和pC149-mut-125為例)。
            
 
            
表18 123、125與HBV cAg融合蛋白表達的克隆引物序列     
            
      
            
備注下劃線為12肽序列。
            
 
            
融合蛋白的表達及純化   
            
將pC149-mut-D123、pC149-mut-T123、pC149-mut-F123、pC149-mut-Q123、pC149-mut-D125、pC149-mut-T125、pC149-mut-F125、pC149-mut-Q125表達質粒表達出來的融合蛋白分別稱為D123、T123、F123、Q123、D125、T125、F125、Q125。分別將含有八種表達質粒的ER2566菌種，接種于2mL含有Kn抗性的LB培養基中，37℃震蕩培養至OD600約0.5，然后按照11000的比例轉接擴大培養至500mL LB(含有Kn抗性)中，培養至OD600約0.8時，加入IPTG 500μL，18℃誘導20小時。4℃下收集菌體，8000rpm離心10分鐘。棄上清，菌體沉淀用20mL/瓶的裂解液重懸。冰水浴，采用超聲破碎儀處理破碎細胞。超聲條件如下工作時間10分鐘；脈沖打2秒鐘，停5秒鐘；輸出功率70％。12000rpm離心10分鐘，保留上清。經SDS-PAGE鑒定，所有融合蛋白主要表達在上清中(圖17)。
            
 
            
由于上清表達蛋白比較雜，故需要對其進行純化。并且此類蛋白在適宜的條件下可以自發組裝形成顆粒，所以對蛋白進行純化的同時，應考慮其自發組裝形成顆粒的條件。我們采用以下方法對蛋白進行純化以及促進蛋白自發組裝形成顆粒以總體積20％的量加入飽和硫酸銨進行蛋白沉淀，冰浴反應30分鐘。12000rpm離心10分鐘，棄上清。沉淀用含有5％β-巰基乙醇的CB Buffer吹起，37℃震蕩30分鐘，12000rpm離心10分鐘，上清透析至PB5.8(含有300mM NaCl和50mM EDTA)的緩沖液體系中。每8小時換液一次，換液6次后收集透析液，12000rpm離心10分鐘，上清樣品進行SDS-PAGE鑒定純度。此方法中，先以20％飽和硫酸銨對蛋白進行初步純化，再以含有5％β-巰基乙醇的CB Buffer促使蛋白形成顆粒組裝引發二聚體，然后在低PH值及高鹽的條件下促進蛋白自發組裝形成顆粒。同時此條件下，目的蛋白可以得到進一步的純化(圖18)。
            
 
            
以上表達的8種融合蛋白均以上述方法初步純化后，樣品用2％磷酸鎢負染，直接進行電鏡觀察(圖19)。組裝成功的顆粒呈均勻的空心球形(部分顆粒為實心狀)，有大小兩種，直徑分別約為35nm及20nm。
            
 
            
實施例16ELISA檢測HBc-123和HBc-125融合蛋白活性   
            
將八種融合蛋白分別以10μg/mL的濃度包被96孔板，37℃2小時。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結合位點，37℃2小時后4℃過夜。每孔加入100μL8H5抗體，37℃孵育1小時。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分鐘。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10分鐘，終止液終止，酶標儀讀值。由圖20的結果可知，八種融合蛋白均具有與8H5抗體結合的活性。
            
 
            
以Q123和D125蛋白為例，進行抗體特異性的檢測。10μg/mL的蛋白濃度包被96孔板，37℃2小時。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結合位點，37℃2小時后4℃過夜。每孔加入100μL不同抗體，包括8H5、8G9、3C8、4D1、10F7、1G2、3D2、3CF1、7D1、6CF3、7H8、10DE2、13E7、16A12共14株單抗。其中8H5為12肽篩選所用單抗，其余13株單抗為針對禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)單抗，37℃孵育1小時。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分鐘。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10分鐘，終止液終止，酶標儀讀值。對ELISA結果分析(圖21)，Q123和D125融合蛋白只與抗體8H5反應，與其它禽流感單抗均無反應。說明Q123和D125融合蛋白的反應特異性非常好。
            
 
            
實施例17 HBc-123和HBc-125融合蛋白的免疫源性分析   
            
將上述經過純化的八種HBc-123和HBc-125融合蛋白分別與等體積的福氏佐劑混合(初次免疫時與完全福氏佐劑混合，加強免疫時與不完全福氏佐劑混合)，以肌肉多點注射的方式，免疫BALB/c小鼠，每只小鼠的免疫量為100μg蛋白，3—4只小鼠為一組。初次免疫后，每隔一周加強免疫一次，同時采取眼球血。進行抗血清分離將血懸液置37℃2小時，再移入4℃過夜，令血球凝集。4000g離心10分鐘，吸取上清，即得到抗血清。存放于-4℃備用。
            
 
            
以1μg/孔包被239-123和239-125融合蛋白，HRP標記的羊抗鼠IgG作為酶標二抗，建立抗12肽123或125特異抗體檢測的間接法ELISA，用來檢測動物抗血清的123肽或125肽特異抗體與12肽反應性以及抗體產生滴度情況。HBc-123的各融合蛋白免疫血清以11000稀釋后，ELISA檢測結果如圖22。HBc-125的各融合蛋白免疫血清以12000稀釋后，ELISA檢測結果如圖23。
            
 
            
實施例18  免疫小鼠血清的免疫熒光檢測   
            
在24孔細胞培養板中放置蓋玻片，在其中培養昆蟲細胞SF21，通過昆蟲細胞一桿狀病毒表達系統，在SF21細胞中表達禽流感病毒的HA蛋白。表達后的細胞經過PBS洗滌，4％多聚甲醛固定，山羊多抗血清封閉后，與1:20稀釋的T123和F125免疫鼠血清室溫孵育1小時，以HBc免疫鼠血清為陰性對照。以熒光標記的羊抗鼠抗體(Sigma，St.Louis，MO，USA)為二抗，室溫反應半小時，取DAPI(Sigma，St.Louis，MO，USA)染細胞核，室溫10分鐘，然后制片于正置熒光顯微鏡(Nikon)下觀察。由圖24的結果可知，T123和F125免疫鼠血清均能特異地與SF21細胞中表達禽流感病毒的HA蛋白結合。進一步表明123和125較好的模擬了HA的抗原表位。
            
 
            
實施例19 12肽122、124、128、129與HBV cAg蛋白融合表達及活性檢測   
            
4種12肽122、124、128、129，分別以兩個拷貝插入HBV cAg蛋白中，得到的融合蛋白分別稱為HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129。
            
 
            
HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白表達載體的構建方法與HBc-123、HBc-125融合蛋白表達載體的構建方法相同，所用引物如表19。第一輪的上游引物為F3，第二輪的上游引物為F2，第三輪的上游引物為F1，下游引物均為HBcR。通過3輪PCR，將目的12肽片斷與C149-mut片段相連，并以Bg II和EcoR I雙酶切后，與BamH I和EcoR I雙酶切的pC149-mut載體連接，構建成表達質粒(具體方法詳見實施例15)。
            
 
            
表19 HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白克隆引物序列     
            
        
            
      
            
HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白表達和純化與上述HBc-123、HBc-125融合蛋白的表達、純化方法相同(具體方法詳見實施例15)。HBc與12肽融合蛋白的表達情況以及顆粒組裝情況如表20所示。顆粒的電鏡觀察圖片如圖25。
            
 
            
表20 HBc與12肽融合蛋白的表達及VLP形成     
            
        
            
      
            
間接ELISA檢測HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白活性。
            
 
            
HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白以10μg/mL的濃度包被96孔板，37℃ 2小時。洗板1次，ED封閉液封閉非特異性結合位點，37℃ 2小時后4℃過夜。每孔加入100μL不同抗體，包括8H5、8G9、3C8、1G2、3D2、3CF1、7D1、6CF3、7H8、10DE2、13E7、16A12共12株單抗。其中8H5為12肽篩選所用單抗，其余11株單抗為針對禽流感病毒(AIV)上血凝蛋白(HA)單抗，37℃孵育1小時。PBST洗板5次，每孔加入GAM-HRP(110000)100μL，37℃孵育30分鐘。PBST洗板5次，加入顯色液顯色10分鐘，終止液終止，酶標儀讀值。由圖26的結果可知，HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白只與抗體8H5反應，與其它禽流感單抗均無反應，說明HBc-122、HBc-124、HBc-128和HBc-129融合蛋白與8H5單抗的反應特異性非常好。
            
 
            
實施例20 展示12肽的類病毒顆粒與禽流感病毒的競爭ELISA實驗   
            
取禽流感病毒H5N1特異鼠單抗2F2以10ug/ml包板，病毒株Ck/HK/Yu22/02以1:40稀釋后加入孔板中孵育，37℃，1小時；棄去孔中病毒，將10ug初純的類病毒顆粒與1:1000稀釋的8H5/HRP共同加入孔板中孵育，37℃，30分鐘。126和127并不與H5單抗結合，但同樣展示于VLP上作為陰性對照，另又以PBS為不加VLP的陰性對照。結果如圖27所示，上述5個待測的類病毒顆粒均能與病毒競爭結合8H5酶標抗體，進一步提示這5個12肽均有可能模擬了8H5抗原表位的部分空間結構。 
            
序列表
            
<110>HX診斷公司
            
　　 夏寧邵
            
 陳毅歆
            
 葛勝祥
            
 羅文新
            
 張軍
            
<120>H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體或其結合活性片段及其用途
            
<130>62682.8001.WO00
            
<140>PCT/US2007/002491
            
<141>2007-01-26
            
<150>中國專利申請200610002312.1
            
<151>2006-01-26
            
<160>27
            
<170>PatentIn version 3.3
            
<210>1
            
<211>363
            
<212>DNA
            
<213>8H5 Vh Nucleotide sequence
            
<400>1 
            
<210>2
            
<211>121
            
<212>PRT
            
<213>8H5 Vh Amino Acid sequence
            
<400>2  
            
<210>3
            
<211>321
            
<212>DNA
            
<213>8H5 Vk Nucleotides equence
            
<400>3 
            
<210>4
            
<211>107
            
<212>PRT
            
<213>8H5 Vk Amino Acid sequence
            
<400<4  
            
<210>5
            
<211>351
            
<212>DNA
            
<213>3C8 Vh Nucleotide sequence
            
<400>5 
            
<210>6
            
<211>117
            
<212>PRT
            
<213>3C8 Vh Amino Acid sequence
            
<400>6  
            
<210>7
            
<211>339
            
<212>DNA
            
<213>3C8 VK Nucleotide sequence
            
<400>7 
            
<210>8
            
<211>113
            
<212>PRT
            
<213>3C8 VK Amino Acid sequence
            
<400>8 
            
<210>9
            
<211>363
            
<212>DNA
            
<213>10F7 Vh Nucleotide sequence
            
<400>9 
            
<210>10
            
<211>121
            
<212>PRT
            
<213>10F7 Vh Amino Acid sequence
            
<400>10 
            
<210>11
            
<211>324
            
<212>DNA
            
<213>10F7 VK Nucleotide sequence
            
<400>11 
            
<210>12
            
<211>108
            
<212>PRT
            
<213>10F7 VK Amino Acid sequence
            
<400>12 
            
<210>13
            
<211>21
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>Artificial sequence/Unknown organism
            
<400>13 
            
<210>14
            
<211>21
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>Artificial Sequence/Unknown organism
            
<400>14 
            
<210>15
            
<211>21
            
<212>DNA
            
<213>Artificial
            
<220>
            
<223>Artificial sequence/Unknown organism
            
<400>15 
            
<210>16
            
<211>363
            
<212>DNA
            
<213>4D1 VH Nucleotide sequence
            
<400>16 
            
<210>17
            
<211>121
            
<212>PRT
            
<213>4D1 VH Amino Acid sequence
            
<400>17  
            
<210>18
            
<211>327
            
<212>DNA
            
<213>4D1 VK Nucleotide sequence
            
<400>18 
            
<210>19
            
<211>109
            
<212>PRT
            
<213>4D1 Vk Amino Acid sequence
            
<400>19  
            
<210>20
            
<211>363
            
<212>DNA
            
<213>3G4 VH Nucleotide sequence
            
<400>20 
            
<210>21
            
<211>121
            
<212>PRT
            
<213>3G4 VH Amino Acid sequence
            
<400>21  
            
<210>22
            
<400>22
            
000
            
<210>23
            
<400>23
            
000
            
<210>24
            
<211>357
            
<212>DNA
            
<213>2F2 VH Nucleotide sequence
            
<400>24 
            
<210>25
            
<211>119
            
<212>PRT
            
<213>2F2 VH Amino Acid sequence
            
<400>25  
            
<210>26
            
<211>324
            
<212>DNA
            
<213>2F2 VK Nucleotide sequence
            
<400>26 
            
<210>27
            
<211>108
            
<212>PRT
            
<213>2F2 VK Amino Acid sequence
            
<400>27   
            
<210>22
            
<400>22
            
000
            
<210>23
            
<400>23
            
000
            
<210>24
            
<211>357
            
<212>DNA
            
<213>2F2 VH Nucleotide sequence
            
<400>24 
            
<210>25
            
<211>119
            
<212>PRT
            
<213>2F2 VH Amino Acid sequence
            
<400>25  
            
<210>26
            
<211>324
            
<212>DNA
            
<213>ZF2 VK Nucleotide sequence
            
<400>26 
            
<210>27
            
<211>108
            
<212>PRT
            
<213>2F2 VK Amino Acid sequence
            
<400>2權利要求
            
1、一種能特異性結合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體包括選自于如下一組的可變重鏈:
            
(i)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:28-30的CDR的可變重鏈；
            
(ii)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:34-36的CDR的可變重鏈；
            
(iii)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:40-42的CDR的可變重鏈；
            
(iv)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:46-48的CDR的可變重鏈；
            
(v)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:52-54的CDR的可變重鏈；以及
            
(vi)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:58-60的CDR的可變重鏈。
            
2、如權利要求1所述的單克隆抗體，其中，所述的可變重鏈包括選自于如下一組的氨基酸序列:
            
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:25。
            
3、如權利要求1所述的單克隆抗體，其進一步包括選自于如下一組的可變輕鏈:
            
(i)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:31-33的CDR的可變輕鏈；
            
(ii)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:37-39的CDR的可變輕鏈；
            
(iii)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:43-45的CDR的可變輕鏈；
            
(iv)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:49-51的CDR的可變輕鏈；以及
            
(v)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:61-63的CDR的可變輕鏈。
            
4、如權利要求3所述的單克隆抗體，其中，所述的可變輕鏈包括選自于如下一組的氨基酸序列:
            
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
            
5、如權利要求2所述的單克隆抗體，其進一步包括選自于如下一組的可變輕鏈:
            
(i)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:31-33的CDR的可變輕鏈；
            
(ii)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:37-39的CDR的可變輕鏈；
            
(iii)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:43-45的CDR的可變輕鏈；
            
(iv)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:49-51的CDR的可變輕鏈；以及
            
(v)包含一個或多個、氨基酸序列為SEQ ID NOs:61-63的CDR的可變輕鏈。
            
6、如權利要求5所述的單克隆抗體，其中，所述的可變輕鏈包括選自于如下一組的氨基酸序列:
            
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
            
7、如權利要求6所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體為Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv。
            
8、如權利要求1所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體為Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
            
9、如權利要求1所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體結合H5亞型禽流感病毒血凝素的KD值小于1×10-5M。
            
10、如權利要求9所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體結合H5亞型禽流感病毒血凝素的KD值小于1×10-6M。
            
11、如權利要求1所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體包括非-CDR區，該非-CDR區是來自不是鼠類的物種。
            
12、如權利要求11所述的單克隆抗體，其中，所述的非-CDR區是來自人類的抗體。
            
13、如權利要求12所述的單克隆抗體，其中，所述的人類非-CDR區具有一個或多個來自鼠抗體的取代氨基酸。
            
14、一種能特異性結合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體包括選自于如下一組的單克隆抗體:
            
(i)雜交瘤細胞株8H5所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株8H5的保藏號是CCTCC-C200607；
            
(ii)雜交瘤細胞株3C8所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株3C8的保藏號是CCTCC-C200605；
            
(iii)雜交瘤細胞株10F7所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株10F7的保藏號是CCTCC-C200608；
            
(iv)雜交瘤細胞株4D1所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株4D1的保藏號是CCTCC-C200606；
            
(v)雜交瘤細胞株3G4所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株3G4的保藏號是CCTCC-C200604；以及
            
(vi)雜交瘤細胞株2F2所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株2F2的保藏號是CCTCC-C200424。
            
15、一種雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株選自于如下一組的雜交瘤細胞株:
            
(i)保藏號為CCTCC-C200607的雜交瘤細胞株8H5；
            
(ii)保藏號為CCTCC-C200605的雜交瘤細胞株3C8；
            
(iii)保藏號為CCTCC-C200608的雜交瘤細胞株10F7；
            
(iv)保藏號為CCTCC-C200606的雜交瘤細胞株4D1；
            
(v)保藏號為CCTCC-C200604的雜交瘤細胞株3G4；以及
            
(vi)保藏號為CCTCC-C200424的雜交瘤細胞株2F2。
            
16、一種能特異性結合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體能夠封閉所述的血凝素蛋白與選自于如下一組單克隆抗體相結合的活性的至少50％:
            
(i)雜交瘤細胞株8H5所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株8H5的保藏號是CCTCC-C200607；
            
(ii)雜交瘤細胞株3C8所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株3C8的保藏號是CCTCC-C200605；
            
(iii)雜交瘤細胞株10F7所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株10F7的保藏號是CCTCC-C200608；
            
(iv)雜交瘤細胞株4D1所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株4D1的保藏號是CCTCC-C200606；
            
(v)雜交瘤細胞株3G4所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株3G4的保藏號是CCTCC-C200604；以及
            
(vi)雜交瘤細胞株2F2所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株2F2的保藏號是CCTCC-C200424。
            
17、如權利要求16所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體封閉所述的血凝素蛋白結合活性的至少70％。
            
18、如權利要求17所述的單克隆抗體，其中，所述的單克隆抗體封閉所述的血凝素蛋白結合活性的至少90％。
            
19、一種分離的核酸分子，其包含能夠編碼抗體重鏈可變區的核酸序列，而所述的抗體重鏈可變區則包含選自于如下一組的氨基酸序列:
            
(i)SEQ ID NOs:28-30；
            
(ii)SEQ ID NOs:34-36；
            
(iii)SEQ ID NOs:40-42；
            
(iv)SEQ ID NOs:46-48；
            
(v)SEQ ID NOs:52-54；以及
            
(vi)SEQ ID NOs:58-60。
            
20、如權利要求19所述的分離的核酸分子，其中，所述的重鏈可變區包含選自于如下一組的氨基酸序列:
            
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQID NO:25。
            
21、如權利要求20所述的分離的核酸分子，其中，所述的核酸分子包括選自于如下一組的核酸序列:
            
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20和SEQID NO:24。
            
22、一種包含如權利要求19所述的核酸分子的表達載體。
            
23、一種包含如權利要求22所述的表達載體的宿主細胞。
            
24、一種分離的核酸分子，其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區的核酸序列，而所述的抗體輕鏈可變區則包含選自于如下一組的氨基酸序列:
            
(i)SEQ ID NOs:31-33；
            
(ii)SEQ ID NOs:37-39；
            
(iii)SEQ ID NOs:43-45；
            
(iv)SEQ ID NOs:49-51；以及
            
(v)SEQ ID NOs:61-63。
            
25、如權利要求24所述的分離的核酸分子，其中，所述的重鏈可變區包含選自于如下一組的氨基酸序列:
            
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
            
26、如權利要求25所述的分離的核酸分子，其中，所述的核酸分子包括選自于如下一組的核酸序列:
            
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:26。
            
27、一種包含如權利要求26所述的核酸分子的表達載體。
            
28、一種包含如權利要求27所述的表達載體的宿主細胞。
            
29、一種檢測樣品中H5亞型禽流感病毒的方法，其包括如下步驟:
            
a)將所述的樣品與權利要求1中的單克隆抗體進行接觸；
            
b)檢測所述的單克隆抗體與所述病毒的反應。
            
30、如權利要求29所述的方法，其中，所述的單克隆抗體附著在固相上。
            
31、如權利要求30所述的方法，其中，所述的固相選自于如下一組:微滴定板、磁顆粒、膠乳顆粒和硝化纖維素膜。
            
32、如權利要求30所述的方法，其中，所述的單克隆抗體是按如此方向附著在所述固相上，其能夠增加所述單克隆抗體與所述樣品的結合效率。
            
33、如權利要求32所述的方法，其中，所述的單克隆抗體是通過其恒定區域而附著在所述固相上的。
            
34、如權利要求29所述的方法，其中，所述的反應是通過酶顯色進行測定的。
            
35、如權利要求29所述的方法，其中，所述的反應是通過熒光進行測定的。
            
36、如權利要求29所述的方法，其中，所述的反應是通過化學發光進行進行測定的。
            
37、如權利要求29所述的方法，其中，所述的單克隆抗體為Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
            
38、如權利要求29所述的方法，其中，所述的樣品來自于鳥類或人類。
            
39、一種藥物組合物，其包含如權利要求1所述單克隆抗體在藥學上可接受的鹽。
            
40、一種藥物組合物，其包含一種或多種選自于如下一組單克隆抗體的、其藥學上可接受的鹽:
            
(i)雜交瘤細胞株8H5所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株8H5的保藏號是CCTCC-C200607；
            
(ii)雜交瘤細胞株3C8所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株3C8的保藏號是CCTCC-C200605；
            
(iii)雜交瘤細胞株10F7所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株10F7的保藏號是CCTCC-C200608；
            
(iv)雜交瘤細胞株4D1所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株4D1的保藏號是CCTCC-C200606；
            
(v)雜交瘤細胞株3G4所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株3G4的保藏號是CCTCC-C200604；以及
            
(vi)雜交瘤細胞株2F2所產生的單克隆抗體，其中，雜交瘤細胞株2F2的保藏號是CCTCC-C200424。
            
41、如權利要求40所述的藥物組合物，其進一步包括其它抗病毒成分在藥學上可接受的鹽。
            
42、如權利要求41所述的藥物組合物，其中，所述的單克隆抗體為Fab、Fab′、F(ab)2或Fv。
            
43、一種防止或治療由禽流感病毒感染在一主體上引發的疾病的方法，其包括向所述的主體給藥有效劑量的、如權利要求39所述的藥物組合物。
            
44、一種用于檢測樣品中禽流感病毒的組合物，其包括附載于固相底物上的、如權利要求1所述的單克隆抗體。
            
45、如權利要求44所述的組合物，其中，所述的單克隆抗體為Fab、Fab′、F(ab′)2或Fv。
            
46、如權利要求44所述的組合物，其中，所述的單克隆抗體包含可變重鏈，該可變重鏈含有選自于如下一組的肽序列:
            
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:21和SEQID NO:25。
            
47、如權利要求46述的組合物，其中，所述的單克隆抗體進一步包含可變輕鏈，該可變輕鏈含有選自于如下一組的肽序列:
            
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:27。
            
48、如權利要求44所述的組合物，其中，所述的固相底物選自于如下一組:微滴定板、磁顆粒、膠乳顆粒和硝化纖維素膜。
            
49、如權利要求44所述的組合物，其中，所述的固相底物為測試帶。
            
50、如權利要求49所述的組合物，其中，所述的測試帶具有至少一測試區和一控制區。
            
51、如權利要求44所述的組合物，其中，所述的單克隆抗體是按如此方向附著在所述固相底物上，其能夠增加所述單克隆抗體與所述樣品的結合效率。
            
52、一種用于檢測樣品中禽流感病毒的裝置，其包括固相底物，該固相底物包括復數個分隔區間，其中，一個或多個所述的分隔區間涂覆有如權利要求1所述的單克隆抗體。
            
53、如權利要求52所述的裝置，其中，一個或多個所述的分隔區間涂覆有不同于能特異性結合H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白的所述單克隆抗體的結合試劑。
            
54、如權利要求53所述的裝置，其中，所述的結合試劑是能夠特異性結合H1、H3、H7或H9亞型禽流感病毒的抗體。
            
55、如權利要求52所述的裝置，其進一步包括自動化檢測裝置，該自動化檢測裝置能夠檢測所述單克隆抗體與H5亞型禽流感病毒血凝素蛋白之間的結合。
            
56、一種檢測樣品中禽流感病毒的試劑盒，其包括如權利要求1所述的、附著于固相底物上的單克隆抗體和可檢測的、被標記的第二單克隆抗體。
            
57、如權利要求56所述的試劑盒，其中，所述的第二單克隆抗體能夠特異性地結合禽流感病毒。
            
58、如權利要求56所述的試劑盒，其中，所述的第二單克隆抗體能夠特異性地結合禽流感病毒血凝素蛋白。
            
59、如權利要求56所述的試劑盒，其進一步包括控制標準。
            
60、一種短肽，其包含選自于如下一組的氨基酸序列:SEQ ID NOs:64-69、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94和96。
            
61、一種短肽，其包含選自于如下一組的核酸序列:SEQ ID NOS:75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95和97。
            
62、如權利要求60或61所述的短肽，其能特異性結合8H5單克隆抗體。
            
63、一種短肽，其包含選自于如下一組的氨基酸序列:SEQ ID NOs:70-73。
            
64、如權利要求63所述的短肽，其能特異性結合3C8單克隆抗體。
            
全文摘要
            
本發明提供了可特異性結合H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白之單克隆抗體，及可阻斷至少50％的單克隆抗體與H5亞型禽流感病毒血凝素(HA)蛋白結合活性之單克隆抗體。該單克隆抗體可用于探測，診斷，預防，和治療禽流感病毒，特別是H5亞型禽流感病毒。本發明也提供了相關的雜交瘤細胞株，分離的核酸分子和短肽，以及其含該單克隆抗體的藥物組合物和醫藥診斷設備和試劑盒。
            
文檔編號G01N33/53GK101379397SQ200780003646 
            
公開日2009年3月4日 申請日期2007年1月26日 優先權日2006年1月26日
            
發明者夏寧邵, 陳毅歆, 葛勝祥, 羅文新, 軍 張 申請人:Hx診斷公司
            
                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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