專利名稱：：含有升高數量的d-二聚體的儲存穩定的細胞全血組合物的制作方法含有升高數量的D-二聚體的儲存穩定的細胞全血組合物
背景技術：
：本發明涉及用于D-二聚體診斷檢驗方法的儲存穩定的液體細胞全血組合物的制備和應用方法，D-二聚體被常規用作生化標記來排除深靜脈血栓(DVT)和肺栓塞(PE)。
背景技術：
：靜脈血栓栓塞癥是一個主要的健康問題，出現在很多疾病中并引發很高的死亡率和發病率。靜脈血栓栓塞癥最常見的表現是深靜脈血栓(DVT)和肺栓塞(PE)。DVT是一種產生在身體通常是下肢某處深靜脈的血液凝塊(血栓)。它是一種會導致組織損害、皮膚傷害甚至截肢的嚴重紊亂。PE是一種部分血栓脫落并寄居在肺動脈的狀況。PE可以導致猝死。D-二聚體分子是纖維蛋白降解的產物。血漿中D-二聚體存在的濃度升高證明了纖維蛋白溶解系統(分解纖維蛋白凝塊)正在響應凝固活化而起作用。人體血漿中D-二聚體生理水平的界值點根據如性別和年齡的因素而變化，也會因不同分析方法而不同。因此一般來說，人體血漿中D-二聚體生理水平的典型界值為約200ng/mL至約500ng/mL。靜脈血栓癥患者(DVT或PE)血液中的D-二聚體顯著高于生理水平。如果D-二聚體水平顯著高于前面設立的界值，那么將實施成像方法如超聲和放射線照相方法來確定患者患有DVT或PE。其它可能的D-二聚體水平上升的原因諸如癌癥、糖尿病、外傷、心血管紊亂和血肺也可被研究。如果D-二聚體水平低于界值，那么DVT和PE被排除，患者將被送去成像檢查或用抗凝血劑治療。因而，D-二聚體水平的測定既可以用作一種診斷手段，也可用作一種治療患者的節約手段。大量使用不同技術診斷D-二聚體的檢驗已在文獻中有敘述并被引入臨床實驗市場。侈寸^口，DiagnosticaStagoSTA—L1ATEST⑧D—DI分析、bioMerieuxVidasD-二聚體分析、和DadeBehring先進D-二聚體分析是一些測定血漿中D-二聚體的定量檢驗方法。DiagnosticaStagoSTA-L1ATESTD-DI是一種使用與特異性抗體共價附著的微膠乳顆粒的免疫比濁分析。VidasD-二聚體分析是使用帶有酶聯熒光探測的兩步夾心酶聯免疫分析法。DadeBehringAdvancedD-Dimer分析也是一種免疫比濁分析。這些分析都包含檢驗血漿中D-二聚體含量的過程。與上述分析不同，一些適合即時裝置的分析已被引入市場來檢驗全血樣本中的D-二聚體。例如，這些能讓檢驗在床邊或在醫生辦公室里進行，并能立刻得到結果，優于將樣本送至實驗室后分離血漿來檢驗。兩個這種快速定性分析來檢驗全血樣本中D-二聚體的例子是AgentBiomedical公司(澳大利亞)的SimpliREDD-二聚體分才斤和AmericanDiagnostica公司的ClearviewSimplifyD-二聚體分析。SimpliRED'D-二聚體分析是一種自體紅細胞凝集分析。活性劑是對D-二聚體特異的并與之連接的單克隆抗體的化學共軛，其結合在紅細胞表面。ClearviewSimplifyD-二聚體分析是一種使用與膠態金顆粒共軛的D-二聚體特異鼠單克隆抗體來檢測D-二聚體的免疫色傳檢驗。抗體-金-D-二聚體復合物在水相移動通過膜，直至它在附著第二D-二聚體特異鼠抗體的區域被捕獲和濃縮。在此區域復合物的濃縮導致膜上呈現一道粉紅/紫色的線。在此分析中，如果D-二聚體的濃度低于臨床上建立的界值，那么不會出現可見的線。質量控制材料被常規用于臨床診斷實驗室中，來監控臨床檢驗方法和過程的精度和準確性，無論分析是在實驗室還是在患者旁邊這都可進行。為了最佳效果，質量控制材料應同真正患者的樣本一樣對期望分析方差敏感。此外，質量控制材料應是儲存穩定的，其分析物目標濃度應挑戰分析的醫療決策點。其它質量控制材料的期望特征有低成本、逐批再現性和易制造。在一份先前出版物中描述了SimpliRED分析的工作[John等，ThrombosisResearch58:273(1990)]，含D-二聚體抗原的基團0陰性全血被系列稀釋產生系列濃度，用作對照。然而，SimpliRED分析同血漿基的對照一起銷售，與ClearviewSimplify分析一起銷售的對照僅僅是一種"低分子量的D-二聚體摻加溶液"。此外，一些用來檢驗血漿中標記的血漿基和緩沖液基的D-二聚體對照在市場上普遍存在。有一個，StagoUATESTD-二聚體對照(來自DiagnosticaStago，Asnieres-surSeine,法國)是一種雙層凍干對照，此對照針成。另一個，DadeBehring先進D-二聚體對照血漿1和2(來自DadeBehring公司，DeerfieldIL)是由補充了D-二聚體制備物的匯集血漿組成的雙層凍干對照，用Hepes緩沖劑穩定并用Proclin儲存。Bio-Rad實驗室(Hercules，加拿大)提供一種含有三種升高水平的處理過的人體血漿和防腐劑制得的D-二聚體的血漿基液體對照。然而到現在，還沒有商用的儲存穩定的細胞全血D-二聚體組合物用作全血檢驗目的的D-二聚體分析的對照或校準器。需要用于全血檢驗目的的D-二聚體分析的儲存穩定的細胞全血基質量控制材料。這種產品本質上同患者樣本相近，可以直接用于為即時檢驗設計的檢驗材料，即時檢驗不需要在檢驗這種樣本時將血細胞從血漿中分離出。本發明滿足了這種需要，并滿足其它關于質量控制材料的基本需求，如通過使用人體紅細胞和血漿的組合作為基礎基體反應出同患者樣本一樣的分析方差，有挑戰分析線性動態范圍的目標值，和提供長期使用時可接受的開瓶和封閉瓶下穩定性。發明概述第一方面，本發明包括一種全血細胞組合物，此組合物包括pH值約4至約9的去纖維蛋白血漿、0至約10g/dL的總蛋白質含量、紅細胞、穩定劑和升高水平的D-二聚體。第二方面，本發明包括一種制備含有升高水平的D-二聚體的全血組合物的方法，方法包括將包括紅細胞和穩定劑的組合物與包括pH值為約4至約9的去纖維蛋白血漿和0至約10g/dL的總蛋白質含量的組合物和足夠量的D-二聚體結合以產生含有升高數量的D-二聚體的產品。第三方面，本發明包括一種監控全血基D-二聚體分析的方法，方法包括使用上述組合物，優選一系列兩種或多種這種含有不同升高數量的D-二聚體的組合物作為對照。本發明也包括主要為了與全血D-二聚體分析連同使用設計的對照試劑盒，試劑盒包括一種或多種這種組合物。如果試劑盒包括兩種或多種這種組合物，那么組合物具有不同升高數量的D-二聚體。發明詳述本方明包括使用穩定的紅細胞、處理過的血漿、和D-二聚體(其可以是天然的、合成的、或重組的D-二聚體)及穩定劑、優選還有抗微生物劑，來制備組合物，其可用作測定全血中D-二聚體的診斷檢驗過程中的標準、參考材料、和/或對照。一般而言，組合物是全血細胞組合物，其包括pH值約4至約9的去纖維蛋白血漿、0至約10g/dL的總蛋白質含量、紅細胞、穩定劑和升高水平的D-二聚體。優選地，組合物含有約10體積％至約70體積％，最優選約40體積°/。至約60體積°/。的去纖維蛋白血漿，其同樣地具有pH值約4至約9，優選約5至約8，最優選約6至約7;總蛋白質含量從0至約10g/dL，優選約4至約8，最優選約5至約7g/dL;約10體積％至約70體積％，優選約35體積°/。至約55體積％的紅細胞，約0.01重量％至約10重量％，優選約0.1重量°/。至約2.0重量％的穩定劑，和相對于內源D-二聚體數量升高的D-二聚體，優選達到約200jig/mL的D-二聚體。組合物中包含蛋白質是任選(即蛋白質含量可以是O)，但優選蛋白質在組合物中達到約10g/dL。含有這種量蛋白質的組合物將更似全血。一個優選實施方案中的組合物也包含約0重量％至約2重量％，最優選約0.01重量％至約1重量％的一種或多種抗微生物劑。本發明組合物和方法中所用的血漿優選是人體血漿，但是可以是其它哺乳動物的血漿，如牛或豬的血漿，或者也可以是如現有技術制備的人造血漿并包含具有一些人體血漿成分如紅細胞、清蛋白、緩沖液等的含水液體。為了組合物中的使用，血漿用現有技術進行去纖維蛋白處理以使得纖維蛋白含量低于約5mg/dL。然后，用任何合適的技術如濃縮組合物或用血漿、血清或等滲中性溶液稀釋組合物，將血漿中總蛋白質含量值調至約0至約10，優選約4至約8，最優選約5到約7g/dL。然后pH值調至約4至約9之間，優選約5至約8，最優選約6至約7。接下來，可以加入另外任選的成份如酶抑制劑和一種或多種抗微生物劑。再測定這些組合物(其也可稱為"基礎基體")中內源D-二聚體含量。如此所述制備的處理過的血漿再與紅細胞，優選充盈的紅細胞，及穩定劑(其可與充盈的紅細胞一起添加或單獨添加)結合。紅細胞優選人體紅細胞，但也可以選擇哺乳動物，或甚至鳥類的紅細胞。合適的非人類哺乳動物紅細胞包括豬、牛、馬、山羊和綿羊的紅細胞。合適的鳥類紅細胞包括雞和火雞的紅細胞。產生的組合物將含有約10體積％至約70體積％，優選約30體積％至約55體積°/。的紅細胞。純化或部分純化的D-二聚體，其可以是天然的、合成的或重組的D-二聚體，優選人體D-二聚體，摻加到組合物中，在低于、接近和高于D-二聚體臨床決策點制備含不同水平這種標記的組合物。一份未添加D-二聚體的組合物樣本用作一組對照的基值，具有不同D-二聚體摻加量的樣本用作檢驗的對照。本文所用的術語D-二聚體的"升高水平"，指高于典型內源D-二聚體至少約200ng/ml的D-二聚體含量，這由摻加組合物達到，即添加一定量D-二聚體來產生具有預定升高D-二聚體含量的對照組合物。其它生化標記如用作心臟風險和中風評估的那些，例如TroponinI、CKMB、BNP、hsCRP、同型半胱氨酸、HDL、LDL、膽固醇和BNP前體，也可以摻加到組合物中。然后，具有不同升高D-二聚體含量的組合物再被填充和無菌地封閉和冷藏。優選穩定劑包括在紅細胞組合物中，但也可以單獨添加。合適的穩定劑包括無機穩定劑如氰化物(舉例來說，如氰化鉀)和鐵氰化物(舉例來說，如鐵氰化鉀)離子，和有機穩定劑如包括絲氨酸蛋白酶抑制劑的蛋白酶抑制劑，和如甲醛和戊二醛的交聯劑。組合物優選含有一種或多種抗微生物劑。這些優選加到處理過的血漿中，但也可以單獨添加到組合物中。典型地一種抗微生物劑的組合用于特異的組合物中。合適的抗微生物劑包括環丙沙星、氯霉素、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素和兩性霉素B。本發明的試劑盒包括一種或多種本發明的組合物，任選還有相似性質但不含升高水平D-二聚體的組合物。典型的用于定性分析的試劑盒包含含有升高水平的D-二聚體("陽性樣本")的組合物和不含有升高水平D-二聚體("陰性樣本")的組合物。典型的用于定量分析的試劑盒包含三種組合物一一所謂的"低"、"中"和"高"樣本，其中中樣本和高樣本含有不同升高水平的D-二聚體，低樣本不含有升高數量的D-二聚體。本發明以非限制的方式通過以下實施例舉例，其包括制備本發明組合物的一般方法，以及組合物的一個特殊實施例及其性能。具體實施方式紅細胞的制備人體充盈紅細胞(RBCs)在15。C2500RPM下離心20分鐘。離心后，含有抗凝血劑的殘留血漿被吸出，在充盈細胞頂部的淡黃色外層被去除。然后將細胞再懸浮于等容的等滲溶液中，此溶液含有6.4g/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、2.0g/L的M0PS、0.4g/L的KFeCN、0.2g/L的KCN、0.5g/L的NaF、80.Og/L的PEG和4.Og/L的NaNO"然后再懸浮的細胞再在15'C2500RPM下離心20分鐘。離心后，懸浮液被吸出，細胞在懸浮液中再懸浮，并在2-8'C下儲存12周來穩定細胞。此培育期后，穩定的RBCs再在2-8'C2500RPM下離心20分鐘。去除上清液后，充盈細胞再懸浮于等容的生理鹽水溶液(0.85g/LNaCl，pH-7.2)中，離心步驟再重復一次。在最后一次離心周期中，去除上清液，充盈的RBCs在2-8。C儲存。此階段，充盈細胞的RBC數量典型地大于6x106RBCs/|uL。處理過的血漿的制備生理人體血漿單位用現有技術匯集和去纖維蛋白。所得血清(本文稱為基礎基體)的總蛋白質濃度再通過濃縮基礎基體或用生理鹽水溶液稀釋調整到0至約10g/dL的范圍值，比如到6.Og/dL。然后基礎基體的pH值調整到約4至約9的范圍，比如到約6.8-7.0的值。一種酶抑制劑，氨乙基苯磺酰氟(AEBSF)，加到基礎基體中，最終濃度為30mg/L。抗微生物劑(有典型的值顯示)如環丙沙星(30mg/L)、氯霉素(100mg/L)、慶大霉素(100mg/L)、阿米卡星(40mg/L)、妥布霉素(30mg/L)和/或兩性霉素B(20mg/L)也可加入到基礎基體中。pH再次調整至選擇的值，使用如StagoDiagnosticaSTA-LIATESTD-D1分析的商用分析測定基礎基體中內源D-二聚體。基礎基體典型制劑中的內源D-二聚體濃度典型地小于0.5/ag/mL纖維蛋白等同單位(FEU)。特殊實施例使用天然人體D-二聚體制備40-80jig/mL去纖維蛋白人體血漿中D-二聚體的存儲溶液，結合上述制備的pH為6.8-7.0及蛋白含量為6.Og/dL的基礎基體，來制備d-二聚體濃度為36-44jjg/mL的升高d-二聚體組合物("陽性水平"或"水平2")，即濃度高于兩種商業分析的臨床決策點的濃度(AgenSimpliRED分析中D-二聚體界值是0.20/ig/mL;ClearviewSimplify分析的是0.08pg/mL)。不力口入D-二聚體到基礎基體組合物中來制備一種相似的組合物("陰性水平，，或"水平1")。加入摻料溶液后再測定分析物濃度，分析物濃度通過再摻加或稀釋基礎基體組合物中D-二聚體溶液庫來進行調整，以保證組合物的多水平和臨床有效性。個體庫再通過0.2ym過濾器進行無菌過濾并在2-8'C下儲存。上述制備的穩定的濃縮的紅細胞再加到個體庫中以制備處理過的血漿中RBCs的懸浮液。個體庫中RBC數量調整至3-5xl06RBC/juL。個體庫填充到預先滅菌的小玻璃瓶中并封口，在2-8'C下儲存。產品性能表1包含關于用作D-二聚體定性檢測對照的組合物的典型試驗批量的恢復數據。表1不同檢驗方法下產品的性能<table>complextableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>因而組合物適當履行功能。使用一種加速穩定性模型評價產品在封閉瓶中儲存的穩定性以預測產品儲存期。為此目的，上述產品的瓶子在升高的溫度(25T)下儲存預定時期以觀察分析物分解/降解(推薦的存儲溫度是2-8'C)，在不同培育期結束時分析D-二聚體。這些研究的結果預測當在2-8'C不打開儲存時，產品可以穩定至少l年。通過模擬臨床醫生實際使用條件來評估產品開瓶儲存穩定性。作法是在2-8X:下儲存瓶子，36天中每個工作日把它們從冰箱中取出，允許瓶子在室溫下平衡15分鐘，打開瓶子使得瓶中內容暴露在實驗室環境中，然后關上瓶子并放回瓶子使之在2-8X:儲存。此研究期間分析瓶子樣本。表2顯示關于所制備的試驗批量中D-二聚體的開瓶穩定性結果，即組合物繼續準確履行功能。此研究結果顯示產品在開啟和在2-8'C儲存時，至少穩定36天。表2使用SimpliREDD-二聚體分析的2-8°C下組合物的開瓶穩定性時間(天)水平1水平21陰性陽性7陰性陽性15陰性陽性30陰性陽性36陰性陽性本發明的其它實施例可使用交聯劑如高(2%)和低(0.01%)濃度的戊二醛和曱醛作為穩定劑，典型地用作固定紅細胞以產生不可溶解和可溶解的紅細胞制備物。此外，可以4吏用動物血，尤其是動物紅細胞，來最小化人體血液傳染病原暴露的潛在風險。根據本發明的典型組合物具有一個血細胞比容值(HCT)，紅細胞體積與血液總體積之比，為20至60%，血色素濃度(Hgb)為5至17g/dL。大家知道，本文所描述的實施例和實施方案僅為舉例說明的目的，本領域技術人員將聯想到各種的少量改進或改變，且這些改進或改變屬于本申請的精神和范圍之內，也在所附權利要求范疇之內。為了所有目的本文引用的所有公告、專利、和專利申請通過引用完全結合到本文中。權利要求1.一種全血細胞組合物，包括pH值約4至約9的去纖維蛋白血漿、0至約10g/dL的總蛋白質含量、紅細胞、一種或多種穩定劑和升高水平的D-二聚體。2.根據權利要求l的組合物，其中紅細胞是哺乳動物紅細胞。3.根據權利要求l的組合物，其中紅細胞是人體紅細胞。4.根據權利要求l的組合物，其中紅細胞是鳥類紅細胞。5.根據權利要求l的組合物，其中紅細胞選自人類、豬、牛、馬、山羊、綿羊、雞和火雞的紅細胞。6.根據權利要求l的組合物，其中D-二聚體選自天然的、重組的和合成的D-二聚體。7.根據權利要求1的組合物，其中D-二聚體是人體D-二聚體。8.根據權利要求1的組合物，其中血漿選自哺乳動物血漿和人造血漿。9.根據權利要求l的組合物，其中血漿是哺乳動物血漿。10.根據權利要求l的組合物，其中血漿是人體血漿。11.根據權利要求l的組合物，其中血漿是人造血漿。12.根據權利要求1的組合物，進一步包括一種或多種抗微生物劑。13.根據權利要求12的組合物，其中一種或多種抗微生物劑選自環丙沙星、氯霉素、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素和兩性霉素B。14.根據權利要求l的組合物，其中一種或多種穩定劑包括蛋白酶抑制劑。15.根據權利要求15的組合物，其中蛋白酶抑制劑包括絲氨酸蛋白酶抑制劑。16.根據權利要求1的組合物，其中一種或多種穩定劑包括交聯劑。17.根據權利要求16的組合物，其中交聯劑包括曱醛或戊二醛。18.根據權利要求16的組合物，其中交聯劑的濃度為約0.01%至約2%。19.根據權利要求l的組合物，其中一種或多種穩定劑包括氰化物離子或高鐵氰化物離子。20.根據權利要求19的組合物，其中一種或多種穩定劑包括氰化鉀。21.根據權利要求1的組合物，包括約0.1重量％至約2.0重量％的一種或多種穩定劑。22.根據權利要求l的組合物，其中紅細胞是溶解性紅細胞。23.根據權利要求l的組合物，其中紅細胞是非溶解性的。24.根據權利要求1的組合物，其pH值為約5至約8。25.根據權利要求l的組合物，其pH值為約6至約7。26.根據權利要求1的組合物，包括約1體積％至約80體積％的血漿。27.根據權利要求l的組合物，包括約40體積％至約60體積％的血漿。28.根據權利要求l的組合物，包括約10體積％至約70體積％的紅細胞。29.根據權利要求l的組合物，包括約30體積％至約55體積％的紅細胞。30.根據權利要求l的組合物，其蛋白質含量為約4至約8g/dL。31.根據權利要求l的組合物，其蛋白質含量為約5至約7g/dL。32.根據權利要求l的組合物，進一步包括一種或多種心臟風險評估或中風和凝固標記物。33.根據權利要求32的組合物，其中標記物選自TroponinI、CKMB、BNP、hsCRP、同型半胱氨酸、HDL、LDL、膽固醇和BNP前體。34.根據權利要求l的組合物，包括約20%至約60%的HCT。35.根據權利要求1的組合物，包括約5g/dL至約17g/dL的Hgb。36.—種制備權利要求1所迷組合物的方法，包括組合(a)處理過的血漿，其含有pH值約4至約9的去纖維蛋白血漿以及O至約10g/dL的總蛋白質含量和(b)穩定的紅細胞組合物，隨后加入D-二聚體來提升組合物中D-二聚體含量至顯著超過200ng/mL的值。37.根據權利要求36的方法，其中紅細胞是哺乳動物紅細胞。38.根據權利要求36的方法，其中紅細胞是人體紅細胞。39.根據權利要求36的方法，其中紅細胞是鳥類紅細胞。40.根據權利要求36的方法，其中紅細胞選自人類、豬、牛、馬、山羊、綿羊、雞和火雞的紅細胞。41.根椐權利要求36的方法，其中D-二聚體選自天然的、重組的和合成的D-二聚體。42.根據權利要求36的方法，其中D-二聚體是人體D-二聚體。43.根據權利要求36的方法，其中血漿選自哺乳動物血漿或人造血漿。44.根據權利要求36的方法，其中血漿是人體血漿。45.根據權利要求36的方法，其中血漿是人造血漿。46.根據權利要求36的方法，進一步包括一種或多種抗微生物劑。47.—種監控全血基D-二聚體分析的方法，包括使用權利要求1所述組合物作為對照材料。48.根據權利要求47的方法，包括使用一系列兩種或多種權利要求l所述組合物作為對照材料，所述組合物的每種具有不同升高數量的D-二聚體。全文摘要本發明提供了一種用于D-二聚體診斷檢驗方法的細胞全血D-二聚體組合物，以及它的制備方法。該組合物包括人體紅細胞和處理過的血漿，其中加入了D-二聚體、穩定劑、和任選抗微生物劑，能用作D-二聚體檢驗的標準和對照。文檔編號G01N33/00GK101374410SQ200780003516公開日2009年2月25日申請日期2007年1月25日優先權日2006年1月27日發明者A·艾布羅希姆,J·科爾,S·扎米納斯里,T·霍申請人:Bio-Rad實驗室公司