專利名稱：基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及單細(xì)胞介電譜測試裝置及測試方法，尤其及電旋轉(zhuǎn)的單 細(xì)胞介電譜測試裝置及測試方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞是生物體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的基本單元。人們要了解生命活動(dòng)的規(guī)律， 必須以研究細(xì)胞為基礎(chǔ)，考察細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，探索生命活動(dòng)的規(guī)律。 惡性腫瘤也叫癌癥(cancer)是目前危害人類健康最嚴(yán)重的一類疾病。在美國，惡性 腫瘤的死亡率僅次于心血管疾病而居第二位。據(jù)我國2006年衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展情況統(tǒng)計(jì)公 報(bào)，城市地區(qū)居民死因第一位為惡性腫瘤，其次為腦血管病、心臟病。 若能在單細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞，及時(shí)進(jìn)行早期治療，將使癌癥不再成為不治之癥。事 實(shí)上，癌癥腫瘤形成前，病人血液中已存在少量的異常細(xì)胞。對一些疾病如白血病 (leukemia)，血細(xì)胞的變化更是直接的指標(biāo)。傳統(tǒng)細(xì)胞研究主要是對細(xì)胞群體進(jìn)行分 析，然而細(xì)胞群體分析獲得的統(tǒng)計(jì)平均結(jié)果，抹殺了單細(xì)胞之間的差異，使生物學(xué)及 醫(yī)學(xué)等多領(lǐng)域的發(fā)展受到限制，不利于癌癥的早期診斷。因此，在單細(xì)胞尺度對單個(gè)
活性細(xì)胞的多個(gè)參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析很有必要。目前已建立的可適應(yīng)單細(xì)胞檢測的方法 有形態(tài)學(xué)和非形態(tài)學(xué)方法兩類。形態(tài)學(xué)方法有免疫細(xì)胞化學(xué)(i咖unocytochemistry) 和免疫熒光技術(shù)(immunofluorescence technique)兩種；非形態(tài)學(xué)方法有流式細(xì)胞 術(shù)(flow cytometry)、逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以及免疫-磁分離技術(shù) (immuno-magnetic s印aration)等。應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法和非形態(tài)學(xué)方法，其結(jié)果常顯 現(xiàn)相當(dāng)大的差異，說明這些技術(shù)方法尚不標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范化，有待進(jìn)一步完善。
傳統(tǒng)單細(xì)胞分析技術(shù)存在以下不足1)在細(xì)胞準(zhǔn)備過程中引入許多不可控的人 為因素，影響了細(xì)胞分析的精度；2)在分析過程中需要添加昂貴的生化試劑對目標(biāo)細(xì) 胞進(jìn)行標(biāo)定，破壞了細(xì)胞的微環(huán)境，不適合活性細(xì)胞分析；3)相關(guān)設(shè)備體積龐大且價(jià)
格不菲，并對人員及測試環(huán)境要求較高，不適合野外使用或個(gè)人化、家用化。為解決 上述傳統(tǒng)單細(xì)胞分析技術(shù)的不足，微全分析系統(tǒng)的概念被引入了生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域。 基于微全分析系統(tǒng)概念的單細(xì)胞分析芯片以其微型化、集成化和便攜化方面的巨大優(yōu) 勢在高通量藥物篩選，癌癥早期診斷、快速檢測等領(lǐng)域具有巨大的潛力，而缺乏行之 有效的單細(xì)胞操控、表征及分離技術(shù)是制約其發(fā)展的技術(shù)瓶頸。在不損傷細(xì)胞活性、 不改變細(xì)胞周圍微環(huán)境的條件下實(shí)時(shí)監(jiān)測單細(xì)胞的本征特性參數(shù)，并以此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞表 征、識(shí)別與分類，這是許多科技工作者孜孜以求的目標(biāo)，而基于電旋轉(zhuǎn) (electrorotation)的單細(xì)胞介電頻譜測試技術(shù)可實(shí)現(xiàn)上述物理量的測量并基于細(xì)胞 介電譜特性可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離。
根據(jù)Maxwell-Wagnar界面極化理論可知，細(xì)胞在外加交流電場條件下將會(huì)被動(dòng)的 產(chǎn)生極化(polarization),引起細(xì)胞的介電弛豫(dielectric dispersion)現(xiàn)象。
在頻域測量細(xì)胞的介電常數(shù)e和電導(dǎo)率(T能夠反映細(xì)胞的介電弛豫的特征和細(xì)胞頻域
被動(dòng)特性(或稱介電特性)。對細(xì)胞頻域被動(dòng)特性的研究已成為細(xì)胞電生理學(xué)和細(xì)胞生 物物理學(xué)的研究熱點(diǎn)內(nèi)容之一。由于不同頻域段的訊號(hào)反應(yīng)細(xì)胞不同結(jié)構(gòu)的信息，對 頻域電特性的研究有助于人們了解細(xì)胞極化的界面性質(zhì)及細(xì)胞導(dǎo)電和絕緣特性，驗(yàn)證 生物細(xì)胞的數(shù)學(xué)模型和物理模型的正確性，深入認(rèn)識(shí)和了解細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。影響 細(xì)胞介電特性的因素很多，如細(xì)胞的體積、細(xì)胞膜的面積、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞核的大小， 細(xì)胞質(zhì)的離子濃度及遷移率，細(xì)胞膜表面電荷和細(xì)胞膜跨膜蛋白以及細(xì)胞外部環(huán)境等， 細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的不同以及細(xì)胞內(nèi)部的變化均導(dǎo)致其介電特性的變化，因此，細(xì)胞介 電特性相當(dāng)于細(xì)胞的"指紋"，可鑒別其類型，因此被稱為"介電表征"。在一定頻 域范圍內(nèi)癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的介電表征有非常大的差異。細(xì)胞在寬頻域交流電場條件 下，由低頻到高頻其介電常數(shù)s有五個(gè)基本的介電弛豫特征構(gòu)成了生物細(xì)胞的介電譜 (dielectric spectrum)。其中，"色散和/ 色散較為重要。 一般細(xì)胞表面帶負(fù)電荷，
電荷密度的大小取決于細(xì)胞的種類。由于細(xì)胞表面負(fù)電荷與溶液中正離子的切向力作 用，產(chǎn)生了a色散。a色散出現(xiàn)在低頻區(qū)，正常細(xì)胞與異常細(xì)胞表面荷電不同，導(dǎo)致 了a色散差異性。因此，a色散可用于臨床診斷。細(xì)胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)在電場
中類似于一個(gè)電容器的性質(zhì)，因此，出現(xiàn)-色散。-色散對于細(xì)胞分析的一個(gè)應(yīng)用是 腫瘤組織的識(shí)別和細(xì)胞生物量的分析。細(xì)胞數(shù)越大，p色散越大，這是因?yàn)樗兰?xì)胞對于β色散有很大貢獻(xiàn)。β色散與細(xì)胞膜的完整性和活性有關(guān)。因此，β色散在細(xì)胞生物分析中有重要應(yīng)用。
研究細(xì)胞介電特性的方法很多，如交流阻抗測量法，電旋轉(zhuǎn)測量法，介電譜法
(Dielectrospectroscopy Method),介電泳法(Dielectrophoresis Method)以及微 小吸管法(Micropipet Method)等，其中電旋轉(zhuǎn)測量法作為一種非破壞性技術(shù)，以其 電極結(jié)構(gòu)簡單，便于小型化和集成，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制與分離等優(yōu)勢獲得廣泛應(yīng)用并 已實(shí)現(xiàn)商品化，如德國的evotec technologies,中國的博奧等均持有相關(guān)專利及商 品化測試芯片。但是目前的測試芯片及其測試方法并不理想，如在測量細(xì)胞介電屬性 時(shí)，很難同時(shí)捕獲與旋轉(zhuǎn)單細(xì)胞，且細(xì)胞貼近槽道基面，受到底面摩擦力的干擾，測 量精度低，不適合高通量的單細(xì)胞并行測量，自動(dòng)化程度低，細(xì)胞的進(jìn)樣和分離也比 較困難，采用雙層四分電極雖然可以抑制細(xì)胞在豎直方向的逃逸，但細(xì)胞所處的范圍 仍然很多，旋轉(zhuǎn)的同時(shí)還在平動(dòng)，故細(xì)胞旋轉(zhuǎn)穩(wěn)定性差，不便于測量。采用光鑷固定 細(xì)胞，而電旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)細(xì)胞，雖然可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的定軸轉(zhuǎn)動(dòng)，懸浮測量以及細(xì)胞的進(jìn)樣 和分離，但也有一定的局限性。首先，光鑷需要強(qiáng)匯聚激光束不適合細(xì)胞的長時(shí)間捕 獲(不能大于5分鐘)，易于造成細(xì)胞的光損傷，且光捕獲所需激光束會(huì)造成細(xì)胞周圍 流體溫度局部升高，形成對流，進(jìn)而影響細(xì)胞的電旋轉(zhuǎn)測量精度。其次，光鑷的捕獲 范圍有限(<1/^)不適合微米或亞微米尺度細(xì)胞的捕獲。再次，光鑷移動(dòng)范圍很小，
不適合單細(xì)胞的大規(guī)模并行捕獲與操控，無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)樣、測試、分離。最后， 光鑷的引進(jìn)使得整個(gè)測試系統(tǒng)的成本急劇上升，不易于推廣和使用。針對上述問題， 本光誘導(dǎo)介電泳輔助的單細(xì)胞介電譜測試技術(shù)在繼承傳統(tǒng)電旋轉(zhuǎn)測試技 術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，本實(shí)用新型提出利用光誘導(dǎo)介電泳來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的光鑷以 實(shí)現(xiàn)活性單細(xì)胞的大規(guī)模并行操控，并結(jié)合機(jī)器視覺、模式識(shí)別技及路徑 規(guī)劃技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高通量，全自動(dòng)進(jìn)樣、測試以及分離。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本實(shí)用新型提供一種基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試 裝置，以解決現(xiàn)有技術(shù)中不能實(shí)現(xiàn)活性單細(xì)胞的大規(guī)模并行操控；不能實(shí) 現(xiàn)細(xì)胞的髙通量、全自動(dòng)進(jìn)樣、測試及分離的缺陷。
技術(shù)方案為達(dá)到上述技術(shù)目的，本實(shí)用新型釆用的技術(shù)方案是該基于復(fù)合介 電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置包括光誘導(dǎo)介電泳芯片、機(jī)器視覺裝置、視 覺伺服裝置和虛擬電極直寫裝置；光誘導(dǎo)介電泳芯片放置于支撐裝置上， 用于放置單細(xì)胞懸浮液，所述光誘導(dǎo)介電泳芯片為三層漢堡結(jié)構(gòu)，所述三 層漢堡結(jié)構(gòu)自上而下依次為導(dǎo)電玻璃層，微通道，光電導(dǎo)芯片；在導(dǎo)電玻 璃層上分別設(shè)有進(jìn)口和出口；光電導(dǎo)芯片自下而上依次為導(dǎo)電玻璃襯底、 n+型光電導(dǎo)層、本征光電導(dǎo)層、絕緣層；電旋轉(zhuǎn)電極制作在絕緣層上；所 述光誘導(dǎo)介電泳芯片的微通道空腔依次分為進(jìn)樣區(qū)、測試區(qū)和排布區(qū)；機(jī) 器視覺裝置位于光誘導(dǎo)介電泳芯片上方，機(jī)器視覺裝置用于獲取單細(xì)胞實(shí) 時(shí)圖像序列并將所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像信號(hào)；視覺伺服 裝置的信號(hào)輸入端與機(jī)器視覺裝置的信號(hào)輸出端連接，該視覺伺服裝置用 于對所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列中細(xì)胞進(jìn)行定位，提取所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像 序列中的圖像中單細(xì)胞的特征，得到所述單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，并對所述單 細(xì)胞進(jìn)行分類編碼，根據(jù)得到的所述單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，生成該單細(xì)胞的 虛擬電極圖案；將所述生成的虛擬電極圖案進(jìn)行路徑規(guī)劃，按所述路徑規(guī) 劃路線運(yùn)動(dòng)，虛擬電極運(yùn)動(dòng)帶動(dòng)所述單細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，實(shí)時(shí)監(jiān)控所述單細(xì)胞的 運(yùn)動(dòng)，并反饋校正虛擬電極圖案運(yùn)動(dòng)，從而獲取并測試所述運(yùn)送至測試區(qū) 的單細(xì)胞的介電頻譜；虛擬電極直寫裝置的信號(hào)輸入端與圖像處理裝置的 信號(hào)輸出端相連，將經(jīng)過視覺伺服裝置處理的圖像投影到光誘導(dǎo)介電泳芯 片的光電導(dǎo)層上。
優(yōu)選的，機(jī)器視覺裝置包括位于光誘導(dǎo)介電泳芯片上方的觀測物鏡， 該觀測物鏡用于觀測放置在光誘導(dǎo)介電泳芯片上的單細(xì)胞懸浮液；位于觀 測物鏡上方的電荷耦合裝置，該電荷耦合裝置用于獲取通過觀測物鏡觀測 到的所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像，將所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；觀測物 鏡和電荷耦合裝置的軸線分別垂直于光誘導(dǎo)介電泳芯片；與電荷耦合裝置 的電信號(hào)輸出端相連的圖像采集轉(zhuǎn)換單元，圖像采集轉(zhuǎn)換單元用于采集電 荷耦合裝置輸出的電信號(hào)并將所述電信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖像信號(hào)。
優(yōu)選的，視覺伺服裝置包括視覺定位模塊，用于將機(jī)器視覺裝置獲取 的所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列中的細(xì)胞進(jìn)行定位；特征提取與分類編碼模塊，用于提取定位后的所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像中細(xì)胞的特征，得到所述單細(xì) 胞的位置坐標(biāo)，并對所述單細(xì)胞進(jìn)行分類編碼；虛擬電極圖案生成模塊， 用于根據(jù)得到的所述單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，生成該單細(xì)胞的虛擬電極圖案圖 像；路徑規(guī)劃與實(shí)時(shí)重構(gòu)模塊，用于將生成的所述虛擬電極圖案進(jìn)行路徑 規(guī)劃，按規(guī)劃路線運(yùn)動(dòng)；視覺追蹤模塊，用于實(shí)時(shí)監(jiān)控所述單細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)， 并反饋校正虛擬電極圖案運(yùn)動(dòng)；介電頻譜自動(dòng)測試模塊，用于獲取運(yùn)送至 測試區(qū)的的單細(xì)胞的介電頻譜。
優(yōu)選的，虛擬電極直寫裝置包括驅(qū)動(dòng)電路板、數(shù)字微鏡芯片、驅(qū)動(dòng)光 源、準(zhǔn)直光路單元、狹窄光路單元和操作物鏡；驅(qū)動(dòng)電路板的信號(hào)輸入端 與視覺伺服裝置的信號(hào)輸出端相連，驅(qū)動(dòng)光源將光照射在數(shù)字微鏡芯片 上，驅(qū)動(dòng)電路板此時(shí)控制數(shù)字微鏡芯片，利用幾何光學(xué)將所述虛擬電極圖 案經(jīng)位于數(shù)字微鏡芯片下方的準(zhǔn)直光路單元、狹窄光路單元、操作物鏡將 所述虛擬電極圖案投影到光誘導(dǎo)介電泳芯片的光電導(dǎo)層上；準(zhǔn)直光路單元 用于將發(fā)散光會(huì)聚成平行光；狹窄光路單元用于將大直徑平行光束縮為小 直徑平行光束；準(zhǔn)直光路單元與縮放光路單元共光軸，所述光軸垂直于數(shù) 字微鏡芯片的表面；位于光誘導(dǎo)介電泳芯片下方的操作物鏡的光軸垂直于 光誘導(dǎo)介電泳芯片光電導(dǎo)芯片。
優(yōu)選的，光電導(dǎo)芯片依次包括氧化錫銦玻璃襯底、n+型氫化非晶硅層(122)、 本征態(tài)氫化非晶硅層和氮化硅層。
優(yōu)選的，電旋轉(zhuǎn)電極為氧化錫銦透明薄膜材料。
有益效果本實(shí)用新型提供的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試 裝置基于機(jī)器視覺技術(shù)，是通過光學(xué)裝置非接觸地接受和處理細(xì)胞在芯片 中真實(shí)運(yùn)動(dòng)和旋轉(zhuǎn)的圖像；通過對圖像進(jìn)行數(shù)字化處理，選取模板進(jìn)行模 板匹配，獲得細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)位置坐標(biāo)的信息，進(jìn)而實(shí)時(shí)校正和控制虛擬電極 圖案的運(yùn)動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)；通過對圖像進(jìn)行數(shù)字化處理，根據(jù)像 素分布和亮度等信息，進(jìn)行單細(xì)胞旋轉(zhuǎn)速度的判別，進(jìn)而根據(jù)判別的結(jié)果 評價(jià)細(xì)胞的介電特性。與同類基于機(jī)器視覺的非接觸測試法比較，本實(shí)用 新型提供的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置主要是利用了光 誘導(dǎo)介電泳的特性，光誘導(dǎo)介電泳操控的優(yōu)勢在于虛擬電極圖案是由投影的圖案決定
的，因此可根據(jù)實(shí)際操控環(huán)境中，各單細(xì)胞的位置，實(shí)時(shí)重構(gòu)電極，完成單細(xì)胞的捕 獲，捕獲的各單細(xì)胞之間是相對獨(dú)立，因此可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的并行操控，全自動(dòng)進(jìn)樣， 測試以及分離，所以能實(shí)現(xiàn)活性單細(xì)胞的大規(guī)模并行操控，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高通 量，全自動(dòng)進(jìn)樣、測試以及分離，從而為單細(xì)胞分析提供了較廣闊的應(yīng)用 前景。
圖1為本實(shí)用新型提供的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置結(jié)構(gòu)示 意圖2為本實(shí)用新型提供的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置中 的光誘導(dǎo)介電泳芯片的結(jié)構(gòu)示意圖3為本實(shí)用新型提供的用于基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置 光誘導(dǎo)介電泳芯片的俯視圖。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型提供一套完整的適用于單細(xì)胞介電譜測試的裝置和方法， 本光誘導(dǎo)介電泳輔助的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試方法基于機(jī)器視覺技術(shù)對 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度和旋轉(zhuǎn)速度的測量，是通過對細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過程中每一時(shí)刻的圖 像進(jìn)行采集和數(shù)字化處理得到的。本光誘導(dǎo)介電泳輔助的單細(xì)胞介電譜自 動(dòng)測試方法主要是基于光誘導(dǎo)介電泳力實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞并行捕獲、進(jìn)樣、定位、 定軸旋轉(zhuǎn)以及最終分離，通過對微芯片基片上的兩對微電極上施加強(qiáng)度相 等、相鄰相位差均為90度的交流電壓信號(hào)形成旋轉(zhuǎn)電場使得細(xì)胞在旋轉(zhuǎn) 電場作用下發(fā)生旋轉(zhuǎn)，并基于機(jī)器視覺、模式識(shí)別及路徑規(guī)劃技術(shù)實(shí)現(xiàn)細(xì) 胞的形態(tài)學(xué)識(shí)別與多細(xì)胞運(yùn)動(dòng)軌跡實(shí)時(shí)追蹤，光誘導(dǎo)介電泳虛擬電極模式 的實(shí)時(shí)重構(gòu)與路徑規(guī)劃以及細(xì)胞旋轉(zhuǎn)測量的自動(dòng)記錄與實(shí)時(shí)圖像處理。
本實(shí)用新型提供的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置，該基于復(fù) 合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置包括如圖1所示，光誘導(dǎo)介電泳芯片 100、機(jī)器視覺裝置200、視覺伺服裝置300和虛擬電極直寫裝置400;光 誘導(dǎo)介電泳芯片IOO放置于支撐裝置130上，用于放置單細(xì)胞懸浮液，所
述光誘導(dǎo)介電泳芯片100為三層漢堡結(jié)構(gòu)，如圖2所示，所述三層漢堡結(jié) 構(gòu)自上而下依次為導(dǎo)電玻璃層101，微通道102，光電導(dǎo)芯片103;在導(dǎo)電 玻璃層101上分別設(shè)有進(jìn)口 lll和出口 112;光電導(dǎo)芯片103自下而上依 次為導(dǎo)電玻璃襯底125、n+型光電導(dǎo)層122、本征光電導(dǎo)層123、絕緣層124; 電旋轉(zhuǎn)電極121制作在絕緣層124上；所述光誘導(dǎo)介電泳芯片100的微通 道102空腔依次分為進(jìn)樣區(qū)、測試區(qū)和排布區(qū)；導(dǎo)電玻璃襯底125可以為 氧化錫銦玻璃襯底、n+型光電導(dǎo)層122可以為n+型氫化非晶硅層、本征光電導(dǎo)層 123可以為本征態(tài)氫化非晶硅層和絕緣層124可以為氮化硅層124;電旋轉(zhuǎn)電極 121為氧化錫銦透明薄膜材料；微通道102的材料可為聚二甲基硅氧烷或 SU-8光刻膠。波形發(fā)生器140信號(hào)輸出端接光誘導(dǎo)介電泳芯片的導(dǎo)電玻璃 層101和光電導(dǎo)芯片103的導(dǎo)電玻璃襯底125。
在測試區(qū)中，氮化硅表層上安裝有四相位電旋轉(zhuǎn)電極121，待測試的液體經(jīng)注射 泵由進(jìn)口 111注入，依次經(jīng)過進(jìn)樣區(qū)，測試區(qū)和排列區(qū)。芯片光導(dǎo)材料選擇氫化 非晶硅，明暗光導(dǎo)率相差三個(gè)量級(jí)以上，電旋轉(zhuǎn)電極選用ITO透明薄膜材 料制作，以便于投影光線穿透，無遮擋，實(shí)驗(yàn)時(shí)須將光誘導(dǎo)介電泳芯片置 于顯微鏡載物臺(tái)上進(jìn)行。
機(jī)器視覺裝置200位于光誘導(dǎo)介電泳芯片100上方，機(jī)器視覺裝置200 用于獲取單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列并將所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列轉(zhuǎn)換為數(shù)字 圖像信號(hào)；視覺伺服裝置300的信號(hào)輸入端與機(jī)器視覺裝置200的信號(hào)輸 出端連接，該視覺伺服裝置300用于對所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列中細(xì)胞進(jìn) 行定位，提取所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列中的圖像中單細(xì)胞的特征，得到所 述單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，并對所述單細(xì)胞進(jìn)行分類編碼，根據(jù)得到的所述單 細(xì)胞的位置坐標(biāo)，生成該單細(xì)胞的虛擬電極圖案；將所述生成的虛擬電極 圖案進(jìn)行路徑規(guī)劃，按所述路徑規(guī)劃路線運(yùn)動(dòng)，虛擬電極運(yùn)動(dòng)帶動(dòng)所述單 細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，實(shí)時(shí)監(jiān)控所述單細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，并反饋校正虛擬電極圖案運(yùn)動(dòng)， 從而獲取并測試所述運(yùn)送至測試區(qū)的單細(xì)胞的介電頻譜；虛擬電極直寫裝 置400的信號(hào)輸入端與圖像處理裝置300的信號(hào)輸出端相連，將經(jīng)過視覺 伺服裝置300處理的圖像投影到光誘導(dǎo)介電泳芯片IOO的光電導(dǎo)層123上。
機(jī)器視覺裝置200包括位于光誘導(dǎo)介電泳芯片100上方的觀測物鏡
11201，該觀測物鏡201用于觀測放置在光誘導(dǎo)介電泳芯片100上的單細(xì)胞 懸浮液；位于觀測物鏡201上方的電荷耦合裝置202，該電荷耦合裝置202 用于獲取通過觀測物鏡201觀測到的所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像，將所述單細(xì)胞 實(shí)時(shí)圖像轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；觀測物鏡201和電荷耦合裝置202的軸線分別垂 直于光誘導(dǎo)介電泳芯片100;與電荷耦合裝置202的電信號(hào)輸出端相連的 圖像采集轉(zhuǎn)換單元203,圖像采集轉(zhuǎn)換單元203用于采集電荷耦合裝置202 輸出的電信號(hào)并將所述電信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖像信號(hào)。
選用顯微鏡的上光路光源照明，將光誘導(dǎo)介電泳芯片IOO放在顯微鏡 載物臺(tái)上，調(diào)節(jié)焦距，使得圖像上突出單細(xì)胞輪廓；單細(xì)胞隨捕獲電極運(yùn) 動(dòng)或在測試區(qū)電旋轉(zhuǎn)電場作用下旋轉(zhuǎn)同時(shí)，單細(xì)胞運(yùn)動(dòng)或旋轉(zhuǎn)的圖像通過 觀測物鏡上方的CCD攝像機(jī)201成像在CCD感光面上，再由CCD傳感器轉(zhuǎn) 化為電信號(hào)；最后由圖像采集轉(zhuǎn)換單元203完成對CCD攝像機(jī)201輸出的 視頻信號(hào)的采集和數(shù)字化轉(zhuǎn)換任務(wù)，以供視覺伺服裝置300進(jìn)一步的處理。
視覺伺服裝置300包括視覺定位模塊，用于將機(jī)器視覺裝置200獲取 的所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列中的細(xì)胞進(jìn)行定位；特征提取與分類編碼模 塊，用于提取定位后的所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像中細(xì)胞的特征，得到所述單細(xì) 胞的位置坐標(biāo)，并對所述單細(xì)胞進(jìn)行分類編碼；虛擬電極圖案生成模塊， 用于根據(jù)得到的所述單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，生成該單細(xì)胞的虛擬電極圖案圖 像；路徑規(guī)劃與實(shí)時(shí)重構(gòu)模塊，用于將生成的所述虛擬電極圖案進(jìn)行路徑 規(guī)劃，按規(guī)劃路線運(yùn)動(dòng)；視覺追蹤模塊，用于實(shí)時(shí)監(jiān)控所述單細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)， 并反饋校正虛擬電極圖案運(yùn)動(dòng)；介電頻譜自動(dòng)測試模塊，用于獲取運(yùn)送至 測試區(qū)的的單細(xì)胞的介電頻譜。
視覺伺服裝置300包含了一臺(tái)高性能PC機(jī)301和圖像處理支持軟件
302
PC機(jī)301配置為超線程技術(shù)的高性能計(jì)算機(jī)。圖像處理支持軟件302 是基于圖像化編程語言編寫的實(shí)時(shí)圖像采集和處理程序，該程序具有交互 式界面，通過對機(jī)器視覺裝置釆集所得的圖像進(jìn)行數(shù)字化處理后，進(jìn)一步 獲得細(xì)胞的電旋轉(zhuǎn)速度。圖像處理支持軟件302可以實(shí)時(shí)地采集并顯示細(xì) 胞測試各階段的圖像，并通過這些圖像來測量和記錄細(xì)胞各個(gè)時(shí)刻的旋轉(zhuǎn)速度，用戶可以設(shè)置程序的采集間隔，細(xì)胞的整個(gè)運(yùn)動(dòng)過程同時(shí)可以記錄 為視頻動(dòng)畫文件。圖像處理支持軟件302同時(shí)控制著虛擬電極圖案繪制程 序的運(yùn)行。計(jì)算機(jī)的顯卡的模擬信號(hào)輸出端接數(shù)字微鏡裝置驅(qū)動(dòng)板信號(hào)接入口，驅(qū) 動(dòng)板根據(jù)傳說過來的信號(hào)控制微鏡的翻轉(zhuǎn)，從而控制是否反射光線，從而決定了圖案。 虛擬電極直寫裝置400包括驅(qū)動(dòng)電路板401、數(shù)字微鏡芯片402、驅(qū) 動(dòng)光源407、準(zhǔn)直光路單元403、狹窄光路單元404和操作物鏡406;驅(qū)動(dòng) 電路板401的信號(hào)輸入端與視覺伺服裝置300的信號(hào)輸出端相連，驅(qū)動(dòng)光 源407將光照射在數(shù)字微鏡芯片402上，驅(qū)動(dòng)電路板401此時(shí)控制數(shù)字微 鏡芯片402，利用幾何光學(xué)將所述虛擬電極圖案經(jīng)位于數(shù)字微鏡芯片402 下方的準(zhǔn)直光路單元403、狹窄光路單元404、操作物鏡406將所述虛擬 電極圖案投影到光誘導(dǎo)介電泳芯片100的光電導(dǎo)層123上；準(zhǔn)直光路單元 403用于將發(fā)散光會(huì)聚成平行光；狹窄光路單元404用于將大直徑平行光 束縮為小直徑平行光束；準(zhǔn)直光路單元403與縮放光路單元404共光軸， 所述光軸垂直于數(shù)字微鏡芯片402的表面；位于光誘導(dǎo)介電泳芯片IOO下 方的操作物鏡406的光軸垂直于光誘導(dǎo)介電泳芯片100光電導(dǎo)芯片103。 虛擬電極直寫裝置400中在狹窄光路單元404和操作物鏡406只覺安還可 以包括反射棱鏡405。
DMD驅(qū)動(dòng)板401和DMD芯片401由商品化DLP投影儀改造而來。虛擬 電極直寫裝置400中，需保證準(zhǔn)直光路單元403和狹窄光路單元404共光 軸，該光軸垂直于DMD芯片401表面，操作物鏡406的光軸需垂直于光誘 導(dǎo)介電泳芯片l基底面。數(shù)字微鏡芯片402上面密密麻麻地排列著80萬~100萬 面微鏡(跟分辨率有關(guān)，800*600還是1024*768)，每個(gè)微鏡可以獨(dú)立向正負(fù)方向翻 轉(zhuǎn)10度，并可以每秒鐘翻轉(zhuǎn)65000次，光源通過這些微鏡反射到屏幕上直接形成圖 像。準(zhǔn)直光路單元403將發(fā)散的光收縮成平行光，減少光損失，提高投影光路的質(zhì)量。
本實(shí)用新型提供的用于本實(shí)用新型提供的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電 譜自動(dòng)測試裝置的測試方法，包括如下步驟-
步驟l:如圖3所示，通過機(jī)器視覺裝置200獲取置于光誘導(dǎo)介電泳芯片100微 通道中的被剌單細(xì)胞的初始圖像序列；通過視覺伺服裝置300中的視覺定位模塊將所 述圖像序列的被測單細(xì)胞定位；通過視覺伺服裝置300中的特征提取與分類編碼模塊獲取所述圖像序列中的被測單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，并對所述被測單細(xì)胞進(jìn)行分類編碼； 通過視覺伺服裝置300中的虛擬電極圖案生成模塊生成捕獲被測單細(xì)胞的虛擬電極圖 案；通過視覺伺服裝置300中的路徑規(guī)劃和實(shí)時(shí)重構(gòu)模塊，規(guī)劃所述虛擬電極圖案的 運(yùn)動(dòng)路徑，使所述被測單細(xì)胞按規(guī)劃路徑運(yùn)動(dòng)；通過視覺伺服裝置300中的介電頻譜 自動(dòng)測試模塊測試輸運(yùn)至光誘導(dǎo)介電泳芯片100的電旋轉(zhuǎn)電極121內(nèi)測試區(qū)的被測單 細(xì)胞介電頻譜；
步驟2:通過視覺伺服裝置300中的視覺定位模塊將所述被測單細(xì)胞的初始圖像 序列的被測單細(xì)胞定位；
步驟3:通過視覺伺服裝置300中的特征提取與分類編碼模塊獲取所述被測單細(xì) 胞的初始圖像序列中被測單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，并對所述被測單細(xì)胞進(jìn)行分類編碼；
步驟4:通過視覺伺服裝置300中的虛擬電極圖案生成模塊用于生成捕獲所述被 測單細(xì)胞的虛擬電極圖案；
步驟5:將所述虛擬電極圖案通過虛擬電極直寫裝置400投影到光誘導(dǎo)介電泳芯 片100的本征光電導(dǎo)層123上；
步驟6:在光誘導(dǎo)介電泳芯片的導(dǎo)電玻璃層101和導(dǎo)電玻璃襯底125接波形發(fā)生 器140，在所述微通道102內(nèi)形成一個(gè)電場，本征光導(dǎo)層123的光導(dǎo)材料在亮暗態(tài)下 的電導(dǎo)率不同，形成不同的分壓，從而是的微通道內(nèi)的電場是非均勻的，在非均勻電 場的作用下，形成介電泳力，利用產(chǎn)生的光誘導(dǎo)介電泳操縱力捕獲被測單細(xì)胞；
步驟7:所述虛擬電極圖案運(yùn)動(dòng)帶動(dòng)了相應(yīng)捕獲的單細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，將被測單細(xì)胞輸 運(yùn)至測試區(qū)后，在電旋轉(zhuǎn)電場和光誘導(dǎo)介電泳力的共同作用下，被測單細(xì)胞定軸轉(zhuǎn)動(dòng)； 步驟8:通過調(diào)整波形發(fā)生器150來變換頻率，通過視覺伺服裝置300中介電頻譜自動(dòng)測試模塊，完成被測單細(xì)胞的介電頻譜測試，獲得被測單細(xì)胞的介電特性。
步驟9:完成測試的單細(xì)胞，根據(jù)測得的介電特性，從測試區(qū)輸運(yùn)至排布區(qū)進(jìn)行分 類排布。
含有待測試細(xì)胞的溶液由光誘導(dǎo)介電泳芯片的進(jìn)口進(jìn)入微通道，機(jī)器視覺裝置獲 得初始圖像，圖像處理支持軟件對初始圖像進(jìn)行圖像預(yù)處理、圖像分割、特征提取， 進(jìn)而獲得各細(xì)胞的坐標(biāo)位置，將獲得坐標(biāo)位置信息傳遞給虛擬電極圖案繪圖軟件(可 以用Flash軟件或Micro Office PowerPoint 二次開發(fā)而得)，將繪制的圖像通過顯卡的 模擬信號(hào)輸出口接入數(shù)字微鏡裝置驅(qū)動(dòng)電路板的信號(hào)接入口，驅(qū)動(dòng)光源射出的光線經(jīng)
數(shù)字微鏡芯片反射，經(jīng)過準(zhǔn)直光路、縮放光路、操縱物鏡，形成的虛擬電極圖案投影 到光導(dǎo)層上。利用光敏材料氫化非晶硅的特性，亮暗態(tài)下的電導(dǎo)率不同，在間隔層空 間中產(chǎn)生非均勻電場，進(jìn)而產(chǎn)生介電泳操縱力，捕獲細(xì)胞。虛擬電極圖案的移動(dòng)，帶 動(dòng)了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。在運(yùn)動(dòng)過程中，上方電荷耦合裝置實(shí)時(shí)采集運(yùn)動(dòng)圖像信息，圖像處理 支持軟件對輸運(yùn)過程實(shí)時(shí)監(jiān)控；在細(xì)胞進(jìn)入測試區(qū)后，在電旋轉(zhuǎn)電極產(chǎn)生的旋轉(zhuǎn)電場 和光誘導(dǎo)介電泳的作用下，做定軸轉(zhuǎn)動(dòng)。通過機(jī)器視覺裝置可以獲得圖片序列，通過 圖像支持軟件處理，可以到細(xì)胞在該頻率下的介電屬性，然后改變頻率，進(jìn)行同樣的 測試。最終得到細(xì)胞的介電頻譜。根據(jù)所測得的介電參數(shù)利用光誘導(dǎo)介電泳，從測試 區(qū)輸運(yùn)至排列區(qū)。
以上的顯微鏡可以選用Nikon ECLIPSE 50i型號(hào)，CCD攝像機(jī)可以選 用Nikon DXM1200F型號(hào)，操縱物鏡可以選用CFILU Plan Epi IOX型號(hào)， 波形發(fā)生器可以選用Agilent 33250A型號(hào)。
權(quán)利要求1、一種基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置，其特征在于，該基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置包括光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)、機(jī)器視覺裝置(200)、視覺伺服裝置(300)和虛擬電極直寫裝置(400)；光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)放置于支撐裝置(130)上，用于放置單細(xì)胞懸浮液，所述光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)為三層漢堡結(jié)構(gòu)，所述三層漢堡結(jié)構(gòu)自上而下依次為導(dǎo)電玻璃層(101)，微通道(102)，光電導(dǎo)芯片(103)；在導(dǎo)電玻璃層(101)上分別設(shè)有進(jìn)口(111)和出口(112)；光電導(dǎo)芯片(103)自下而上依次為導(dǎo)電玻璃襯底(125)、n+型光電導(dǎo)層(122)、本征光電導(dǎo)層(123)、絕緣層(124)；電旋轉(zhuǎn)電極(121)制作在絕緣層(124)上；所述光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)的微通道(102)空腔依次分為進(jìn)樣區(qū)、測試區(qū)和排布區(qū)；機(jī)器視覺裝置(200)位于光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)上方，機(jī)器視覺裝置(200)用于獲取單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列并將所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列轉(zhuǎn)換為數(shù)字圖像信號(hào)；視覺伺服裝置(300)的信號(hào)輸入端與機(jī)器視覺裝置(200)的信號(hào)輸出端連接，該視覺伺服裝置(300)用于對所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列中細(xì)胞進(jìn)行定位，提取所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列中的圖像中單細(xì)胞的特征，得到所述單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，并對所述單細(xì)胞進(jìn)行分類編碼，根據(jù)得到的所述單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，生成該單細(xì)胞的虛擬電極圖案；將所述生成的虛擬電極圖案進(jìn)行路徑規(guī)劃，按所述路徑規(guī)劃路線運(yùn)動(dòng)，虛擬電極運(yùn)動(dòng)帶動(dòng)所述單細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，實(shí)時(shí)監(jiān)控所述單細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，并反饋校正虛擬電極圖案運(yùn)動(dòng)，從而獲取并測試所述運(yùn)送至測試區(qū)的單細(xì)胞的介電頻譜；虛擬電極直寫裝置(400)的信號(hào)輸入端與圖像處理裝置(300)的信號(hào)輸出端相連，將經(jīng)過視覺伺服裝置(300)處理的圖像投影到光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)的光電導(dǎo)層(123)上。
2、如權(quán)利要求l所述的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置，其特 征在于，機(jī)器視覺裝置(200)包括位于光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)上方 的觀測物鏡(201)，該觀測物鏡(201)用于觀測放置在光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)上的單細(xì)胞懸浮液；位于觀測物鏡(201)上方的電荷耦合裝 置(202)，該電荷耦合裝置(202)用于獲取通過觀測物鏡(201)觀測到的所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像，將所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像轉(zhuǎn)換為電信號(hào)；觀測 物鏡(201)和電荷耦合裝置(202)的軸線分別垂直于光誘導(dǎo)介電泳芯 片(100);與電荷耦合裝置(202)的電信號(hào)輸出端相連的圖像采集轉(zhuǎn)換 單元(203)，圖像采集轉(zhuǎn)換單元(203)用于采集電荷耦合裝置(202) 輸出的電信號(hào)并將所述電信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字圖像信號(hào)。
3、 如權(quán)利要求l所述的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置，其特 征在于，視覺伺服裝置(300)包括視覺定位模塊，用于將機(jī)器視覺裝置(200)獲取的所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像序列中的細(xì)胞進(jìn)行定位；特征提取與 分類編碼模塊，用于提取定位后的所述單細(xì)胞實(shí)時(shí)圖像中細(xì)胞的特征， 得到所述單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，并對所述單細(xì)胞進(jìn)行分類編碼；虛擬電極 圖案生成模塊，用于根據(jù)得到的所述單細(xì)胞的位置坐標(biāo)，生成該單細(xì)胞 的虛擬電極圖案圖像；路徑規(guī)劃與實(shí)時(shí)重構(gòu)模塊，用于將生成的所述虛 擬電極圖案進(jìn)行路徑規(guī)劃，按規(guī)劃路線運(yùn)動(dòng)；視覺追蹤模塊，用于實(shí)時(shí) 監(jiān)控所述單細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，并反饋校正虛擬電極圖案運(yùn)動(dòng)；介電頻譜自動(dòng) 測試模塊，用于獲取運(yùn)送至測試區(qū)的的單細(xì)胞的介電頻譜。
4、 如權(quán)利要求l所述的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置，其特 征在于，虛擬電極直寫裝置(400)包括驅(qū)動(dòng)電路板(401)、數(shù)字微鏡芯 片(402)、驅(qū)動(dòng)光源(407)、準(zhǔn)直光路單元(403)、狹窄光路單元(404) 和操作物鏡(406);驅(qū)動(dòng)電路板(401)的信號(hào)輸入端與視覺伺服裝置(300) 的信號(hào)輸出端相連，驅(qū)動(dòng)光源(407)將光照射在數(shù)字微鏡芯片(402) 上，驅(qū)動(dòng)電路板(401)此時(shí)控制數(shù)字微鏡芯片(402)，利用幾何光學(xué)將 所述虛擬電極圖案經(jīng)位于數(shù)字微鏡芯片(402 )下方的準(zhǔn)直光路單元(403)、狹窄光路單元(404)、操作物鏡(406)將所述虛擬電極圖案投 影到光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)的光電導(dǎo)層U23)上；準(zhǔn)直光路單元(403) 用于將發(fā)散光會(huì)聚成平行光；狹窄光路單元(404)用于將大直徑平行光 束縮為小直徑平行光束；準(zhǔn)直光路單元(403)與縮放光路單元(404) 共光軸，所述光軸垂直于數(shù)字微鏡芯片(402)的表面；位于光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)下方的操作物鏡(406)的光軸垂直于光誘導(dǎo)介電泳芯片 (100)光電導(dǎo)芯片(103)。
5、 如權(quán)利要求l所述的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置，其特 征在于，光電導(dǎo)芯片(103)依次包括氧化錫銦玻璃襯底(125)、 n+型氫化非晶 硅層(122)、本征態(tài)氫化非晶硅層(123)和氮化硅層(124)。
6、 如權(quán)利要求1所述的基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置，其特 征在于，電旋轉(zhuǎn)電極(121)為氧化錫銦透明薄膜材料。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置，該基于復(fù)合介電泳的單細(xì)胞介電譜自動(dòng)測試裝置包括光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)、機(jī)器視覺裝置(200)、視覺伺服裝置(300)和虛擬電極直寫裝置(400)；光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)放置于支撐裝置(130)上，用于放置單細(xì)胞懸浮液，所述光誘導(dǎo)介電泳芯片(100)為三層漢堡結(jié)構(gòu)，所述三層漢堡結(jié)構(gòu)自上而下依次為導(dǎo)電玻璃層(101)，微通道(102)，光電導(dǎo)芯片(103)；在導(dǎo)電玻璃層(101)上分別設(shè)有進(jìn)口(111)和出口(112)；本實(shí)用新型可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的并行操控，全自動(dòng)進(jìn)樣，測試以及分離，所以能實(shí)現(xiàn)活性單細(xì)胞的大規(guī)模并行操控，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高通量，全自動(dòng)進(jìn)樣、測試以及分離。
文檔編號(hào)G01N33/48GK201075104SQ200720038580
公開日2008年6月18日 申請日期2007年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月13日
發(fā)明者倪中華, 宋春峰, 紅 易, 朱樹存 申請人:東南大學(xué)