專利名稱：熒光分光光度計的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種以特定的波長光作為激發光來照射樣品，并測定樣品 發出的熒光的熒光分光光度計。
背景技術：
熒光分光光度計是一種如下的裝置使物質吸收光(激發光)而變為 激發狀態，并測定從激發狀態再回到基態時所發出的光(熒光)，以進行和 樣品相關的定性 定量分析。焚光分光光度計在定量的靈敏度 精度方面 優異，且也可用作液相層析儀的檢測器。
根據圖5對普通焚光分光光度計加以說明。光源31發出的光由第1分 光部也就是激發側分光部(衍射光柵32、狹縫33)進行分光后，將預期的 波長光(激發光)照射到樣品元件35中的樣品上。照射到樣品上的光，使 與其能量相應的樣品分子中的 一部分電子得到激發，使樣品分子成為激發 狀態。從激發狀態再回到基態時所發出的光，由第2分光部也就是熒光側 分光部(衍射光柵36、狹縫37)進行分光后，作為樣品熒光的預期的波長 光入Em將到達檢測部38。熒光強度取決于激發光的強度，因此激發光強度 的波動會對熒光強度的測定產生大的影響。為了補償激發光強度的波動，而 于入射到樣品元件35前利用分光鏡34，使來自激發光側分光部的激發光 入ex分支，并將其一部分的光作為參照光入k而導入到參照光檢測部39。來 自熒光檢測部38及參照光檢測部39的信號傳遞到運算部40后，對作為熒 光檢測器的輸出進行運算。通過以焚光強度與激發光強度的比作為焚光檢 測器的輸出，而使激發光的波動的影響得到抑制。如日本專利特開昭63-88412號公報、日本專利特開平3 - 274427號公報、日本專利特開2001 -83093號公報等所示，使入射到樣品元件35中的光分支的構成較為普遍。
發明內容
如上所述，為了獲得參照光AR，而將入射到樣品元件35中的激發光 入h分支，因此入射到樣品中的激發光會減少。如果激發光強度減少，則樣 品發出的焚光也會減少。作為熒光分光光度計的輸出變弱后，作為熒光分 光光度計優點的靈敏度也會降低，使高靈敏度分析受到妨礙。另外，為了 使信號穩定化，而消耗出射光的一部分能量，導致潛在性能的發揮受到妨 礙。本發明的目的在于不損及光強度，而對經分光的預期的光線補償強度。鑒于上述課題的本發明具備光源；第1分光部，將所述光源發出的 光進行分光后，選擇預期的波長光；樣品元件部，以所述第1分光部選擇 的全部波長光作為激發光而入射至樣品元件部；第2分光部，對來自所述 樣品元件部的光進行分光；光4企測部，；險測來自所述第2分光部的光；參 照光檢測部，檢測出未經所述第1分光部選擇的光；光譜數據儲存部，儲 存由所述參照光檢測部檢測出的光強度的輸出作為光譜數據。
利用此構成，光源發出的光經分光后，經選擇的所有波長將入射到樣 品元件中，另一方面，未經選擇的光將入射到參照光檢測部中。入射到參
"此外，本發明的熒光分光光度計具備運算部，此運算部從光語數據儲 存部中讀出光語數據，并根據光譜數據中激發光波長下的光強度與參照光 波長下的光強度的比、及參照光檢測部的輸出，以補償入射到樣品元件部 中的激發光強度。
利用此構成，進行如下的運算從光譜數據儲存部中讀出光譜數據后，根 據光鐠數據中激發光波長下的光強度與參照光波長下的光強度的比、及參 照光檢測部的輸出，以補償入射到樣品元件部中的激發光強度。
此外，本發明的熒光分光光度計中，入射到所述樣品元件部中的激發 光與未經所述第1分光部選擇的光的關系為波長不同，或者衍射次數不同 且波長相同。至于選擇作為激發光以外的光時，波長和激發光不同的光，或者衍射次 數不同且波長相同的光將作為參照光。 [發明效果]
由于無需使照射樣品的激發光分支便可補償激發光強度，因此不會損 失激發光便可激發樣品。另外，由于可測定且儲存光源的光譜，因此可抑 制光源光譜經時變化的影響。即，可針對激發光的波長下的光強度及參照 波長下的光強度，算出更準確的比值，由此可準確補償激發光強度，使定 量性提高。
圖l是本發明熒光分光光度計的概略圖。
圖2是用以說明經本發明焚光分光光度計記錄的光譜的概念圖。 圖3是用以儲存光源光譜的處理的流程圖。 圖4是本發明熒光分光光度計的補償光強度的處理流程圖。 圖5是先前熒光分光光度計的概略圖。
11、 31:光源 12、 16、 32、 36:衍射光4冊
13、 17、 33、 37:狹縫 34:分光鏡15、 35:樣品元件 19、 39:參照光一企測部 21:光譜數據儲存部 S101 S106:步驟
18、 38:熒光檢測部 20、 40:運算部 23: 鏡面 S201 S209:步驟
具體實施例方式
參照圖l及圖2,對本發明熒光分光光度計加以說明。其與先前的焚光 分光光度計同樣具備:光源11;第1分光部即激發側分光部(衍射光柵12、狹
置有用于測定的樣! 。；第^分光部即熒光側分:光部(衍'射光:慨16、狹縫17)，對 樣品元件15中的樣品發出的焚光選擇預期的波長；4企測部18，測定焚光強 度。本發明的熒光分光光度計中，參照光檢測部19如圖1所示，配置為能夠
檢測部19的受光面較大時，在參照光檢測部19之前還設有狹縫。并且，具 備光譜數據儲存部21，和衍射光柵12的轉動角相對應地記錄由參照光檢測 部19所測定的光強度。光源11的發光光譜作為波長人s和此波長中以光強 度Is表示的數據而儲存于光譜數據儲存部21,當進行激發光的強度補償時，數 據從光i普數據儲存部21中讀出。激發光波長入E,是根據設定值而算出的數
值，入射到參照光檢測部19中的光的波長入k是根據激發光波長的設定值 及光學系統的配置而算出的數值。根據所獲得的2個波長(AEx、入r)、以 及經讀出的光譜，而獲得經讀出的光譜中各波長的光強度Uex、s、 Iu)。
運算部20實施激發光強度L與熒光強度L之比的運算，以及基于儲 存于光譜數據儲存部21中的光譜而進行補償激發光強度的運算。由參照光 檢測部19實際測定的參照光的強度h和iEx、s/Iu的積成為入射到樣品元件 15中的激發光的強度IEx。根據經補償的激發光強度L與熒光強度L，而 獲得作為熒光分光光度計的輸出。
如圖2 (a)所示，利用參照光^r測部19測定的光譜、與激發光的波長 范圍內的光譜，在波長范圍內完全不一致，如果使設定為激發光的波長范 圍為A , ~入2，則由參照光4企測部19測定的波長范圍將成為入+ △入~入2 十A入(或者，入，-A人 入2-A入)。A入值的大小根據參照光檢測部 19的配置位置而定，參照光一企測部19的配置位置，可考慮衍射光4冊n的 衍射特性、使來自光源的光入射的角度、僅使經選擇的波長的光透射的狹 縫配置而任意設定。
如果減小AA值，則獲得波長接近于激發光波長"x的參照光。如圖2 (b)所示，在狹縫13的開口部附近設置鏡面23,使由鏡面23反射的參照 光XR,入射到參照光檢測部19中，并取出參照光入k即可。此時，因狹縫13的開口部為經選擇的波長光進行成像的部分，所以為了不使激發光減少，而
優選將鏡面23設置為不進入光路上。
當使用衍射i^冊進行分光時，關于衍射光柵周期d、每lmm中的縫數N、衍 射次數m(m-0、 ±1、 士2…)、波長人、入射光與衍射光柵法線所成的角 度(入射角)a 、衍射光與衍射光柵法線所成的角度(衍射角)e,將使d (sina士sinP ) =mA的關系式(光柵方程式)成立，則入射到衍射光柵 中的光根據衍射次數m的值而在各種角度上進行衍射。作為參照光檢測部 19設置時的位置，最簡便的設計是使相同衍射次數的波長范圍的光能夠入 射。
通常可知，光源會因使用而劣化，導致發光光譜發生變化。圖2 (c) 以橫軸為波長，并在縱軸上以光為強度來表示光源發光光譜。2C-1是使用 時間尚短的光源光譜，2C-2是因使用而劣化的光源光譜。光源劣化后，則 整個波長范圍中光強度會減小，光譜形狀(具有特征性的波峰的波長)會 發生變化。如同從光譜2C-1向光譜2C-2變化那樣，光源的劣化在特定的 波長區域中較為顯著的情況并不少見。在此情況下，特定的波長(A4)的 變化量與其他波長(例如A3)的變化量不同，特定的波長(D的變化量 會變得較大。即便如此情況時，本發明熒光分光光度計，也由于光譜數據 儲存部21中儲存有與變化后的光譜相對應的光譜數據，并以最近測定的光 譜數據為基礎來進行強度的補償，因此可以準確的激發光強度為基礎來進 行已算出的分析。
另外，作為熒光分光光度計的光源ll,優選從紫外線 可見光延伸到紅 外線的寬廣波長范圍內發出較強連續光譜的氙燈。作為熒光檢測部18、參 照光檢測部19,可使用光電二極管或光電倍增管。
參照圖3 ~ 4，對本發明焚光分光光度計補償光強度的運作，加以詳細闡 述。光源、衍射光柵等中所付與的符號，與圖1相對應。
若接通熒光分光光度計的電源，則光源ll被點亮(SIOI)。除光源11 被點亮外，也同樣進行控制部的初始化運作或光學系零件的運作檢查。
光源11點亮后并不會立即穩定發光，而且檢測部(熒光檢測部18、參 照光檢測部19)的溫度也不會達到恒定狀態。接通電源后，在通電狀態下 待機適當時間(例如15分鐘)，以進行所謂的暖機運行(S102)。
經過特定的時間后，使衍射光柵12轉動，并設定于激發光對樣品元件l5 的波長范圍內最長波長的光能夠入射的角度(S103)。此時，與入射到樣品 元件15中的波長入h不同的波長入K的光將入射到參照光檢測部19中，因 此參照光檢測部19的輸出將儲存在光譜數據儲存部21中(S104 )。
其次，以使短波長側的光入射到樣品元件15的方式使衍射光柵12轉動 (S105)。使由激發光的波長分辨率而定的最小單位的波長的短波長的光，入射到樣品元件15中，則可獲得更詳細的光譜數據。
重復轉動衍射光柵(S104)、記錄該參照光檢測部19的輸出信號(S105) 的運作，直至達到激發光波長范圍內最短波長的it^射的角度為止(S106 )。根 據一系列運作，入射到參照光檢測部19中的光強度將儲存在光譜數據儲存 部21中。在光譜數據儲存部21中，以入射到參照光檢測部19中的光的波 長和光對參照光檢測部19的入射強度的關系，儲存成光語數據。
利用本發明熒光分光光度計來測定樣品時，如果設定激發波長入e,
(S201)，則會使衍射光柵12轉動，并使波長hx的光入射到樣品元件15 中。同時，與激發光不同的波長"的光作為參照光而入射到參照光檢測部 19中，因此參照光強度L得以測定(S203 )。
此處，確認光語數據是否存在于光譜數據儲存部21中(S204 )。判斷 用以適當補償該激發光的光譜數據是否存在，并在特定的判定基準下進行 判定。判定基準為(1)光譜數據本身的存在與否，(2)光譜數據的可靠 性，(3)光譜數據經測定的時期。基于全部的判定基準，如果光譜數據判 定為合格，則適于補償該激發光。
(1) 關于光譜數據本身的存在，就是判斷光譜數據是否儲存在于光譜 數據儲存部21中。如果光譜數據不存在，則進入后述的S207的處理。如 果光譜數據存在，則繼續進行如下的判斷。
(2) 光譜數據的可靠性是針對存在于光語數據儲存部21中的光譜數 據，由如下的評估來進行，例如，數據是在初始化運作時任何部位均發現 不良情形的狀態下得到測定的。熒光分光光度計處于不良狀態下所取得的 數據欠缺可靠性，因此判斷為用以適當補償該激發光的光譜數據不存在，并 進入S207的處理。光譜數據的可靠性如無問題，則接著繼續進行如下的判 斷。
(3) 對光譜數據經測定的時期進行評估。如果光譜數據經測定的時期 較長，則光源11的經時變化繼續進展，光譜發生變化的可能性高。利用如 熒光分光光度計那樣的分析裝置所獲得的數據中，通常記錄有取得數據的 時日，因此利用其進行評估即可。或者，如果是作業系統(OS， operating system)方面，則因生成文件的時日插入在文件中，因此利用其進行評估 即可。另外，即使光譜數據的時間較新，也會因點亮'熄滅的運作，而使 光源11的發光部分受到相當多的負荷，因此優選包括有無點亮 熄滅的運 作來進行評估。
當存在正常的光譜數據時，讀出光譜數據(S205 )。算出以波長與光強 度的關系所記錄的光譜數據中激發光的波長人h的強度Iex,s、和參照光的波 長入r的強度k s的比(L,s/Us) (S206 ),并輸出此比值與經測定的參照光 的強度Ia的乘積(IRXIEx, S/IR, J以作為入射到樣品元件15中的光強度。基于上述判定，光譜數據不存在，或者欠缺可靠性，或者光譜數據時
間較久時，顯示為無適當的光譜數據(S207 )，并將經測定的數據(熒光光
譜)是并未進行補償該激發光強度的數據通知給操作者。了解到光源11的 光譜數據為不存在狀態的操作者，在結束實施中的分析后，進行用以補充
光源11的光譜數據的操作。對于此測定，使L,s/h,s為1以進行處理(S208 )。 并且，熒光分光光度計基于IRXIEx, S/IR, s的數值，以輸出結果(S209 )。 經過S208的處理后，由于使IBx,s/IR.s= 1,因此光強度并未進行補償。
在進行波形處理或者定量計算等之前，補充光譜數據，進行光強度的補償
的運算。
接通焚光分光光度計的電源，并且在光源11發出的光的強度穩定后(點 亮后約15分鐘左右)，或者進行樣品分析之前，或者進行樣品分析之后，由 參照光檢測部19進行光譜測定，由此可準確補償光強度。
所述實施例僅為本發明的一例，也可于本發明的宗旨范圍內進行適當 的變更或者修正。明確的是，經過這些變更或者修正后，它們也包含在本 發明中。
將流動單元用作樣品元件部時，該流動單元也可用作液相層析儀用的 檢測器。此時則具備輸送流動相的泵、將樣品導入到由泵輸送的流動相 中的進樣器、以及將導入的樣品分離為每一成分的管柱。
本發明可用作熒光分光光度計、液相層析儀用途的熒光分光光度檢測器。
權利要求
1.一種熒光分光光度計，其特征在于其具備光源；第1分光部，將所述光源發出的光進行分光后，選擇預期的波長光；樣品元件部，以所述第1分光部選擇的所有波長光作為激發光而入射至樣品元件部；第2分光部，將來自所述樣品元件部的光進行分光；光檢測部，檢測來自所述第2分光部的光；參照光檢測部，檢測未經所述第1分光部選擇的光；光譜數據儲存部，儲存由所述參照光檢測部檢測出的光強度的輸出作為光譜數據。
2. 根據權利要求1所述的焚光分光光度計，其特征在于具備運算部，所 述運算部從所述光譜數據儲存部中讀出光譜數據，并根據所述光譜數據中 激發光波長下的光強度與參照光波長下的光強度的比，及所述參照光檢測 部的輸出，以補償入射到所述樣品元件部中的激發光強度。
3. 根據權利要求1所述的焚光分光光度計，其特征在于入射到所述樣 品元件部的激發光與未經所述第1分光部選^^的光的波長不同。
4，根據權利要求1所迷的焚光分光光度計，其特征在于入射到所述樣 品元件部的激發光與未經所述第1分光部選擇的光，衍射次數不同，且波 長相同。
5. —種液相層析儀，其特征在于其具備輸送流動相的泵、將樣品導入 到所述泵所輸送的流動相中的進樣器、將所導入的樣品分離為每一成分的 管柱、根據權利要求1至4中任一項所述的焚光分光光度計，并將經分離 的樣品導入到所述樣品元件部中。
6. 根據權利要求1所迷的熒光分光光度計，其特征在于光源發出的光 經分光后，經選擇的所有波長將入射到樣品元件中，未經選擇的光將入射 到參照光4企測部中。
7. 根據權利要求1或6所述的熒光分光光度計，其特征在于入射到參 照光檢測部中的光將作為光譜數據而儲存于光譜數據儲存部中。
8. 根據權利要求1至4中任一項所述的焚光分光光度計，其特征在于 選擇作為激發光以外的光時，波長和激發光不同的光，或者衍射次數不同 且波長相同的光將作為參照光。
全文摘要
本發明可補償光源發光強度的波動。本發明可利用第1分光部(12、13)將光源發出的光進行分光后，將具有特定的波長(λ<sub>Ex</sub>)的激發光入射到樣品元件15。利用第2分光部(16、17)將來自樣品元件部的光進行分光，并利用熒光檢測部18來測定熒光強度(I<sub>Em</sub>)。另一方面，參照光檢測部19檢測未經第1分光部選擇的光的特定的波長(λ<sub>R</sub>)，將由所述參照光檢測部檢測出的光強度的輸出儲存于光譜數據儲存部21中。根據光譜數據的激發光波長、參照光波長、參照光強度，算出激發光強度(I<sub>Ex</sub>)。依據經測定的熒光強度(I<sub>Em</sub>)、經算出的激發光強度(I<sub>Ex</sub>)，求得熒光分光光度計的輸出。
文檔編號G01N21/64GK101308092SQ20071019659
公開日2008年11月19日 申請日期2007年12月5日 優先權日2007年5月16日
發明者軍司昌秀 申請人:株式會社島津制作所