專利名稱：鎂(離子)診斷/測定試劑盒及鎂(離子)的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種鎂(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定鎂(離 子)濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。 背景4支術
鎂測定方法很多，概括起來有比色法、熒光法、離子層析法，離子選擇性電
極法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀釋質譜法(ID-MS) 等。
鎂測定的決定性方法是同位素稀釋質譜法，參考方法是原子吸收分光光度法 法。這些方法雖然結果準確，但設備復雜，費用昂貴，不適合常規實驗室和自 動分析。
比色法是應用最廣泛的方法，包括甲基麝香草酚藍法(MTB)、達旦黃法、 鄰甲酚酞絡合酮法(0CPC)、鈣鎂試劑(Calmagite)法、以及新近報道的2- (8，-羥基喹啉-5'-磺酸-7'-偶氮)-變色酸(8Q5SAC)法。比色法操作簡便，費用低， 適合常規實驗室應用。但存在試劑空白吸光度高，膽紅素和其它陽離子的干擾， 試劑穩定性差及試劑中含有腐蝕性或毒性成分等缺點。
離子選擇性電極法可測定生理溶液中鎂離子活度。采用中性載體(ETH7025) 液膜離子選擇電極測定準確度較高。但還存在鈣干擾(生理范圍內)&2+最大干 擾10%等不足。
離子色譜法測定血清總鎂在測定之前需對樣本進行預處理，包括酸化稀釋
5和過濾。Thie叩ont等使用該法對五種國際標準和技術學會用火焰原子吸收分 光光度法的定值血清進行了分析，結果平均偏差僅為0.35%，認為離子色譜法 可作為總鎂測定有價值的參考方法。
Mg2+的酶法測定技術在近幾年研究非常活躍，取得較大進展。已應用于Mg" 測定的酶學方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯法；②甘油激酶、 磷酸甘油氧化酶和過氧化物酶偶聯法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶 聯法；④酶聯化學發光法；⑤磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯法; ⑥異檸檬酸脫氫酶法；⑦谷氨酰胺合成酶和乳酸脫氫酶偶聯法。酶法檢測鎂結 果準確，干擾影響小，適合于自動化分析。由于酶試劑不斷更新，使測定快速、 靈敏，操作簡便，因而具有較好的應用前景。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還原型煙 酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鎂(離子) 濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的鎂(離子)診斷/測定試 劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進 行鎂(離子)濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推 廣應用。
本發明鎂(離子)濃度測定方法原理如下
葡萄糖+腺苷三磷酸 己糖激酶/Mg^葡萄糖-6-磷酸+
腺苷二磷酸
腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳 二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)蘋果酸
+輔酶
其中，磷酸根可以用磷酸二氫鹽取代。
這種方法應用需要鎂離子激活的己糖激酶(hexokinase; EC 2.7丄1; EC 2.7丄2)酶(偶)聯丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC 6.4.1.1)、蘋果酸脫 氫酶(malate dehydrogenase; EC 1.1.1.38; EC 1.1.1.39; EC 1,1.1.40; EC 1.1.1.83)
酶促反應連續監測/速率比色法。在鎂離子的激活下，己糖激酶酶解腺苷三磷酸 反應產生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯合丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶的作用， 最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸 收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量 340nm處吸光度下降的速度，可以測算鎂(離子)的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明鎂(離子)診斷/測定試劑盒較 為理想
緩沖液 100mmol/L 穩定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
己糖激酶 6000 U/L
丙酮酸羧化酶 8000 U/L
蘋果酸脫氫酶 10000 U/L
20 mmol/L腺苷三磷酸 草酰乙酸 磷酸根 丙酮酸 本發明的鎂(離子)《
3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L
則定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫 酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、丙酮酸。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l
緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷 酸根、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩定劑、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶。 還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷 酸、草酰乙酸、磷酸根、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒 可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1酸根、丙酮酸。 試劑2
緩沖液、穩定劑、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶。
試劑3
緩沖液、穩定劑、己糖激酶。 還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷
酸、草酰乙酸、磷酸根、丙酮酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑， 直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定鎂(離子)濃度的方法，其還原型 輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的鎂(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
己糖激酶 6000 U/L
丙酮酸羧化酶 8000 U/L
蘋果酸脫氫酶 10000 U/L
葡萄糖 20 mmol/L腺苷三磷! 草酰乙酸 磷酸根 丙酮酸
3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間IO分鐘，起始吸光度1.8 ±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鎂(離子)樣品與試劑的 體積比例為1/25，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約2分鐘左右， 檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。 實施例二
本實施例的鎂(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
還原型輔酶
腺苷三磷酸
草酰乙酸
磷酸根
100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L丙酮酸
3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷—鹽酸緩沖液
穩定劑
己糖激酶
丙酮酸羧化酶
蘋果酸脫氫酶
100 mmol/L 500 mmol/L
6000 U/L 8000 U/L
10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間IO分鐘，起始吸光度1.8
±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鎂(離子)樣品與試劑1、
試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約2
分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，
檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。
實施例三
本實施例的鎂(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
還原型輔酶
腺苷三磷酸
100 mmol/L 50 mmol/L
0.25 mmol/L 20 mmol/L 3 mmol/L
ii草酰乙酸
3 mmol/L
磷酸根 丙酮酸
3 mmol/L 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑
丙酮酸羧化酶 蘋果酸脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩定劑
500 mmol/L 8000 U/L 10000U/L
100 mmol/L
500 mmol/L
6000 U/L
:試劑，可以直接使用。
己糖激酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體」
測定鎂(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時 間10分鐘，起始吸光度1.8± 0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測鎂(離子)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方 向為負反應(下降反應)，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下， 檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到 本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器
12得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0012;吸光度時 間反應曲線應呈下降曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達 6.5mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±6%;試劑測試的精密 度(重復性)的變異系數(CV)《2%;試劑的靈敏度可達0.12 ± 0.04 AA/ mmol/L——本發明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應用。
權利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯法技術的鎂(離子)濃度測定方法，其方法原理如下葡萄糖+腺苷三磷酸 <u>己糖激酶/Mg</u><u>2+</u> 葡萄糖-6-磷酸+ 腺苷二磷酸腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸 <u>丙酮酸羧化酶</u> 腺苷三磷酸+ 丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶 <u>蘋果酸脫氫酶(脫羧化)</u> 蘋果酸 +輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出鎂(離子)的濃度大小測定結果。
2. —種鎂(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液穩定劑還原型輔酶己糖激酶丙酮酸羧化酶蘋果酸脫氫酶腺苷三磷酸草酰乙酸磷酸根丙酮酸 1- 50mmol/L其中，磷酸根可以用磷酸二氫鹽取代。如果緩沖液使用磷酸緩沖液，則 不需要加磷酸二氫鉀。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、丙酮酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、丙酮酸組成雙劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、 丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果 酸脫氫酶組成。還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、葡 萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據權利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、丙酮酸組成多劑試劑；試劑l， 由緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、丙酮酸組成；試劑2，由緩沖液、穩定劑、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩定劑、己糖激酶組成。還原型輔酶、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩定劑1-4000mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩定劑為硫酸銨(AmmoniaSulfate )、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的鎂(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定鎂(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、草酰乙酸、磷酸根、丙酮酸、己糖激酶、丙酮酸羧化酶、蘋果酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464370SQ20071019216
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優先權日2007年12月19日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司