人血漿dna中apc基因甲基化定量檢測方法

專利名稱：人血漿dna中apc基因甲基化定量檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種生物大分子檢測方法，特別涉及一種對人血漿DNA中^PC基因 曱基化定量檢測方法。
背景技術：
人血漿DNA是指游離于細胞外的DNA ( cell free DNA),又稱循環DNA,正常情 況下由體細胞死亡并釋放到外周血中，處于一個較為恒定的水平，保持著一種平衡。近 年來隨著表觀遺傳學和腫瘤發生機制研究的深入,有證據顯示腫瘤發生的早期一些抑癌 基因啟動子區發生曱基化改變，并且這種改變始終伴隨著腫瘤發展的整個過程中。肺瘤 形成過程中，大量的腫瘤細胞產生，同時也出現大量腫瘤細胞死亡，肺瘤來源的核酸釋 放到外周血中導致血漿DNA總量升高，肺瘤細胞死亡的數量多少與血漿中腫瘤來源核 酸的多少相關。目前國內外的許多研究證明絕大多數肺癌及消化道等肺瘤細胞中抑癌基 因爿尸C發生曱基化，因此血漿中也可以檢測到這種改變。
因此，對血漿中APC基因曱基化進行定量檢測，可以應用于肺癌及消化道等腫瘤 患者的早期診斷；同時還可以應用于患者治療過程中療效觀察、預后及復發等方面的監 測。
在本發明之前，目前多是采用血漿DNA提取后行亞疏酸氫鹽化學修飾，再采用普 通MSP(Methylation Specific PCR， MSP)進行擴增檢測。由于血漿中DNA含量少、非 標準化的提取過程中丟失率高、非標準化的亞硫酸氫鹽化學修飾過程中大量的DNA降 解和普通MSP后用低敏感度并且帶有致癌污染物溴化乙錠的電泳判斷結果等原因，使 得從血漿DNA中檢測腫瘤來源的微量曱基化DNA就變得非常困難。因此，直到目前 為止檢測血漿中JPC基因曱基化還沒有直接應用于相關腫瘤患者的早期診斷、患者治 療過程中療效觀察、預后及復發等方面的監測。

發明內容
本發明的目的就在于克服上述缺陷，建立了 一種人血漿DNA中^尸C基因甲基化 定量檢測方法。
本發明的技術方案是
人血漿DNA中J尸C基因曱基化的定量檢測方法，其主要技術步驟在于
(1) 取人外周靜脈血，EDTA-K2抗凝，離心后取血漿；
(2) 制備血漿DNA標準曲線樣品；
(3) 采用磁珠法微量核酸提取技術提取待測血漿DNA、標準曲線血漿樣品DNA和 健康人血漿DNA;
(4 )采用亞硫酸氬鹽法對血漿DNA進行化學修飾，同時修飾標準曲線血漿樣品DNA
和健康人血漿DNA，分別作為陽性和陰性對照； (5)針對人爿PC基因啟動子區中1A序列的707號CpG位點設計特異性引物和
Taqman熒光探針
上游引物序列APCMS707 5'-GGGTCGCGAGGGTATATTTTC-3'，大小為21bp,
分子量為6.99KD; 下游引物序列APCMA707 5'-CCGACCCGCACTCCG-3'，大小為15bp，
分子量為5.00KD;
焚光探針APCMP707 5'-JOE-CCCGCCCAACCGCACAACCT-ECLIPSE-3'，大 小為20bp,分子量為6.66KD, 5'端標記為JOE, 3'端標記為ECLIPSE; 目的產物大小為97bp，分子量為64.60KD;
(6) 25 n 1的熒光定量MSP擴增體系的組成為H20 11.9 n 1 ，5 x Real Time PCR Buffer 5 n 1, lOmM的dNTPs 1.0 u 1,250mM的MgCl2 0.4 n 1， 5mM的上下游引物各1.0 in 1, 5mM熒光探針0.5 in 1，熱啟動酶0.2 n l,樣本模板投入量為4 u 1;
(7) 熒光定量MSP擴增的反應條件如下①95'C 5 min;②94。C 30s ,55°C 30s ,72 °C 40s，共55個循環；
(8 )以標準品血漿DNA的擴增結果制定標準曲線，對待測樣本進行曱基化定量結果 分析。
本發明的優點和效果在于利用設計針對J尸C啟動子區1A序列一對引物和一個 Taqman焚光探針，使用熒光定量MSP對修飾后的血漿DNA模板進行擴增，有針對性 的檢測^尸C基因啟動子部位第707號位的曱基化高發CpG位點;同時可以對血漿中APC 曱基化進行定量分析，提高了血漿中^尸C基因曱基化的檢測靈敏度，本法的最低檢出 限為1.5x 1(^拷貝/ml;克服了以往普通MSP需要電泳、易污染、靈敏度低等缺點。本 定量檢測技術對于早期惡性腫瘤(如肺癌等)診斷有著非常重要的意義，同時還可以 用于腫瘤患者的治療療效觀察、預后和復發監測等方面。
本發明的其它優點和效果將在下面繼續闡述。


圖1一一標準品及待測樣品的熒光定量MSP擴增曲線圖。
注1.標準品2x 1()S拷貝/ml; 2.標準品2 x 1(^拷貝/ml; 3.標準品 2x 1()3拷貝/ml;
4.標準品2xi(p拷貝/ml; 5.肺癌患者血漿樣本；6.健康人血
漿樣本；7.H20。
圖2—一標準曲線。
注-joe Std為陽性標準品；l€ unknown為待測樣品；slope為 斜率；intercept為截距。
具體實施例方式
1. 血漿分離和保存
用含EDTA-K2的5 ml帶蓋無菌塑料抗凝管抽取人外周靜脈血2 ml,室溫狀態 下放置48小時內以3 000 rpm離心10 min,收集血漿；再次以1 000 rpm離心10 min, 獲得無血細胞成分的血漿，用1.5ml的離心管以每管200nl分裝，-20。C以下溫度保 存，并于一個月內檢測。 注收集抗凝靜脈血不可以使用玻璃離心試管。
2. 標準曲線血漿樣品制備
(1) 人胎兒臍帶血(cord blood, CB)細胞DNA提取健康人胎兒臍帶血經Ficoll 淋巴細胞分離液分離出淋巴細胞，采用傳統酚/氯仿法提取CB DNA;
(2) CBDNA轉曱基10 x NEB buffer 2 ji 1,1.6mM SAM 2 |a 1， Sssl Methylase 4U， CB DNA 1 n g,總體積20 n 1，按標準操作程序制備得到陽性對照DNA;
(3) 制備陽性標準品對陽性對照DNA進行紫外分光光度法定量，向健康人血漿中 加入陽性標準品使其濃度分別為2 x 102拷貝/1111、 2 x 1(^拷貝/ml、 2 x 104拷貝/1111 和2xl(^拷貝/ml，共四個濃度，作為標準曲線血漿樣品。
3. 血漿DNA模板的提取
采用磁珠法微量核酸提取技術同時對待測血漿DNA、標準曲線血漿樣品DNA
健康人血漿DNA進行提取
(1) 在200 nl血漿中加入200 nl裂解液，再加入4 pl RNA酶抑制劑混合液，充分混 勻后放55'C水浴15min;
(2) 將離心管取出后每管加入600 pl磁珠與結合液的混合液，振蕩混勻，室溫放置 10min，中間顛倒混勻一次；
(3) 將離心管側靠在》茲體上，放置4min,吸棄液體，注意不要碰或吸走紅色沉淀， 將離心管拿離磁體；
(4) 在離心管內加入200nl洗液，將紅色沉淀振蕩，充分混勻，然后將離心管側靠在 磁體上，放置lmin，吸棄液體，將離心管拿離磁體；
(5) 在離心管內加入100 jal洗液，將紅色沉淀振蕩，充分混勻后，重復步驟上一步驟， 離心管放在55'C金屬浴，干燥4min;
(6) 在干燥后的離心管內加入50pl洗脫液，充分溶解紅色沉淀，在55。C金屬浴保溫 10 min，離心管側靠在磁體上，放置1 min，將液體吸出至新離心管內，此即為 DNA提取液。
注提取的DNA置于-20。C保存，及時行化學修飾，如需要長期保存，應放置在-70 'C的冰箱中保存。
4. 血漿DNA的化學修飾
采用Chemicon公司的S7820化學修飾試劑盒，同時修飾標準曲線血漿樣品DNA 和健康人血漿DNA ，分別作為陽性和陰性
(1) 在保存血漿DNA的EP管中，加入H20,配成100 pl體系，再加入7 ^ 3 M氫 氧化鈉，混合后置50 'C水浴10min;
(2) 加入550 ^亞石危酸氫鈉，然后漩渦振蕩后50 'C水浴16小時；
(3) 加入5 pi懸浮好的糖原至EP管中，再加入750 pi對苯二酚，并短時混勻，室溫 放置5-10 min;
(4) 6 000g，離心lmin,沉淀糖原，棄去上清；
(5) 加入lml70。/。乙醇，振蕩，6 000g，離心lmin,棄去上清，重復此操作共三次； 第三次倒棄上清后，10000g,離心2min,吸棄上清；
(6) 加入50^120mM的氫氧化鈉/90。/。乙醇到EP管中，短暫旋勻以重懸沉淀，室溫 孵育5min;
(7) 6000g,離心lmin沉淀樣品，加入1 ml 90%的乙醇渦旋洗滌沉淀，再次離心， 倒棄上清，重復一次這一步驟；第二次倒棄上清后，10 000 g，離心2min;吸棄 所有的殘余上清，室溫干燥15min;
(8) 加入30nlTE,短暫渦旋重懸沉淀，50 。C水浴15min，溶解DNA;
(9) 12 000 g，離心3min，吸取上清至新離心管。
注經化學修飾的血漿DNA置于-2(TC保存，及時檢測。如需要長期保存，應放置 在-70'C的冰箱中保存。
5. 熒光定量MSP檢測
(1) 25)al的熒光定量MSP擴增體系的組成為H20 11.9 m 1,5 x Real Time PCR Buffer 5|al， lOmM的dNTPs 1.0pi, 250mM的MgCl2 0.4jul, 5mM的上下游引物各1.0m 1, 5mM的探針0.5 u 1，熱啟動酶0.2 u l，樣本模板投入量為4 ja 1。
(2) 熒光定量MSP擴增的反應條件如下 95°C 5 min;②94。C 30s,55。C 30s,72。C 40s，共55個循環。
(3) 采用具有JOE檢測通道的定量PCR儀(如ABI7500、 Mx 3005P、 Light Cycler 2.0
等)，進行實時熒光定量MSP檢測。6.待測血漿樣本、標準品血漿及健康人血漿應同時進行血漿DNA提取、化學修飾及
實時熒光定量MSP擴增，按常規方法，制定出標準曲線，按照標準曲線公式定量
(ct-截距)
計算待測樣本中曱基化^戶C基因的濃度，定量的計算公式為(^^=10斜* ,其
中斜率=——^_,截距-i^zM， Ct為待測樣本擴增熒光信號強度達到閾值 lg(l + ￡) lg(l + ￡)
時所需要的循環數，E為擴增效率，T為閾值，R為常lt/即一個擴增子產生的熒光 信號強度。 7.實際檢測舉例
(1) 檢測樣本包括四個標準品血漿，濃度分別為2 x 102拷貝/1111、 2 x 103拷貝/1111、 2 x 1(^拷貝/ml和2x 1()S拷貝/ml;健康人血漿；H20; —名早期肺癌患者待測血漿；
(2) 熒光定量MSP擴增后，得到擴增曲線，圖1為標準品及待測樣品的熒光定量MSP 擴增曲線；
注1.標準品2x 1()5拷貝/ml; 2.標準品2 x 1()4拷貝/ml; 3.標準品2乂103拷 貝/ml; 4.標準品2x 1(^拷貝/ml; 5.肺癌患者血漿樣本；6.健康人血漿樣本； 7.H20
(3) 設定基線和閾值后，得到標準曲線，同時得到標準曲線方程為Ct=-4.321gCo+50.28， 斜率為-4.32，截距為50.28，圖2為以4個陽性標準品繪制的標準曲線；
注 joeStd為陽性標準品；unknown為待測樣品；slope為斜率；intercept 為截距
Ct-截距
(4) 肺癌患者樣本擴增Ct值為36.6，根據定量計算公式C^c-l(/^^)，算出該樣本 中曱基化爿PC基因的濃度為1.45 x 1(^拷貝/ml。
權利要求
1.人血漿DNA中APC基因甲基化定量檢測方法，其步驟在于(1)取人外周靜脈血，EDTA-K2抗凝，離心后取血漿；(2)制備血漿DNA標準曲線樣品；(3)采用磁珠法微量核酸提取技術提取血漿DNA、標準曲線血漿樣品DNA和健康人血漿DNA；(4)采用亞硫酸氫鹽法對血漿DNA進行化學修飾，同時修飾標準曲線血漿樣品DNA和健康人血漿DNA，分別作為陽性和陰性對照；(5)針對人APC基因啟動子區中707CpG位點設計特異性引物和Taqman熒光探針上游引物序列APCMS707 5′-GGGTCGCGAGGGTATATTTTC-3′，大小為21bp，分子量為6.99KD下游引物序列APCMA7075′-CCGACCCGCACTCCG-3′，大小為15bp，分子量為5.00KD熒光探針序列APCMP7075′-JOE-CCCGCCCAACCGCACAACCT-ECLIPSE-3′，大小為20bp，分子量為6.66KD，5′端標記為JOE，3′端標記為ECLIPSE目的產物大小為97bp，分子量為64.60KD；(6)25μl的熒光定量MSP擴增體系的組成為H2O 11.9μl，5×Real Time PCR Buffer5μl，10mM的dNTPs 1.0μl，250mM的MgCl2 0.4μl，5mM的上下游引物各1.0μl，5mM熒光探針的0.5μl，熱啟動酶0.2μl，樣本模板投入量為4μl；(7)熒光定量MSP擴增的反應條件如下①95℃ 5min；②94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 40s，共55個循環；(8)以標準品血漿DNA的擴增結果制定標準曲線，對待測樣本進行定量結果分析。
2. 根據權利要求1所述的人血漿DNA中APC基因甲基化定量檢測方法，其特征在于DNA作為陽性標準品，向健康人血漿中加入陽性標準品使其濃度分別為2xl02 拷貝/ml、 2xl()3拷貝/ml、 2x 1()4拷貝/ml和2x 1()5拷貝/ml,共四個濃度，作為標準 曲線血漿樣品。
3. 根據權利要求1所述的人血漿DNA中」戶C基因曱基化定量才企測方法，其特征在于 步驟O)中的磁珠法微量核酸提取技術是指按常規J茲珠法操作步驟，200]Jl血漿 經裂解液處理后，加入結合液和磁珠，以磁體吸附磁珠，吸棄液體后，經洗液多次清 洗，最后以洗脫液溶解，吸出的上清液即為血漿DNA提取液，對待測血漿DNA、 標準品血漿DNA和健康人血漿DNA進行同時提取。
4. 根據權利要求1所述的人血漿DNA中爿PC基因甲基化定量檢測方法，其特征在于 步驟(4)中，對血漿DNA行亞硫酸氫鹽化學修飾是指按常規DNA化學修飾方 法操作步驟，血漿DNA模板經堿變性、化學修飾、初步去鹽、二次去鹽完成修飾， 最終溶解于TE緩沖液中，同時修飾標準曲線血漿樣品DNA和健康人血漿DNA,分 別作為陽性和陰性對照。
5. 根據權利要求1所迷的人血漿DNA中^PC基因曱基化定量檢測方法，其特征在于 步驟(5)中，上游引物序列APCMS707 5'-GGGTCGCGAGGGTATATTTTC-3',大小 為21bp，分子量為6.99KD;下游引物序列APCMA707 5'-CCGACCCGCACTCCG-3' 大小為 15bp , 分子量為 5.00KD ; 焚光探針序列APCMP707 5'-JOE-CCCGCCCAACCGCACAACCT-ECLIPSE陽3'，大小為20bp，分子量為6.66KD, 5'端標記為JOE, 3'端標記為ECLIPSE,適用于爿尸C基因啟動子1A序列中第707號 CpG位點。
6. 根據權利要求1所述的人血漿DNA中乂戶C基因曱基化定量檢測方法，其特征在于 步驟(6 )中25 m 1的PCR體系組成如下H20 11.9 p 1, 5 x Real Time PCR Buffer 5 p 1, 10mM的dNTPs 1.0 ja 1, 250mM的MgCl2 0.4 y 1， 5mM的上下游引物各1.0 p 1, 5mM的熒光探針0.5 m 1,熱啟動酶0.2 u l，樣本模板投入量為4 m 1。
7. 根據權利要求1所述的人血漿DNA中^PC基因曱基化定量檢測方法，其特征在于 步驟(7)中擴增的條件為①95。C 5 min;②94。C 30s ,55。C 30s ,72°C 40s ,共55 個循環。通過具有JOE通道熒光檢測的熒光定量PCR儀進行檢測，以標準品血漿 DNA的擴增結果制定標準曲線，對待測樣本進行曱基化定量結果分析。
全文摘要
本發明涉及一種對人血漿DNA中APC基因甲基化定量檢測方法。本發明取靜脈血后得血漿，制備血漿DNA標準曲線樣品，提取待測血漿DNA、標準曲線血漿樣品DNA和健康人血漿DNA，對血漿DNA、標準曲線血漿樣品DNA和健康人血漿DNA化學修飾，對人APC基因啟動子區中1A序列的707號CpG位點設計特異性引物和Taqman熒光探針，擴增后以標準品血漿DNA的擴增結果制定標準曲線，對待測樣本進行甲基化定量結果分析。本發明解決了血漿中DNA含量少、丟失率高、DNA降解、帶有致癌污染物等缺陷。本發明利用針對APC啟動子區1A序列一對引物和一個Taqman熒光探針，針對性檢測APC基因啟動子部位第707號位的甲基化高發CpG位點，進行定量分析，可用于腫瘤患者的治療療效觀察、預后和復發監測等方面。
文檔編號G01N21/00GK101354347SQ200710191938
公開日2009年1月28日 申請日期2007年12月27日 優先權日2007年12月27日
發明者潘世揚, 謝而付, 麗 高 申請人:潘世揚