鉀(離子)診斷/測定試劑盒及鉀(離子)的濃度測定方法

專利名稱：鉀(離子)診斷/測定試劑盒及鉀(離子)的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種鉀(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定鉀 (離子)濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。
背景技術：
腎小球疾病、腎功能衰弱、糖尿病酮癥中毒、腎上腺皮質功能減退等。當
血鉀高達7.5 mmol/L或以上時病人將出現心律失常，應考慮確定適當的治 療方案。血清鉀超過10 mmol/L時，即可發生心室纖顫，心臟停搏而死亡。 高鉀使心臟停跳于舒張期。
目前鉀測定常用的方法有同位素稀釋質譜法、中子活化法、火焰光度計 法、化學測定法、離子選擇電極法、原子分光光度法、酶動力學法。
火焰光度法1950年開始使用并一直沿用至今的火焰光度法檢測血清、 尿液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，是一種發射光譜分析法。測定方法分為 內標準法和外標準法兩種。外標準法操作誤差較大， 一般不采用。現在主要 使用內部標準法，即標本及標準液采用加進相同濃度的內部標準元素鋰或銫 進行測定。操作時，將含鋰的溶液作為稀釋液，同時測定K、 Na和Li的濃 度，以標本與標準液的Na/Li與K/Li比值，計算Na、 K濃度。由于血清稀 釋倍數大，血清蛋白質粘性的影響幾乎可忽略不計。
化學測定法主要利用復環王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚， 均為離子載體進行測定，由于大環結構內有空穴，分子內部氧原子有未共用 電子對可與金屬離子結合，根據空穴大小，可選擇性結合不同直徑的金屬離子，從而可達到測出離子濃度的目的。測定血清K， 一般采用普通冠醚陰離
子染料進行比色定量。
離子選擇電極法ISE法是采用靈敏的特定專用電極,在專用儀器上進行 血清和尿等體液的K+、 Na+的測定，因標本用量少，快速準確，幾乎有取代其 他方法的趨勢。其儀器測定原理是離子選擇電極與參比電極組合浸泡在待測 標本溶液中，進行檢測。目前已有的電極種類為①玻璃膜電極，感應材料 為玻璃薄膜的有pH電極、K+電極和Na+電極；②固相膜電極，由難溶性金屬 物質加壓成型，以固體膜或單日膜作為感應膜的電極有Cl—電極和F—電極； ③液態膜電極，將環氧樹脂或內裝聚氯乙稀為感應膜的Ca"電極；@用纈氨 霉素膜制成的K+電極。上述電極均有一定的壽命，因為電極使用一段時間就 會自動老化，有效期長短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于檢測血清K+、 Na+，操作繁雜， 誤差較大，不及火焰光度法簡便。
鉀測定的決定性方法是同位素稀釋質譜法及中子活化法。WHO推薦的方法 是火焰光度計法。目前離子選擇電極法應用較為普遍，但是電極成本昂貴。
酶測定法和火焰光度計法或離子選擇電極法均有較好的一致性，且抗干 擾性強，穩定性好，彌補了生化分析儀不能同時測定鉀鈉的不足。有較好的 分析性能，易于自動化，在臨床化學分析中必定取代火焰光度計法成為常規 分析項目。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用需要鉀離子激活的丙酮酸激
酶的酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鉀(離子)濃度的方法，同時，本發明還將給出 用以實現該方法的鉀(離子)診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外 /可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行鉀(離子)濃度測定，而且測 定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明鉀(離子)濃度測定方法原理如下
腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶化+ 腺苷三磷酸
+丙酮酸
腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳丙酮酸羧化酶腺苷二磷酸
+磷酸根+草酰乙酸 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氫酶
甘油酸-l,3-雙磷酸+還原型輔酶
二氧化碳可以用碳酸氫鈉或其他碳酸氫鹽取代。
這種方法應用需要鉀離子激活的丙酮酸激酶(pymvic kinase; EC 2.7丄40) 酶(偶)聯丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase; EC6.4丄1)、甘油醛-3-磷酸脫 氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2.1.59)酶^f足反應連 續監測法。丙酮酸激酶酶解磷酸烯醇式丙酮酸反應產生腺苷三磷酸，再通過 (偶)聯合丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在 340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而 得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸 光度上升的速度，可以測算鉀(離子)的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮， 無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明鉀(離子)診斷/測定試 劑盒較為理想緩沖液100mmol/L
穩定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
丙酮酸激酶10000U/L
丙酮酸羧化酶12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶12000U/L
腺苷二磷酸2 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸5 mmol/L
丙酮酸16 mmol/L
碳酸氫鈉12 mmol/L
甘油醛-3-磷酸6 mmol/L
本發明的鉀(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脫氫酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油 醛-3-磷酸。
試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮
酸、碳酸氫鈉、甘油醛-3-磷酸。 試劑2
緩沖液、穩定劑、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油醛-3-磷酸在試劑1或試劑2 中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮
酸、碳酸氫鈉、甘油醛-3-磷酸。 試劑2
緩沖液、穩定劑、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩定劑、丙酮酸激酶。
輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使 用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定鉀(離子)濃度的方法，其輔 酶可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液畫mmol/L
穩定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
丙酮酸激酶10000U/L
丙酮酸羧化酶12000U/L
甘油醛-3-磷酸脫氫酶12000 U/L
腺苷二磷酸2 mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸5 mmol/L
丙酮酸16 mmol/L
碳酸氫鈉12 mmol/L
甘油醛-3-磷酸6 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用 前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光度 《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鉀(離子)樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約2分 鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度 大小。 實施例二
本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
穩定劑
輔酶
腺苷二磷酸
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸
甘油醛-3-磷！
100mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L
5 mmol/L 16 mmol/L 12 mmol/L
6 mmol/L
試劑2
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 丙酮酸激酶 丙酮酸羧化酶 甘油醛-3-磷酸脫氫酶
50 mmol/L
10000U/L
12000U/L
12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始吸光度
《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鉀(離子)樣品與試
劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時
間大約2分鐘左右，撿測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析
儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大小。
實施例三本實施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩定劑 輔酶
腺苷二磷酸
磷酸烯醇式丙酮酸
丙酮酸
甘油醛-3-磷酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩定劑
丙酮酸羧化酶
甘油醛-3-磷酸脫氫酶
試劑3
穩定劑 丙酮酸激酶
50 mmol/L 3 mmol/L 2 mmol/L
5 mmol/L 16 mmol/L 12 mmol/L
6 mmol/L
100mmol/L 500 mmol/L 12000U/L 12000U/L
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
500 mmol/L
10000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定鉀(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應 時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm， (離子)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析 儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度 大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達 到本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀 器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.018;吸光 度時間反應曲線應呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(RX).99)線形范 圍可達12mmol/L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過士 5%;試劑 測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《2 %;試劑的靈敏度可達0.048 ± 0.024 AA/mmol/L——本發明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足 以便于推廣應用。
權利要求
1. 一種酶比色法及酶聯法的鉀(離子)的濃度測定方法，其方法原理如下腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸 <u>丙酮酸激酶/K</u><u>+</u> 腺苷三磷酸 +丙酮酸腺苷三磷酸+丙酮酸+二氧化碳 <u>丙酮酸羧化酶</u> 腺苷二磷酸 +磷酸根+草酰乙酸磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶 <u>甘油醛-3-磷酸脫氫酶</u>甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶二氧化碳可以用碳酸氫鈉或其他碳酸氫鹽取代。將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出鉀(離子)的濃度大小測定結果。
2 —種鉀(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩定劑 輔酶丙酮酸激酶丙酮酸羧化酶甘油醛-3-磷酸脫氫 腺苷二磷酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸 -4000 mmol/L6 mmol/L1000-1000-■00 U/L80000 U/L0-80000 U/L0 mmol/L50 mmol/L50 mmol/L50 mmol/L甘油醛-3-磷酸 1——50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此 范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脫氫酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油醛-3-磷酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脫氫酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油醛 -3-磷酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2， 由緩沖液、穩定劑、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 組成。輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷 二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油醛-3-磷酸在試劑 l或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸 脫氫酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油醛 -3-磷酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩定劑、輔酶、腺苷二磷酸、 磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2,由緩沖液、穩定劑、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成；試劑3， 由緩沖液、穩定劑、丙酮酸激酶組成。輔酶、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化 酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油醛-3-磷酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨 (Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的鉀(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發明還涉及測定鉀(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷二磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、碳酸氫鈉、甘油醛-3-磷酸、丙酮酸激酶、丙酮酸羧化酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464307SQ200710191809
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優先權日2007年12月19日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司