專利名稱：異檸檬酸測定試劑盒及異檸檬酸的濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種異擰檬酸測定試劑盒，同時本發明還涉及測定異檸檬 酸濃度的方法，屬于食品檢驗測定技術領域。
背景技術：
異檸檬酸isocitricacid是檸檬酸的異構體，雖然量少，但廣泛存在于生 物界。在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別 多，生物能夠利用的是D型。是三羧酸循環中的一個成分。擰檬酸在鳥頭 酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC 1丄1.41; EC 1丄1.42)的作用下變成a-酮戊二酸，在異檸檬酸裂合酶 (isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1)的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。
中華人民共和國國家標準，GBT16771-1997，規定了橙、柑、桔汁及其 飲料中D-異檸檬酸的測定方法一紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、 柑、桔濃縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁飲料的總 D-異檸檬酸的測定。其測定原理異檸檬酸脫氫酶isocitrate dehydrogenase 有兩種類型以NAD為輔酶的酶(EC1. 1. 1. 41)和要NADP為輔酶 的酶(EC1. 1.1. 42)，兩者催化同一反應。
異檸檬酸+NAD(P)+;2 a-酮戊二酸+C02 + NAP(P)H + tr 在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP作用， 生成NADH或NADPH的含量，相當于D-異檸檬酸鹽的量。在波長340nm 處測定吸光度，確定樣品中總D-異檸檬酸的含量。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶循環擴增法(EnzymaticRecycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，計量/連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定異檸檬酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的異檸檬酸測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行異檸檬酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。本發明異檸檬酸濃度測定方法原理如下
D-異檸檬酸+輔酶異檸檬酸脫氫酶 二氧化碳+
酮戊二酸+還原型輔酶二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素bl 丙酮酸氧化酶 丙酮酸
+高鐵細胞色素bl +水丙酮酸+輔酶八+輔酶丙酮酸脫氫酶二氧化碳+
乙酰輔酶八+還原型輔酶這種方法應用異擰檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1.1.1.41;EC1丄1.42)酶(偶)聯丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.2.2)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase; EC 1.2.1.51)酶促反應速率比色法。異檸檬酸脫氫酶，作為作用酶，酶解異檸檬酸反應產生二氧化碳，同時也是顯色酶，將輔酶還原成為還原型輔酶；再通過(偶)聯合丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶的作用，丙酮酸氧化酶也作為作用酶，利用二氧化碳產生丙酮酸；丙酮酸脫氫酶又作為循環酶又是顯色酶， 一面將丙酮酸變回二氧化碳，使之不斷循環利用； 一面又將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算異檸檬酸的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明異檸檬酸測定試劑盒較為理想
緩沖液100 mmol/L
穩定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶10000U/L
丙酮酸氧化酶12000U/L
丙酮酸脫氫酶12000 U/L
乙酸10 mmol/L
亞鐵細胞色素bl10 mmol/L
輔酶A10 mmol/L
本發明的異檸檬酸測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩定劑、輔酶、異擰檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸
脫氫酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1
緩沖液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A。試劑2
緩沖液、穩定劑、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶。
輔酶、異擰檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙酸、亞鐵細
胞色素bl、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑1
緩沖液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A。試劑2
緩沖液、穩定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶。試劑3
緩沖液、穩定劑、異檸檬酸脫氫酶。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定異檸檬酸濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio- NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。實施例一
本實施例的異檸檬酸測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100 mmol/L
穩定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
異檸檬酸脫氫酶10000U/L
丙酮酸氧化酶12000U/L
丙酮酸脫氫酶12000 U/L
乙酸10 mmol/L
亞鐵細胞色素bl10 mmol/L
輔酶A10 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑的體積比例為1/25,反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間3分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。實施例二
本實施例的異擰檬酸測定試劑為雙試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩定劑 50 mmol/L輔酶
3 mmol/L
乙i
亞鐵細胞色素bl
輔酶A
10 mmol/L
10 mmol/L
10 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L
穩定劑
異檸檬酸脫氫酶丙酮酸氧化酶
500 mmol/L
10000U/L
12000U/L
丙酮酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始吸光
度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與
試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延
遲時間大約2分鐘左右，檢測時間3分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析
儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出異擰檬酸的濃度
本實施例的異檸檬酸測定試劑為三試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩定劑 50 mmol/L
10乙酸
亞鐵細胞色素bl輔酶A
3 mmol/L10 mmol/L10 mmol/L10 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩定劑
丙酮酸氧化酶
丙酮酸脫氫酶
100 mmol/L500 mmol/L12000 U/L12000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100 mmol/L
穩定劑
異檸檬酸脫氫酶
500 mmol/L
10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測定異檸檬酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測異檸檬酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間3分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發明內容中記載的測定方法均能達到
ii本發明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。總之，實驗證明采用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析
儀器得出所需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.0009;吸光度時間反應曲線應呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達9.987 mmol /L;試劑測試的不準確度，其相對偏差不超過±7%;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《2.5%;試劑的靈敏度可達0.0984 ± 0.0049 AA/mmol/L——本發明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應用。
權利要求
1. 一種酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法的異檸檬酸的濃度測定方法，其方法原理如下D-異檸檬酸+輔酶 <u>異檸檬酸脫氫酶</u> 二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素b1 <u>丙酮酸氧化酶</u> 丙酮酸 +高鐵細胞色素b1+水丙酮酸+輔酶A+輔酶 <u>丙酮酸脫氫酶</u> 二氧化碳+ 乙酰輔酶A+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出異檸檬酸的濃度大小測定結果。
2. —種異檸檬酸測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20———500 mmol/L穩定劑1——-4000 mmol/L輔酶1——6 mmol/L異檸檬酸脫氫酶iooo-——80000 U/L丙酮酸氧化酶1000-——80000 U/L丙酮酸脫氫酶畫o畫——80000 U/L乙酸1—50 mmol/L亞鐵細胞色素bl1—50 mmol/L輔酶A1——50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外，試劑仍會反應作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫 氫酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述異桿檬酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫 氫酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A組成雙劑試劑；試劑l，由緩 沖液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A組成；試劑2， 由緩沖液、穩定劑、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組 成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩定劑、輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A組成多劑試劑；試劑l，由緩 沖液、穩定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A組成；試劑2， 由緩沖液、穩定劑、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶組成；試劑3，由緩 沖液、穩定劑、異檸檬酸脫氫酶組成。輔酶、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸 氧化酶、丙酮酸脫氫酶、乙酸、亞鐵細胞色素bl、輔酶A在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述異檸檬酸測定試劑盒，其特征在于還包括穩定 劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙 二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶循環擴增法、酶比色法及酶聯法技術的異檸檬酸測定試劑盒，同時本發明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、乙酸、亞鐵細胞色素b1、輔酶A、異檸檬酸脫氫酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出異檸檬酸的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464282SQ20071019143
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優先權日2007年12月19日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司