專利名稱：：一種測定細菌納米磁小體載藥量的方法
技術領域：
：本發明涉及一種細菌納米磁小體載藥量的測定方法，特別是涉及一種采用紫外光譜或熒光光譜間接測定細菌納米磁小體載藥量的方法。
背景技術：
：趨磁性細菌(magnetotacticbacterium)是1975年美國生物學家布拉克莫爾(Blakemore)偶然發現的自然界存在的一類奇特的微生物，它能夠沿著磁力線運動，其細胞內含有對磁場具有敏感性的細菌納米磁小體(magrietosomes)，它在細胞內起了導向的作用，并可借助于自身的鞭毛來運動。細菌納米磁小體大小約為35-120nm，在永久的單磁疇晶尺寸范圍之內，主要成分為FeA或Fe^，外面有由嵌合蛋白質的憐脂雙分子脂膜包被，分離純化后在溶液中分散性好，穩定性高。日本學者Matsunaga早在1991年就預計趨磁細菌磁小體在未來的10年中將是高新技術應用中的一種新的生物資源。在固定化酶載體，免疫檢測、基因轉移，DNA、RNA的分離和標記等方面的研究結果表明，細菌納米磁小體的性能優于人工合成磁性納米顆粒，前者固定化酶量大(可達人工合成磁性納米顆粒的100倍)，抗體連接量大，免疫檢測靈敏度高，DNA吸附量大，應用前景非常廣闊。(與人工合成磁性納米顆粒相比，細菌納米磁小體由于來自活體細菌，具有優越的生物相溶性，毒副作用小；其尺寸均在納米級，顆粒均勻，晶型穩定，具有較大的比表面積；電負性較大且可調節，不易聚集；同時由于有脂膜包被，活性基團豐富，表面可進行各種化學修飾，可能成為一種更理想的納米藥物載體，在耙向定位治療腫瘤方面展現出誘人的應用前景。已有的初步研究結果表明，細菌納米磁小體粒度均勻，它負載藥物阿霉素前后粒徑變化小，比傳統人工合成的載藥磁顆粒小1-20倍。采用生物納米磁小體作為藥物載體，載藥量可比傳統人工合成磁顆粒的高出10倍以上。但是由于采用細菌納米磁小體進行載藥方面研究工作才剛剛起步，測定細菌納米磁小體載藥量的方法也無現成經驗可循。有文獻報道，對于測定人工合成納米磁顆粒的載藥量，通常采用強酸及強極性溶劑將其溶解，提取后再測定。但是對于細菌納米磁小體體系，這些強酸及強極性溶劑在溶解破壞細菌納米磁小體膜及磁核的同時，也極易使所載藥物的性質發生變化并分解，從而影響其載藥量的準確測定。因此，如何在不破壞藥物本身性質及活性的條件下，準確測定細菌納米磁小體對藥物的載藥量，是目前細菌納米磁小體載藥研究工作中急待解決的技術難題。
發明內容本發明的目的在于提供一種細菌納米磁小體載藥量的測定方法。具體的說，是提供一種采用紫外光譜或熒光光譜間接測定細菌納米磁小體載藥量的方法。本發明所說的細菌納米磁小體是趨磁細菌細胞內形成的納米磁性顆粒，粒徑35-120nm，主要成分為Fe304或FesS4，單個磁顆粒有脂膜包被。此法涉及的藥物是能與細菌納米磁小體偶連的藥物。本發明所述細菌納米磁小體載藥量的測定方法，包括下述步驟(1)將水或緩沖溶液加入待測藥物中，配制出一系列不同濃度的藥物標準溶液；(2)以純水或相應緩沖溶液為參比，測定上述藥物標準溶液紫外掃描光譜或熒光發射光譜(波長范圍190—900nm)，確定最大紫外吸收波長或最大發射波長測定上述一系列已知準確濃度的藥物溶液在該Amax處的紫外吸光度值或熒光發射強度值，制出其標準工作曲線；(3)將已知準確濃度的藥物溶液與細菌納米磁小體混合，使它們定量定體積反應，反應結束后，用磁鐵在反應容器外將反應容器內的磁小體吸至容器底部，收取上清液，待測；再配制一份與上述混合溶液濃度相同的未與細菌納米磁小體反應的藥物溶液作為反應空白對比溶液，待用；(4)分別測定步驟3中待測反應上清液和反應空白對比溶液在A皿處的紫外吸光度值或熒光發射強度值；(5)根據待測反應上清液和反應空白對比溶液在Xmax處的紫外吸光度值或熒光發射強度值的差值，通過所載藥物的相應標準工作曲線，計算出細菌納米磁小體的載藥量。采用上述本發明的細菌納米磁小體載藥量的測定方法，將傳統的紫外光譜或熒光光譜與細菌納米磁小體載藥反應的實際情況相結合，通過反應前后反應液中藥物濃度的變化間接測定細菌納米磁小體載藥量，能夠在不破壞藥物本身性質及活性的條件下，測定細菌納米磁小體對藥物的載藥量。該方法操作簡單，結果可靠，并可以保證藥物活性及反應的持續性，為細菌納米磁小體載藥量的測定提供了新穎、可靠的檢測技術手段。圖1是阿霉素標準溶液紫外光譜圖。圖2是阿霉素水溶液的標準工作曲線(Uax-480nm)。圖3是抗CEA標準溶液熒光發射光譜圖。圖4是抗CEA磷酸緩沖溶液的標準工作曲線。具體實施例方式下面各實施例中采用的試劑和儀器說明如下細菌納米磁小體(BMP):由MSR-1趨磁細菌菌株培養而得，粒徑為40-50nm，由中國農業大學生物學院微生物系提供。單克隆抗CEA:購自SIGMA公司。抗癌化療藥物阿霉素(ADM):購于北京云迪同創醫藥科技有限公司。水二次去離子水。所用溶劑和化學試劑均為分析純。儀器日本島津UV-3100型紫外-可見光譜儀，石英池厚lcm;KQ-IOO型超聲波振蕩器；PerkinElmerLS50B型熒光光譜儀，石英池厚lcm。實施例1:采用紫外光譜法測定細菌納米磁小體(BMP)所載抗癌藥物阿霉素,(ADM)的載藥量。(1)配制阿霉素的標準溶液準確稱取0.02g阿霉素，溶于純水，在25ml容量瓶中配制其標準溶液。移取不同體積的上述阿霉素標準溶液于25ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，準確配制出一系列已知濃度的阿霉素標準溶液。(2)建立所載藥物的標準工作曲線用純水做參比，測定上述阿霉素標準溶液紫外掃描光譜，獲得其紫外光譜如圖l所示。根據圖l可以確定阿霉素在純水溶液中最大吸收波長入皿為480nm。測定上述一系列已知準確濃度的阿霉素溶液在480nm處的吸光度值，制出其標準工作曲線如圖2所示。確定其線性回歸方程為A-23.73K。A為吸光度值，C為阿霉素標準液濃度，即溶液吸光度值與溶液中阿霉素的含量成正比。(3)將藥物與細菌納米磁小體定量反應將戊二醛修飾過的細菌納米磁小體與己知準確濃度的阿霉素溶液混合，使混合液中細菌納米磁小體反應濃度為0.02mg/ml，阿霉素的濃度為0.2mg/ml，開啟超聲波振蕩器，二者反應，反應結束后，用磁鐵將磁小體吸至反應容器底部，收取上清液，待測。(4)配制阿霉素的反應空白對比溶液配制一份與步驟(3)的混合溶液同體積量的濃度為0.2mg/ml的阿霉素藥物溶液，作為未與細菌納米磁小體反應的阿霉素的空白對比溶液。(5)紫外光譜測定分別測定上述步驟(3)所得的反應后上清液和步驟(4)的反應空白對比溶液在480nm處的紫外吸光度值。測得二者在480nm處的紫外吸光度值的差值為0.254。(6)載藥量的計算根據待測反應上清液(3)和反應空白對比溶液(4)在480nm處的紫外吸光度值的差值，通過所載藥物的相應標準工作曲線(圖2)所確定的線性回歸方程，計算出細菌納米磁小體的載藥量為536iigADM/mgBMP。需要注意的是，無論是采用紫外光譜法還是熒光光譜法，每次進行藥物與細菌納米磁小體定量反應時均應同時配制阿霉素的反應空白對比溶液，以保證反應空白對比溶液的配制條件完全與反應液一致，減小實驗誤差。實施例2:采用熒光光譜法檢測細菌納米磁小體載單克隆抗體抗CEA含量。(1)配制抗CEA標準溶液加磷酸緩沖溶液，配制一系列已知準確濃度的抗CEA標準溶液。(2)建立抗CEA的標準工作曲線測定上述抗CEA標準溶液熒光發射光譜，獲得其熒光發射光譜如圖3所示。確定其最大發射波長入^為336nm。測定上述一系列已知準確濃度的抗CEA溶液在336nm處的熒光發射強度值，做出其標準工作曲線如圖4所示。確定其回歸方程為1=8.047*103*C。I為吸光度值，C為抗CEA標準液濃度，即溶液吸光度值與溶液中抗CEA的含量成正比。(3)將抗CEA與細菌納米磁小體定量反應將戊二醛修飾過的細菌納米磁小體與已知準確濃度的CEA抗溶液混合，使混合液中細菌納米磁小體反應濃度為0.02mg/ml，抗CEA的濃度為0.14mg/ral，開啟超聲波振蕩器，二者反應，反應結束后，用磁鐵將磁小體吸至反應容器底部，收取上清液，待測。(4)配制抗CEA的反應空白對比溶液配制一份與步驟(3)的混合溶液同體積量的濃度為0.14mg/ml的抗CEA藥物溶液，作為未與細菌納米磁小體反應的抗CEA的空白對比溶液。(5)光譜測定分別測定步驟(3)所得反應上清液和步驟(4)所配制的反應空白對比溶液在336nm處的熒光發射強度值，測得二者在336處的熒光發射強度的差值為724。(6)載藥量的計算根據待測反應上清液(3)和反應空白對比溶液(4)在336nm處的熒光發射強度值的差值，通過所載藥物的相應標準工作油線)所確定的線性回歸方程，計算出細菌納米磁小體的連接抗CEA的量為4.5mg抗CEA/mgBMP。實施例3:精密度實驗以熒光光譜法為例，按上述方法對同一批次的抗CEA溶液及戊二醛修飾細菌納米磁小體用同樣操作條件同時進行平行實驗，根據各實驗的熒光發射強度值，計算細菌納米磁小體的連接抗CEA的量，結果如下表1所示。此結果表明本發明的檢測方法能達到理想的精密度要求。表1精密度實驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表1表明，同一批原料經六次平行測試，測得載藥量誤差在允許范圍內。權利要求1.一種測定細菌納米磁小體載藥量的方法，其特征是包含下述步驟(1)將水或緩沖溶液加入待測藥物中，配制出一系列不同濃度的藥物標準溶液；(2)以純水或相應緩沖溶液為參比，測定上述藥物標準溶液紫外掃描光譜或熒光發射光譜(波長范圍190-900nm)，確定最大紫外吸收波長或最大發射波長λmax；測定上述一系列已知準確濃度的藥物溶液在該λmax處的紫外吸光度值或熒光發射強度值，制出其標準工作曲線；(3)將已知準確濃度的藥物溶液與細菌納米磁小體混合，使它們定量定體積反應，反應結束后，用磁鐵在反應容器外將反應容器內的磁小體吸至容器底部，收取上清液，待測；再配制一份與上述混合溶液濃度相同的未與細菌納米磁小體反應的藥物溶液作為反應空白對比溶液，待用；(4)分別測定步驟3中待測反應上清液和反應空白對比溶液在λmax處的紫外吸光度值或熒光發射強度值；(5)根據待測反應上清液和反應空白對比溶液在λmax處的紫外吸光度值或熒光發射強度值的差值，通過所載藥物的相應標準工作曲線，計算出細菌納米磁小體的載藥量。全文摘要本發明涉及一種測定細菌納米磁小體載藥量的方法，采用紫外光譜或熒光光譜確定待測藥物的最大紫外吸收波長或最大發射波長λ<sub>max</sub>；測出不同濃度的藥物溶液在該λ<sub>max</sub>處的紫外吸光度值或熒光發射強度值，制出其標準工作曲線；將已知濃度的藥物與細菌納米磁小體混合反應，分離出反應后的磁小體，得上清液；另配制與上述藥物同濃度的未與細菌納米磁小體反應等量藥物溶液，作為空白反應對比溶液；分別測定上清液和空白反應對比溶液在λ<sub>max</sub>處的紫外吸光度值或熒光發射強度值，根據二者的差值由標準工作曲線計算出細菌納米磁小體的載藥量。文檔編號G01N21/33GK101173893SQ20071019028公開日2008年5月7日申請日期2007年11月26日優先權日2007年11月26日發明者琳郭申請人:南京大學