專利名稱：鑒定和定位馬潰瘍和其它消化道出血的方法及儀器的制作方法
鑒定和定位馬潰瘍和其它消化道出血的方法及儀器發明背景發明領域-本發明總的涉及診斷和檢測儀器及方法，更具體涉及馬血紅蛋 白和馬白蛋白的抗體和其在檢測并定位馬胃和結腸潰瘍和其它消化道出血的檢測儀 器、試劑盒方法中的應用。在討論檢測和診斷馬潰瘍之前，先討論促成馬高發消化道潰瘍的某些馬獨特的 消化道解剖結構會有幫助。就人和大多數其它動物而言，胃對進食的反應是分泌胃酸。相反，馬在數千年進化鐘成為細流進食動物(tricklefeeder)(進食慢卻持續或多或少一天中大部分時間)，它們的消化系統也配合這種進食方式，不斷產生胃液并且肝 臟分泌膽汁進入前腸。因此，可認為馬的胃是一種可在整天中或多或少不斷產生胃 酸的酸泵，而無論馬是否進食。由于馬的解剖結構和現代進食及護理規程，所有的馬，尤其是表演用馬患胃潰 瘍的非常多。例如賽馬，據報道多達97%患有消化道潰瘍，而展覽用馬的消化道潰 瘍發病率僅稍稍微落后。即使表演馬的幼駒也受此病折磨，大約60%的表演馬幼駒 患消化道潰瘍。而娛樂用馬消化道潰瘍的發病率低于展覽用馬，近二十年來所有種 類的馬群包括娛樂用馬消化道潰瘍發病均顯著升高。雖然結腸潰瘍(馬的盲腸和/或結腸潰瘍)的發病率遠沒有被探究，但它們也可能 代表了不同的同樣嚴重的馬健康問題。迄今唯一的一項科學研究專門觀察了結腸潰 瘍發病率顯示了令人吃驚的結果。此項研究對馬的剖析顯示，胃潰瘍發病率約55% 結腸潰瘍發病率40%。胃和結腸潰瘍的發病率不相同，意味著有些馬僅患胃潰瘍而 另一些馬僅患結腸潰瘍。然而，患結腸潰瘍的馬大部分也患胃潰瘍，馬群無胃或結 腸潰瘍的比例低于30%。如上所述，展覽用馬和賽馬的消化道潰瘍發病率經統計甚 至比普通馬群還要高。本領域已釆用了很多方案來解決馬的消化道潰瘍問題。此類解決方案包括用抗 酸藥暫時中和胃酸、用藥物抑制胃酸產生、延長休息時間和進餐時間。近年來，開 發出一種新的高效食物添加劑，能夠治療和/或預防胃潰瘍和結腸潰瘍，參見2003年5月9日提交的名稱為"食物添加劑及其治療并預防馬和其它動物消化道潰瘍的方法"的美國專利申請第10/435,367號所述，該專利申請已轉讓給本發明受讓人，該專利 申請的內容全文納入本文作為參考。雖然已有了此類治療方法，但高度精確地診斷馬胃潰瘍仍然非常困難，并且還 幾乎不能診斷馬的結腸潰瘍。已發現，最常用的診斷馬潰瘍的方法，即利用癥狀(常 常是模糊的、非特異性的癥狀如體重減輕、食欲不振、嗜睡或間歇性發熱)與可察覺 的治療結果相結合的方法幾乎完全不可靠。這是由于可能有許多潛在原因能引起相 同的癥狀，并非所有馬均表現出相同或甚至明顯的潰瘍癥狀。因此，用該技術常常 不比猜測游戲好多少。認為唯一可靠的診斷馬胃潰瘍方法是采用3米視頻內窺鏡，其顯著缺點是昂貴、 費時和會產生緊張感(對馬和對訓練者/馬主人均如此)。購買一臺3米視頻內窺鏡的 費用相當高，高到讓馬主人和所有除大部分精英外的訓馬師無法承擔。除費用之外 內窺鏡操作煩瑣且費時。沒有3米視頻內窺鏡的馬主人、訓馬者和獸醫必需向診所 或有內窺鏡的獸醫求診。這將花費額外的時間和支出，因為馬失去了馬主人、訓馬 師或常常是獸醫經手的照料，會令馬甚至更為緊張而且會失敗。而且，即使購買和使用了 3米視頻內窺鏡，結果也只限于此設備的可視范圍即 胃組織。雖然可用此類設備有效觀測并診斷胃潰瘍，卻仍然不能用該設備診斷馬其 余95%消化道潰瘍。因為內窺鏡不夠長和用內窺鏡時要充分排空后腸(大約為75英 尺小腸、盲腸和結腸)這就跟殺了馬差不多，因此用內窺鏡無法觀察后腸。實際上， 近年來文獻報道的馬結腸潰瘍高發病率都是通過死后觀察分析才完成的。因此本發明的主要目的是提供一種馬潰瘍和消化道出血的檢測試劑盒和運用該 檢測試劑盒的相關方法，來有效診斷馬胃潰瘍或出血和結腸潰瘍或出血。本發明的 相關目的是提供對馬胃潰瘍或出血或結腸潰瘍或出血或兩者的高度特異性指征。本 發明的另一個相關目的是高度可靠地鑒定馬存在的潰瘍或出血和鑒定馬存在的潰瘍 類型，而不會產生過度假陽性讀數。本發明的另一個目的是簡單迅速地進行檢測，進行此檢測的用戶不需要專門技 術或進行培訓。本發明還有一個目的是它是完全自主進行、不需要實驗室分析或額 外的處理設備因此可在任何地方如現場進行檢測。本發明還有另一個目的是在幾分 鐘內快速提供檢測結果而不需要更長時間。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒的結構還必須耐用和能夠長期ie存，試劑盒不需要特殊的貯存條件能確保試劑盒有長期使用壽命。為了提高本發明馬潰瘍或出血檢測試劑盒的市場吸引力，它還應不昂貴從而能夠擁有最廣泛的市場前景。最終， 還有一個目的是本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒及其方法的所有上述優點和目的 實現不會帶來任何實質性相關缺陷。發明概述本發明克服了以上背景技術所述的缺陷和局限性。本發明提供一種能以高靈敏 度和特異性鑒定馬的胃和/或結腸潰瘍和其它消化道出血的馬潰瘍和消化道出血檢測 試劑盒以及使用所述檢測試劑盒的方法，利用該馬潰瘍或出血檢測試劑盒及方法能 清楚地區別胃潰瘍或出血與結腸漬瘍或出血。本發明的潰瘍或出血檢測指糞血檢測， 因為它可鑒定所測試馬的糞便中的血液成分。根據本發明所述，鑒定到兩種血液成分可分別高度表示存在胃潰瘍或出血和/或 結腸潰瘍或出血。本發明人測到糞便中含有完整的馬白蛋白極有可能是來源于結腸。 這是因為胃潰瘍時馬血液白蛋白(和潰瘍產生的到達十二指腸的其它脊髓動物血液成 分)已受到胃酸和胃肽酶降解，而無法在糞便中檢測到馬白蛋白。然而，胃潰瘍或出 血的血液中所含的馬血紅蛋白至少一部分可逃避胃酸或胃肽酶的作用而留存下來， 而能在糞便中檢測到。因此糞便中存在完整的馬白蛋白表示存在結腸潰瘍或出血，而存在馬血紅蛋白 表示示存在胃潰瘍或出血或結腸潰瘍或出血。本領域技術人員將會明白利用馬白蛋 白和馬血紅蛋白作為指示物的馬潰瘍或出血檢測試劑盒及方法，將提供對一種或多 種馬潰瘍或出血的存在和定位均為良好的指示劑。本發明馬潰瘍或出血檢測試劑盒 和方法的優選實施形式是設計用來檢測馬白蛋白和馬血紅蛋白指示物存在的免疫測 定，具體地說，本發明馬潰瘍或出血檢測的優選實施方式是酶聯免疫吸附試驗("ELISA"檢測)，它是生物化學中普遍用于檢測樣品中是否存在特定物質的方法。 ELISA檢測是快速的免疫化學檢測，其包含抗體或抗原(免疫分子)和酶(催化生物化學反應的蛋白質)。可用ELISA檢測具有免疫原性的物質，主要是蛋白質(與小分子和離子例如葡萄糖和鉀離子相反)，例如抗體、細菌性抗原和激素。 一種所謂的 "快速"ELISA檢測是側流免疫測定("LFI")檢測，其試驗用膜中的液體通道一端連接液體來源另一端連接到液體壑，沿膜有3個不連續的分開區域。第一區域含有偶聯顯色劑例如有色乳膠小珠或染料或膠體金的標記抗體。所述標記抗體可隨液體從第一區流到第二和第三區，最終到達液體壑。如果液體中存在感興趣的物質，它會結合此標記抗體。第二區，通常為橫跨此膜的伸展直線區，包含結合于此膜的抗體。第二區的抗體對感興趣的物質具有親和性(將其吸附和固定到該區)，與標記抗體 和結合于第二區抗體的感興趣的物質可形成"夾心"結構，從而形成著色線，表明 存在感興趣物質為陽性讀數。液體中含的感興趣的物質越多，與感興趣物質一同結 合于第二區抗體的標記抗體就越多。第三區，通常也是橫跨此膜的伸展直區，只要有足夠的流量和體積利用不同的 抗體/抗原反應就能形成著色線，無論是否存在感興趣的物質。其作用是作為對照表 明該檢測系統運行良好。第三區位于第二區與第一區相反的另一側，可顯示受檢液 體已越過第二區，從而表明提供給該檢測系統的檢測液體足夠使此檢測系統正常工 作。此檢測系統的大致說明參見May等的美國專利第5,602,040號，該專利基于兩種 抗體。將含吸附于有色乳膠或膠體金顆粒表面的第一抗體的干燥顆粒加到硝酸纖維 素膜第一末端，形成上述第一區。使第二抗體吸附于硝酸纖維素膜形成一條線，產生上述第二區。使液體樣品吸附進入硝酸纖維素膜第一末端進行檢測。液體流動使第一區中的 顆粒游離此時待測分析物可與所述顆粒上的抗體結合。在第二區，待測分析物也結 合位于線中的第二抗體，從而形成可見的顏色線條表明存在所述分析物。這種類型 的免疫色譜檢測技術依賴于流體通過膜的流動，可稱為"側流技術"。將美國專利第 5,602,040號納入本文作為參考，如Kouvonen等的美國專利第5,712,170號那樣，它 們對此領域的該技術進行了極佳的概述。可采用已有的第二種試驗形式，利用"競爭性排除"技術來產生陽性或陰性結 果。與上述夾心試驗不同，將純化的抗原(馬白蛋白或馬血紅蛋白)固定于膜條上，而 靶抗體包含在流動相內。當檢測樣品中不存在靶抗原時，此抗體游離出來與流動相 一起移動而結合于膜條上的固定抗原，在膜條上產生一條線。因此，出現著色線表 示陰性結果。另一方面，如果，檢測樣品中存在靶抗原，那么此抗原將結合流動相中的抗體， 而不能與試驗帶結合，從而不出現著色線。因此，此檢測中不出現著色線表示陽性 結果。已報道采用Varian，Inc.公司制造的商標名為ONTRAK TESTCUP由Roche Diagnostics獨家銷售的這種類型的競爭性排除檢測技術作藥物檢測。Bachand的美國 專利第6，375，897對其有所描述，該專利納入本文作為參考。LFI檢測的制造成本相對便宜、易于操作，可提供快速分析而無需實驗設備。LFI 檢測中的抗體通常通過用感興趣的物質接種動物，然后動物產生對該物質的抗體而獲得。利用這種生物化學關聯作為分離和檢測感興趣物質的機理。LFI檢測的靈敏度和特異性與放射免疫試驗("RIA")檢測相當。LFI檢測的額外優點是不需要放射性 同位素或放射計數儀。本發明馬潰瘍或出血檢測試劑盒的優選實施方式包括置于一個或兩個塑料容器 內的兩個試驗帶。待測馬的糞便液滴放在容器(可以是例如桶、罐、塑料袋或杯)中， 加入溶液(可以是水或含有緩沖劑如鹽的水)，攪拌此混合物使之徹底混合。用點樣器 例如滴眼管從此容器中取幾滴液體滴到容器內的試驗帶上。經優選的檢測時間約5-30分鐘后，這兩個試驗帶將呈現表示對照指示物的可見 標記，如果存在待檢測指示物，可看見的標記意味著檢測到那些分別表示胃潰瘍或 出血和/或結腸潰瘍或出血的指示物。本發明采用兩種指示物， 一種表示存在胃潰瘍 或出血，另一種表示存在結腸潰瘍或出血。優選實施方式中，檢測表明存在結腸潰瘍或出血的指示性感興趣物質是馬白蛋 白，而檢測表明存在胃潰瘍或出血或結腸潰瘍或出血或兼有胃和結腸潰瘍或出血的 指示性感興趣物質是馬血紅蛋白。因此，本發明馬潰瘍或出血檢測試劑盒和方法可 診斷胃和/或結腸潰瘍或出血從而為立即治療提供依據。因此可明白本發明所述的馬潰瘍和消化道出血檢測試劑盒和運用此試劑盒的相關方法，能有效地診斷馬胃潰瘍或出血和結腸潰瘍或出血以及其它消化道出血。本 發明的所述馬潰瘍或出血檢測試劑盒和方法提供了對胃漬瘍或出血和/或結腸潰瘍或 出血的高度特異性指征。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒和方法對鑒定馬是否存 在潰瘍或出血以及鑒定馬存在的潰瘍類型高度可靠，不會產生過度的假陽性讀數。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒和方法既簡單又實施快速，而且用戶進行該 檢測無須具備特殊技能或培訓。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒是完全自主進行， 不需要實驗室分析或額外處理設備，從而能在任何地方如現場進行檢測。本發明的 馬潰瘍或出血檢測試劑盒和方法可在數分鐘內不需要更長時間快速提供檢測結果。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒的結構兼具耐用性和長期貯存，該檢測試劑 盒無需特殊貯存條件并具有長期使用壽命。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒的結 構還便宜使它具有最廣闊的市場前景。最后，實現本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑 盒和方法的所有上述優點和目標不會造成任何實質性相關缺陷。
通過參見以下附圖可最好地理解本發明的這些和其它優點 圖1是顯示馬消化道解剖構造的示意圖；圖2顯示用本發明技術構造的用于馬潰瘍或出血檢測的試劑盒的等比例圖，盒 中的第一容器裝有胃潰瘍或出血試驗帶，第二容器裝有結腸潰瘍或出血試驗帶；圖3顯示用本發明技術構造的用于馬潰瘍或出血檢測的試劑盒的另一實施方式的等比例圖，盒中只有一個容器，裝有胃潰瘍或出血試驗帶和結腸潰瘍或出血試驗帶；禾口圖4是說明用馬潰瘍或出血檢測試劑盒檢測表明是否存在馬白蛋白和檢測是否 存在馬血紅蛋白的結果圖。優選實施方式的詳述在討論本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒和方法之前，先簡單討論一下馬消化 系統的解剖構造會有幫助。參見圖l，顯示馬20的側面，圖解說明了馬的消化道。 馬20的消化道可分成前腸，用參考數字22表示，和后腸，用參考數字24表示。馬20的消化道從它的嘴26開始，繼續延伸通過食道28進入胃30，然后進入小 腸32，胃和小腸一起構成馬20的前腸22。馬20的前腸22構成馬20消化道相對容 量的約35%-40%。從小腸32開始，消化道延伸通過盲腸34、大結腸36和小結腸38終止于直腸 40。馬20的消化道的這些組件共同組成馬20的后腸24。后腸24構成馬20消化道 相對容量的約60-65%。本發明馬潰瘍或出血檢測試劑盒的優選實施方式見圖2所示。顯示了用于檢測 胃潰瘍或出血的含有馬潰瘍或出血檢測試劑盒的第一容器50。該第一容器50有一加 入待分析液體的孔52。位于此第一容器50上還有一視窗54，通過此視窗可看到其 中的含檢測標記帶58和對照標記帶60的試驗帶56，可顯示存在胃潰瘍或出血。圖2還顯示了馬潰瘍或出血檢測試劑盒包括的用以檢測結腸潰瘍或出血的第二 容器70。第二容器70上有一加入待分析液體的孔72。第二容器70上也有一視窗74， 通過此視窗可看到其中的含檢測標記帶78和對照標記帶80的試驗帶76。當檢測到 感興趣物質的存在時，檢測標記帶78變得可見，從而顯示存在結腸潰瘍或出血。雖 然看起來第一容器50和第二容器70彼此靠近，但在如圖2所示的實施方式中它們 是分開的。現參見圖3，顯示裝有一容器90的另一種實施方式的檢測試劑盒。所述容器卯 上只有一個加入待分析液體的(但更寬)孔92。容器90的兩側還有第一和第二視窗94 和96。通過第一視窗94可看到其中的含檢測標記帶100和對照標記帶102的試驗帶 98。當檢測到感興趣物質的存在時，檢測標記帶100變得可見，從而顯示存在胃潰瘍或出血。將足夠的液體通過孔92加入容器90時，對照標記帶102變得可見。通過第二視窗96可看到其中的含檢測標記帶106和對照標記帶108的試驗帶 104。當檢測到感興趣物質的存在時，檢測標記帶106變為可見，從而顯示存在胃潰 瘍或出血。將足夠的液體通過孔92引入容器90時，對照標記帶108變得可見。圖2中試驗帶56和76和圖3中試驗帶98和104的構建是本領域技術人員公知 的。同樣，設計具有不同容器的各種其它類型的檢測試劑盒的結構也是本領域技術 人員公知的。圖2和3所示檢測裝置的關鍵部分是用于檢測胃和結腸潰瘍或出血的 抗體的類型及其衍生物，這將在后面討論。在討論之前，先對圖2和3所示檢測試劑盒的操作進行簡要描述。獸醫、訓馬 師或馬主人收集待測馬的代表性糞便樣品(范圍從幾克到一次完整糞便)。然后將糞便 樣品放進容器例如桶或罐或塑料袋中，將其與水溶液(可以是水或含有緩沖劑如鹽的 水)通過振蕩、攪拌或揉搓相混合。然后，獸醫、訓馬師或馬主人用滴眼管或其它常 規裝置將幾滴液體通過容器50和70上的孔52和72(分別見圖1的實施方式)或通過 容器90上的孔92(圖2的實施方式)滴入此檢測裝置。幾分鐘后，圖1實施方式中的對照標記帶60和80變得可見，圖2實施方式中 的對照標記帶102和108變得可見，表示檢測試劑盒的操作正確。如果檢測到馬白 蛋白，圖1實施方式的檢測標記帶58將變得可見，圖2實施方式的檢測標記帶100 變得可見。同樣，如果檢測到馬血紅蛋白，圖1實施方式的檢測標記帶78變得可見， 或圖2實施方式的檢測標記帶106變得可見。憑此檢測來診斷胃和/或結腸潰瘍或出 血，如果檢測到任何一種或檢測到兩種可為立即治療提供依據。雖然圖2和3所示實施方式顯示了圖2所示實施方式的分開的試驗帶56和76 和圖3所示實施方式的分開的試驗帶98和104，但本領域技術人員立即就能明白可 將這兩種檢測合并在一個膜上。此外，除檢測標記帶顯色表示檢測到馬白蛋白或馬 血紅蛋白的上述檢測之外，也可采用競爭性排除技術，該技術中檢測標記帶顯色表 示沒有檢測到馬白蛋白或馬血紅蛋白。在本發明馬潰瘍或出血檢測試劑盒及方法的優選實施方式中，當檢測到的感興 趣物質是馬白蛋白時，表示存在結腸潰瘍或出血，當檢測到的感興趣物質是馬血紅 蛋白時，表示存在胃潰瘍或出血。因為在馬糞便中檢測到馬白蛋白只可能來源于結 腸，因此選擇馬白蛋白來表明存在結腸潰瘍或出血具有特異性。這是因為胃潰瘍或 出血到達十二指腸的其它脊椎動物的血液會受到胃酸和胃肽酶的降解，因此在糞便 中檢測到馬白蛋白根本不可能來源于胃潰瘍或出血。然而，胃酸和胃肽酶的作用不可能完全降解或消化馬血紅蛋白。糞便中檢測到 的馬血紅蛋白可以來源于胃和/或結腸，因此表明有胃潰瘍或出血和/或結腸潰瘍或出 血。因而，對結腸性和胃漬瘍或出血的區分依賴于馬白蛋白是否存在。參見圖4，可見如果檢測到馬白蛋白，則肯定存在結腸潰瘍或出血。如果未檢測 到馬白蛋白但檢測到馬血紅蛋白，則有可能存在胃潰瘍或出血。如果馬白蛋白或馬 血紅蛋白均未被檢測到，則既不存在胃潰瘍或出血也不存在結腸潰瘍或出血。最后， 如果同時檢測到馬白蛋白和馬血紅蛋白，則可能只存在結腸潰瘍或出血，或者同時 存在胃潰瘍或出血或者結腸潰瘍或出血。因此，本領域技術人員將明白本發明的馬 潰瘍或出血檢測試劑盒及方法提供了診斷胃和/或結腸潰瘍或出血、和為這些潰瘍的 治療提供了可靠的機制和方法。馬白蛋白檢測馬白蛋白檢測是一種高靈敏度的單克隆/多克隆免疫測定法。建立此種免疫測定 方法需要4個步驟，分別稱為免疫接種、融合、克隆和制備。第一階段是免疫接種， 用馬類獨有的馬白蛋白基因序列衍生的馬白蛋白肽序列注射家兔、小鼠、大鼠、豚 鼠或其他合適的實驗動物。這將激發實驗動物的免疫反應，其血液和脾臟產生大量 抗體。約6周時，動物抽血用ELISA試驗檢驗抗體。包括使實驗動物血與馬血清體外 反應。如果存在抗體，ELISA將發生顏色變化。如果存在的抗體水平不夠高，需要 對實驗動物進行一次或多次馬白蛋白加強注射。可用這些第一批血液來制備多克隆 抗體。此階段通常需要約3個月。此階段得到的多克隆抗體可用來構建檢測試劑盒。第二階段是融合，在該階段中，處死實驗動物取其脾臟分離分泌馬抗體的細胞。 然后將這些細胞與骨髓瘤細胞系融合使它們可以無限增殖，如Stanker等人的美國專 利第5,552,295號所述，該專利納入本文中作為參考。 一旦無限增殖化成功，可無限 次培養這些細胞以不斷提供抗體。然后將雜交瘤(融合細胞)接種到多個96孔微量滴定板內。用另一次ELISA試驗 檢測這些細胞，將那些顯示能分泌相應抗體的細胞移到另一個微量滴定孔內擴增。 用ELISA試驗進一步檢測這些細胞得到能產生所需抗體的純細胞系，此階段通常需 要約5-6周。第三階段是克隆，將第二階段中檢測陽性的細胞進行克隆并用ELISA試驗進一 步檢測。為了得到穩定的克隆可能需要多輪克隆。然后將這些克隆注射小鼠腹腔產 生腹水。純化腹水液中的單克隆抗體然后備用。本領域技術人員不難明白這種技術將產生特異性針對馬白蛋白的新單克隆抗體。此第三階段通常需要約3個月。可用抗原免疫雞，在雞蛋蛋黃中產生抗體。因為雞能下足夠多的蛋來提供抗體， 因此這項技術不需要上述的克隆階段。然而，這些抗體的純化階段與上述類似。第四即最后階段是制備檢測試劑盒。按本領域常規將所述抗體涂布在多孔硝酸 纖維素膜或尼龍膜上。當將馬白蛋白放到此檢測裝置上時，它被吸入通過膜尋找結 合于帶有顯色劑的標記抗體，最終被檢測標記帶中的抗體捕獲。標記抗體導致顏色 深度變化清楚表明所檢測的馬糞便中存在馬白蛋白。本領域技術人員將會明白這種 新的抗體試驗對馬白蛋白兼具靈敏度(靈敏度高達約百萬分之一(l微克/毫升))和特異 性。馬血紅蛋白檢測馬血紅蛋白檢測是一種高靈敏度的單克隆/多克隆免疫測定法。建立此種免疫測 定方法需要4個步驟，分別為免疫接種、融合、克隆和制備。第一階段是免疫接種， 用馬類獨有的馬血紅蛋白基因序列衍生的馬血紅蛋白肽序列注射家兔、小鼠、大鼠、 豚鼠或其他合適的實驗動物。這將激發實驗動物的免疫反應，其血液和脾臟產生大 量抗體。約6周時，動物抽血用ELISA試驗檢驗抗體。包括使實驗動物血與馬血清體外 反應。如果存在抗體，ELISA將發生顏色變化。如果存在的抗體水平不夠高，需要 對實驗動物進行一次或多次馬血紅蛋白加強注射。可用這些第一批血液來制備多克 隆抗體。此階段通常需要約3個月。此階段得到的多克隆抗體可用來構建檢測試劑J§L 。第二階段是融合，在該階段中，處死實驗動物取其脾臟分離分泌馬抗體的細胞。 然后將這些細胞與骨髓瘤細胞系融合使它們可以無限增殖，如以上面Stanker等人的 專利中所述。 一旦無限增殖化成功，可無限次培養這些細胞以不斷提供抗體。然后將雜交瘤(融合細胞)接種到多個96孔微量滴定板內。用另一次ELISA試驗 檢測這些細胞，將那些顯示能分泌相應抗體的細胞移到另一個微量滴定孔內擴增。 用ELISA試驗進一步檢測這些細胞得到能產生所需抗體的純細胞系，此階段通常需 要約5-6周。第三階段是克隆，將第二階段中檢測陽性的細胞進行克隆并用ELISA試驗進一 步檢測。為了得到穩定的克隆可能需要多輪克隆。然后將這些克隆注射小鼠腹腔產 生腹水。純化腹水液中的單克隆抗體然后備用。本領域技術人員不難明白這種技術 將產生特異性針對馬血紅蛋白的新單克隆抗體。此第三階段通常需要約3個月。可用抗原免疫雞，在雞蛋蛋黃中產生抗體。因為雞能下足夠多的蛋來提供抗體， 因此這項技術不需要上述的克隆階段。然而，這些抗體的純化階段與上述類似。第四即最后階段是制備檢測試劑盒。按本領域常規將所述抗體涂布在多孔硝酸 纖維素膜或尼龍膜上。當將馬血紅蛋白放到此檢測裝置上時，它被吸入膜尋找結合 于帶有顯色劑的標記抗體，最終被檢測標記帶中的抗體捕獲。標記抗體導致顏色深 度變化清楚表明所檢測的馬糞便中存在馬血紅蛋白。本領域技術人員將會明白這種 新的抗體試驗對馬兼具靈敏度(靈敏度高達約百萬分之一(l微克/毫升))和特異性。組合檢測將馬白蛋白檢測與馬血紅蛋白檢測組合到一個檢測試劑盒中，創建了一種馬潰 瘍或出血的簡單的、費用低廉、高靈敏度和特異性的診斷檢測。或者用分開的試劑 盒來提供這兩種檢測。優選的實施方式中，這兩種試驗帶與同一個單孔相連，從而 應用一次糞便液就能滿足兩次檢測。如果馬白蛋白檢測結果陽性，表明有結腸潰瘍或出血。如果只有馬血紅蛋白檢 測結果陽性，表明有胃潰瘍或出血。如果兩種結果均為陽性，那么表明要么是結腸 潰瘍或出血，要么兼有胃潰瘍或出血和結腸潰瘍或出血。本領域技術人員將明白此 雙重檢測可提供方便、非侵入性的胃潰瘍或出血(目前診斷困難并且費用昂貴)以及結 腸潰瘍或出血(目前的試驗不能精確診斷)的檢測。雖然本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒和方法是以診斷馬的胃潰瘍或出血和結 腸潰瘍或出血為目標的優選實施方式，但考慮本發明的范圍還包括可用其診斷其它 動物的胃潰瘍或出血和結腸潰瘍或出血。可專門設計具體動物的特殊潰瘍或出血檢 測試劑盒用它來檢測該具體動物的白蛋白和血紅蛋白。或者通過提供能與多種動物 的白蛋白特異性結合的白蛋白抗體以及能與多種動物的血紅蛋白特異性結合的血紅 蛋白抗體來制造一種通用的動物胃潰瘍或出血和結腸潰瘍或出血的檢測試劑盒。因此，從本發明的優選實施方式詳細描述中可以明白，本發明所述馬潰瘍和消 化道出血檢測試劑盒和該試劑盒的使用方法能有效診斷馬胃潰瘍或出血和結腸潰瘍 或出血。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒和方法提供了存在胃潰瘍或出血和/或結 腸潰瘍或出血或二者的高特異性指標。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒和方法對 鑒定馬潰瘍或出血的存在以及鑒定馬潰瘍的類型或出血部位相當可靠，不會產生過 度的假陽性讀數。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒和方法操作簡單快速，不需要專門技術或培 訓，用戶就能進行檢測。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒完全自主，不需要實驗室分析或其它處理設備，能在任何地方例如現場進行檢測。本發明的馬潰瘍或出血 檢測試劑盒和方法能在幾分鐘內快速提供檢測結果，而不需要更長時間。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒的結構建兼具耐用性可長期貯存，此試劑盒 不需要特殊貯存條件具有長期使用壽命。本發明的馬潰瘍或出血檢測試劑盒的構建 便宜而提高了它的市場吸引力，因此具有最廣闊的市場前景。最后，本發明的馬潰 瘍或出血檢測試劑盒和方法的所有上述優點和目標的實現不會引起任何實質性相關 缺陷。雖然上述的本發明馬潰瘍或出血檢測試劑盒已得到證明并通過參見本發明的具 體實施方式和應用對其進行了描述，但說明和描述的目的不意味著窮盡或限制本發 明于所公開的具體實施方式
和應用。本領域普通技術的人員將明白到在不背離本發 明思路和范圍的前提下，可對本文所述的本發明進行許多改變、修飾、變化或變更。 選擇并描述具體實施方式
和應用來提供對本發明原理及其實際應用的最佳說明讓本 領域普通技術人員將本發明用于各種實施方式和作出各種修飾以適合所考慮的特定 用途。因此，當按照公平、合法和公正原則進行解釋時，所有此類改變、修飾、變 異和變更應視為本文附件的權利要求書所限定的本發明的范圍內。
權利要求
1.一種用于檢測并定位馬潰瘍或消化道出血的快速檢測試劑盒，其包括第一試驗帶，用于快速免疫測定或過氧化物酶反應以檢測馬胃潰瘍或出血和/或結腸潰瘍或出血；和第二試驗帶，用于快速免疫測定以檢測馬結腸潰瘍或出血。
2. 如權利要求1所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述第一試驗帶檢測馬血紅蛋白，所述馬血紅蛋白的存在指示存在是馬胃潰瘍或出血和/或結腸潰瘍或出血。
3. 如權利要求2所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述第一試驗帶含有抗 馬血紅蛋白抗體，所述抗體能特異性結合馬血紅蛋白。
4. 如權利要求3所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬血紅蛋白抗體 結合馬血紅蛋白的靈敏度等于或大于約百萬分之一(l微克/毫升)。
5. 如權利要求3所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬血紅蛋白抗體 是單克隆抗體。
6. 如權利要求3所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬血紅蛋白抗體 是多克隆抗體。
7. 如權利要求3所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬血紅蛋白抗體 分離自接種過的家兔、小鼠、大鼠或豚鼠的血清或浸軟的脾臟。
8. 如權利要求3所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬血紅蛋白抗體 是用能產生和分泌特異性結合馬血紅蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞系制備的。
9. 如權利要求3所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬血紅蛋白抗體 是用免疫細胞與無限增殖骨髓瘤細胞系雜交并表達馬血紅蛋白抗體來制備的。
10. 如權利要求9所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述免疫細胞分離自 接種過的家兔、小鼠、大鼠或豚鼠的血清或浸軟的脾臟。
11. 如權利要求1所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述第一試驗帶還包 含可證明所述檢測正常進行的對照指示物。
12. 如權利要求1所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述第二試驗帶檢測 馬白紅蛋白，所述馬白紅蛋白的存在表明馬存在結腸潰瘍或出血。
13. 如權利要求12所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述第二試驗帶含有 抗馬白蛋白抗體，所述抗體能特異性結合馬白蛋白。
14. 如權利要求13所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬白蛋白抗體結合馬白蛋白的靈敏度等于或大于約百萬分之一(l微克/毫升)。
15. 如權利要求13所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬白蛋白抗體 是單克隆抗體。
16. 如權利要求13所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬白蛋白抗體 是多克隆抗體。
17. 如權利要求13所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬白蛋白抗體 分離自接種過的家兔、小鼠、大鼠或豚鼠的血清或浸軟的脾臟。
18. 如權利要求13所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬白蛋白抗體 是用能產生和分泌特異性結合馬白蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞系制備的。
19. 如權利要求13所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述抗馬白蛋白抗體 是用免疫細胞與無限增殖骨髓瘤細胞系雜交并表達馬白蛋白抗體來制備的。
20. 如權利要求19所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述免疫細胞分離自 接種過的家兔、小鼠、大鼠或豚鼠的血清或浸軟的脾臟。
21. 如權利要求1所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述第二試驗帶還包 含可顯示所述檢測正常進行的對照指示物。
22. 如權利要求1所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述第一和第二試驗 帶包含同時檢測馬血紅蛋白和馬白蛋白的單條試驗帶，所述馬血紅蛋白的存在表明馬 存在胃潰瘍或出血和/或結腸潰瘍或出血，所述馬白蛋白的存在表明馬存在結腸潰瘍 或出血。
23. —種制備檢測并定位馬潰瘍或消化道出血的快速檢測試劑盒的方法，包括 提供第一試驗帶，該試驗帶通過快速免疫試驗或過氧化物酶反應檢測馬胃潰瘍或出血和/或結腸潰瘍或出血；和提供第二試驗，該試驗帶通過快速免疫試驗檢測馬結腸潰瘍或出血。
24. 如權利要求23所述的方法，其特征在于，第一試驗帶檢測馬血紅蛋白，馬 血紅蛋白的表明馬存在胃潰瘍或出血和/或結腸潰瘍或出血。
25. 如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述第一試驗帶含有能特異性結 合馬血紅蛋白的抗馬血紅蛋白抗體。
26. 如權利要求23所述的方法，其特征在于，第二試驗帶檢測馬白蛋白，馬白 蛋白的存在表明馬存在結腸潰瘍或出血。
27. 如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述第二試驗帶含有特異性結合馬白蛋白的抗馬白蛋白抗體。
28. 如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一試驗帶還含有證明所述 檢測已正常進行的對照指示物，所述第二試驗帶也含有證明所述檢測已正常進行的 對照指示物。
29. 如權利要求23所述的方法，其特征在于，所述第一和第二試驗帶包含 同時檢測馬血紅蛋白和馬白蛋白的單條試驗帶。
全文摘要
本發明公開了一種診斷和檢測裝置以及使用該裝置的相關方法，得到馬白蛋白和馬血紅蛋白的抗體用于檢測裝置、試劑盒，和檢測及定位馬胃和結腸潰瘍或出血的方法中。將待檢測馬的糞便液滴與緩沖液一起放入容器中徹底混合，然后從容器中取幾滴液體放入檢測試劑盒中。檢測試劑盒中出現可視標記意味著檢測到馬血紅蛋白和馬白蛋白標記物，它們分別表明存在胃和/或結腸潰瘍或出血。
文檔編號G01N33/558GK101221174SQ200710186699
公開日2008年7月16日 申請日期2007年11月20日 優先權日2006年11月28日
發明者F·L·佩里格里尼, S·D·卡特 申請人:自由健康有限公司