專利名稱：一種在微通道中固定細胞的方法
技術領域：
本發明涉及固定細胞的方法，具體地，涉及一種在微通道中固定細胞的方法。
背景技術：
細胞是生命體結構和生命活動的基本單元，利用活細胞在分子水平上進行復雜生命現 象的研究已成為當代生命分析化學、藥物篩選、藥物代謝及藥物動力學等領域的一項不可 或缺的課題。另外，以微通道為基本結構的微分析體系具有集成化和功能化的潛在優勢， 將細胞固定在微通道中進行分析檢測是對細胞水平研究的一項革新，具有試劑用量少、分 析速度快、可重復使用、易于與反應產物分離等特點。
目前已有文獻報道 (Won—Gun Koh, Alexander Revzin, Michael V. Pisshko, Poly(ethylene glycol) hydrogel microstructures encapsulating living cells, 丄朋g腦k 2002, 18， 2459-2462.)，利用水凝膠包埋法可將細胞固定在微通道。該方法步 驟包括，首先形成不可逆密封及密閉微通道；再形成含細胞的水凝膠前體；然后在微通道 內形成凝膠；最后用緩沖溶液沖洗通道，在微通道內可得到含有細胞的水凝膠微結構。該 方法的缺點是，微通道中的水凝膠極大增加了微流體控制難度，不利于后續細胞分析研 究。因此，本發明所要解決的技術問題，是設計一種新的在微通道中固定細胞的方法，不 僅要工藝簡單、操作方便、可有效保持細胞的活性，而且易于實現微流體的操控，從而為 微通道細胞分析研究奠定基礎。
發明內容
本發明的目的在于提供一種工藝簡單、操作方便、易于實現微流體操控、可有效保持 細胞活性的在微通道中固定細胞的方法。
本發明的技術方案如下 一種在微通道中固定細胞的方法，它包括以下步驟處理 該微通道的內壁，使其帶有正、負電荷中的一種電荷；將一種與該內壁電荷極性相反
的聚電解質組裝于該微通道內壁，以形成一界面；將荷電的生物聚電解質修飾在該界面 上；最后，將含細胞的培養液引入該微通道內，利用細胞表面的荷電性將細胞固定在微 通道中。
對于微通道系由內徑為100-500Mm的石英毛細管構成的實例，處理該微通道的內壁 是用堿溶液潤洗該內壁，使其帶負電。對該內壁潤洗的時間為0.2-2小時。所述的將 聚電解質組裝于該微通道內壁，包括將多種荷電相反的聚電解質依次層層組裝于該微通 道內壁，形成一界面。所述的將聚電解質組裝于該微通道內壁，包括將聚電解質溶液以 100-500WVh引入該微通道內并停留5-60分鐘。所述的將生物聚電解質修飾在該界面， 包括將生物聚電解質溶液以100-500叱/h引入該微通道內并停留5-60分鐘。所述的將 含細胞的培養液引入該微通道內，利用細胞表面的荷電性將細胞固定在微通道中，包括 將培養液置入培養箱中12-24小時，再以30-200 u L/h的流速更換培養液。
本發明的優點是
1. 工藝簡單，操作方便，原料易得；
2. 因微通道的容積小，所以樣品和試劑消耗量小；
3. 因固定細胞的表面生物兼容性好，所以可保持細胞活性；
4. 因細胞固定于微通道內表面，易于實現微流體操控，所以有利于進行后續細 胞分析研究；
具體實施例方式
以下結合實例對本發明的具體步驟作進一步的詳述。
在本實例中，采用100-500剛內徑長為10-100 cm的石英毛細管作為本發明微通道的 具體實例，因為目前絕大部分微通道均由石英構成，并且，該微通道的外端可與一蠕動泵 相連，以實現自動操作。
首先，處理該微通道的內壁，使其帶有正、負電荷中的一種電荷，可利用蠕動泵以 0. l-lmol/L濃度的如NaOH堿溶液潤洗石英毛細管內壁約0. 2-2小時，使其內壁帶有負電 荷。
為提高下面組裝步驟的效果，在此還可用例如5倍于石英毛細管容積的水進行沖洗， 以清除殘余的堿溶液。
其次，將聚電解質溶液如聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液，以100-500化/h
流速引入石英毛細管中，以對該石英毛細管內壁進行組裝，時間約5-60分鐘。
進一步，為提高組裝界面的穩定和均勻，有利于以下生物聚電解質在其上的修飾，本 步驟還可利用靜電作用將多種荷電相反的聚電解質依次層層組裝于該微通道內壁。也就是 說，在上述引入PDDA溶液后再引入如聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)溶液，以此類推，完成多層 組裝，以形成更為穩定均一的界面。
重要的是，為構建一個生物兼容的微環境，在上述組裝步驟后，還需用荷電的生物電 解質對上述組裝的界面進行修飾，具體地，可用例如聚-L-賴氨酸(PLL)溶液，以 100-500WVh流速引入石英毛細管中，修飾時間約5-60分鐘。
最后，以30-200叱/h的流速將含有lxl(f-5xl(T個/niL乳腺癌細胞MCF--7 (或其它待 研究的細胞)的培養液引入石英毛細管中，置入細胞培養箱中。12-24小時后，以 30-200叱/h的流速更換毛細管中的培養液，處于未固定狀態的細胞由毛細管中洗脫出來， 大多數細胞因處于固定狀態而留于毛細管中。
通過比較毛細管中最初接種的細胞和接種24小時后毛細管中處于固定狀態的細胞， 可以檢測毛細管中固定化細胞的活性，為此，采用600-1200W7h流速的新鮮培養液將經 過本發明方法固定化細胞洗脫下來，收集，并進行臺盼藍排斥試驗，檢測結果證明固定化 的細胞至少可在微通道中存活48小時。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其并非用以限定本發明，任何熟習此技藝者， 在不脫離本發明之精神和范圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護范圍當視 所附之權利要求范圍所界定。
權利要求
1、一種在微通道中固定細胞的方法，其特征是，它包括以下步驟處理該微通道的內壁，使其帶有正、負電荷中的一種電荷；將一種與該內壁電荷極性相反的聚電解質組裝于該微通道內壁，以形成一界面；將荷電的生物聚電解質修飾在該界面上；最后，將含細胞的培養液引入該微通道內，利用細胞表面的荷電性將細胞固定在微通道中。
2、 根據權利要求l所述的一種在微通道中固定細胞的方法，其特征是，所述的微通道系 由內徑為100-500m的石英毛細管構成。
3、 根據權利要求2所述的一種在微通道中固定細胞的方法，其特征是，所述的處理該微 通道的內壁是用堿溶液潤洗該內壁，使其帶負電。
4、 根據權利要求3所述的一種在微通道中固定細胞的方法，其特征是，對該內壁潤洗的 時間為O. 2-2小時。
5、 根據權利要求l所述的一種在微通道中固定細胞的方法，其特征是，所述的將聚電解 質組裝于該微通道內壁，包括將多種荷電相反的聚電解質依次層層組裝于該微通道內壁，形 成一界面。
6、 根據權利要求1或5所述的一種在微通道中固定細胞的方法，其特征是，所述的聚電解 質為聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽(PDDA)溶液和聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)溶液。
7、 根據權利要求1或5所述的一種在微通道中固定細胞的方法，其特征是，所述的將聚 電解質組裝于該微通道內壁，包括將聚電解質溶液以100-500WVh流速引入該微通道內并停 留5-60分鐘。
8、 根據權利耍求1所述的一種在微通道中固定細胞的方法，其特征是，所述的生物聚電 解質為聚-L-賴氨酸(PLL)溶液。
9、 根據權利要求1或8所述的一種在微通道中固定細胞的方法，其特征是，所述的將生 物聚電解質修飾在該界面，包括將生物聚電解質溶液以100-500ML/h流速引入該微通道內并 停留5-6。分鐘。
10、 根據權利要求1所述的一種在微通道中固定細胞的方法，其特征是，所述的將含細 胞的培養液引入該微通道內，利用細胞表面的荷電性將細胞固定在微通道中，包括將培養液 置入培養箱中12-24小時，再以30-200 u L/h的流速更換培養液。
全文摘要
本發明公開一種在微通道中固定細胞的方法，該方法采用層層組裝技術將多種聚電解質分層、均勻地組裝于微通道的內壁，形成穩定、均一界面；然后將生物聚電解質修飾在界面上，構成一個生物兼容性的微環境；最后利用細胞表面的荷電性，將細胞固定在微通道中，在體外營建一種適合細胞生存的微環境。該方法工藝簡單，操作方便，易于實現微流體操控、可有效保持細胞活性。
文檔編號G01N33/48GK101196514SQ20071017352
公開日2008年6月11日 申請日期2007年12月28日 優先權日2007年12月28日
發明者劉寶紅, 吳會靈, 姜遠英, 曹永兵, 楊芃原, 季 紀, 范國榮, 陳禮潮 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學