專利名稱：：一種用量子點檢測細菌的方法
技術領域：
：本發明涉及納米生物技術，尤其涉及使用半導體納米粒子即量子點檢測細菌的方法。
背景技術：
：傳統的檢測細菌的方法包括分離培養、生化鑒定等，它們操作煩瑣耗時、靈敏度低且特異性不高，不能實現有效的監測作用。隨著免疫學、生物化學、分子生物學的不斷發展，近年來已創建了不少快速、敏感的微生物學檢測方法，加快了微生物檢驗速度，顯著提高了檢測水平，但它們各自也有相應的不足，常用的檢測方法的特點列于表1中。表l目前常用檢測方法和各自特點<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>細菌檢測，尤其是食源性致病菌的檢測在實際應用中非常重要。食源性致病菌是指以食物為載體，導致人類發生疾病的一大類細菌，近年來，全球食品安全事件頻頻發生，如美國的"李斯特氏桿菌事件"、美國"花生醬沙門氏菌污染事件"等。《2006年上海食品安全狀況報告》同樣指出食品中毒致病因素主要仍以細菌性致病為主。根據上海市2006年的調査，在肉類制品、蔬菜、水果、乳制品、豆類制品、谷類制品、水產品等22類31327件食品進行監督抽檢，其中肉類制品、水產品食源性、油炸食品、豆制品致病菌的檢出率最高，食源性致病菌對人類健康帶來很大危害。因此，本領域迫切需要提供一種新的檢測細菌，尤其是檢測致病菌的方法，它靈敏度高、檢測限可以達到極低的水平，并且所需設備簡單、成本低廉。
發明內容本發明旨在提供一種新的檢測細菌的方法。本發明提供了一種檢測細菌的方法，所述的方法包括步驟(1)將量子點、交聯劑和抗體混合，得到含有交聯有抗體的量子點的溶液，所述的抗體能與待測細菌特異性結合；(2)將含有交聯有抗體的量子點的溶液和待測樣品混合；(3)富集量子點一抗體一待測細菌復合物，進行熒光觀測，有熒光的表示待測樣品中有待測細菌；所述的交聯劑選自乙基一(3—二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDAC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS);所述的富集量子點一抗體一待測細菌復合物的方法包括離心和使用免疫磁珠。在另一優選例中，所述的方法包括步驟-(1)將量子點、交聯劑和抗體混合，得到含有交聯有抗體的量子點的溶液，所述的抗體能與待測細菌特異性結合；(2)將含有交聯有抗體的量子點的溶液和待測樣品混合；(3)離心除去上清液，然后對下層液進行熒光觀測，有熒光的表示待測樣品中有待測細菌；所述的交聯劑選自乙基一(3—二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDAC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)。在另一優選例中，所述的量子點、交聯劑和抗體的混合比例為25—500nmol:0.05—4mg:l—20|ag。在另一優選例中，所述的量子點、交聯劑和抗體的混合比例為50-250畫1:0.1—2mg:2—l(Vg。在另一優選例中，在步驟(2)中所述的交聯有抗體的量子點和待測樣品的混合比例為50—200ul:l—10ml。在另一優選例中，所述的離心條件為3000—12000轉/分鐘；較佳地為5000—10000轉/分鐘；更佳地為6000—8000轉/分鐘。在另一優選例中，所述的量子點是水溶性量子點。在另一優選例中，所述的量子點和抗體是共價交聯。在另一優選例中，所述的細菌包括致病菌和非致病菌。在另一優選例中，所述的致病菌包括沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌、糞腸球菌以及葡萄球菌、克雷伯桿菌、和/或變形桿菌。據此，本發明提供了一種新的檢測細菌，尤其是檢測致病菌的方法，它靈敏度高、檢測限可以達到極低的水平，并且所需設備簡單、成本低廉。圖1顯示了交聯有沙門氏菌抗體的量子點的熒光檢測情況。圖2顯示了為大腸桿菌增菌液的10—4稀釋液與實施例2制得的生物功能化量子點II(即交聯有抗體的量子點)在熒光顯微鏡下明場和暗場的對比圖；其中A為明場，B為暗場，10*100倍表示10倍目鏡*100倍物鏡。—圖3顯示了沙門氏菌增菌液的10"稀釋液與量子點在熒光顯微鏡下明場和暗場的對比圖；其中A為明場，B為暗場，10*100倍表示10倍目鏡*100倍物鏡。圖4顯示了沙門氏菌增菌液的1(T稀釋液與交聯有抗體的量子點在熒光顯微鏡下明場和暗場的對比圖；其中A為明場，B為暗場，10*100倍表示10倍目鏡*100倍物鏡。圖5顯示了沙門氏菌增菌液的10—4稀釋液與交聯有抗體的量子點在熒光顯微鏡下暗場圖；其中A、B、C、D都為暗場，且為連續拍攝的圖，10*100倍表示10倍目鏡*100倍物鏡。圖6顯示了大腸桿菌增菌液的10—2稀釋液與交聯有抗體的量子點，經免疫磁珠富集后的熒光顯微鏡下的情況；其中A為明場，B為暗場。10*100倍表示10倍目鏡*100倍物鏡。圖7顯示了沙門氏菌增菌液的10—2稀釋液與交聯有抗體的量子點，經免疫磁珠富集后的熒光顯微鏡下的情況；其中A為明場，B為暗場。10*100倍表示10倍目鏡*100倍物鏡。具體實施方式發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現通過選擇合適的交聯劑品種和濃度，可以將水溶性的量子點與特異性的抗體進行共價交聯，得到生物功能化量子點，這種生物功能化量子點與細菌通過免疫特異結合，得到用量子點標記的特異性細菌，經適當的離心條件可以將未與細菌連接的生物功能化量子點去除，最后通過觀測與細菌特異結合的量子點(熒光顯微鏡、熒光分光光度計等)來定性和定量地檢測目的細菌。更佳地，本發明提供的方法可用來檢測食品中的致病菌。如本文所用，量子點(quantumdots，QD)是指半導體納米粒子，也可稱為半導體納米晶(nanocrystals，NC)，是一種由II-VI族元素組成的納米顆粒。較佳地，本發明使用的量子點是水溶性量子點。可以是本領域常規的水溶性量子點，包括但不限于CdSe/Ag2S、CdS/Cd(OH)2、CdS/ZnS、ZnS/CdSe、ZnSe/CdSe、CdS/HgS、CdS/PbS、CdS/HgS/CdS、或其組合。如本文所用，"生物功能化量子點"和"交聯有抗體的量子點"可互換使用，表示通過共價結合的量子點一抗體復合物。如本文所用，"交聯劑"是指可以使抗體和量子點進行共價結合的試劑。由于抗體結構的特征，和量子點被修飾羧基的原因，選擇的交聯劑應符合下列條件的一種1、能活化羧基，使活化的羧基與氨基發生反應，形成肽鍵。2、能活化氨基，使活化的氨基與羧基發生反應，形成肽鍵。本發明可以選用的交聯劑包括自乙基一(3—二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDAC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，較佳地，是EDAC和NHS聯合使用。本發明提供的檢測細菌的方法是首先，將量子點、交聯劑和抗體混合，進行共價結合反應，得到含有生物功能化量子點的溶液；然后，將含有生物功能化量子點的溶液和待測樣品混合；如果樣品中含有細菌，并且所述細菌能和生物功能化量子點上的抗體特異性結合，則能夠得到一種量子點一抗體一細菌復合體；如果樣品中不含細菌或者所含有的細菌同生物功能化量子點上的抗體不能特異性結合，則不能得到量子點一抗體一細菌復合體；最后，富集量子點一抗體一細菌復合體，并進行熒光觀測。所述的富集方法包括離心和使用免疫磁珠。選用離心的方法，則在除去上清液后對下層液進行熒光觀測。如果在所加入的量子點的發射波長處有信號，則表明下層液中含有量子點一抗體一細菌復合體，也就是表示待測樣品中含有某種特定的細菌，所謂特定的細菌是指可以同加入的抗體特異性結合的細菌，同時還能根據響應值進行定量檢測；如果在所加入的量子點的發射波長處沒有信號，則表明下層液中沒有量子點一抗體一細菌復合體，也就是表示待測樣品中不含細菌或者是不含某種特定的細菌，所謂特定的細菌是指可以同加入的抗體特異性結合的細菌。選用免疫磁珠的方法，是用帶有可以同待測細菌特異結合的抗體'的磁珠去富集目標細菌，再用聯有同樣特異性抗體的功能化量子點去標記磁珠一細菌復合物，再進行熒光檢測。如果在所加入的量子點的發射波長處有信號，則表明樣品中含有細菌，也就是表示待測樣品中含有某種特定的細菌，所謂特定的細菌是指可以同加入的抗體以及磁珠上的抗體'均能特異性結合的細菌，同時還能根據響應值進行定量檢測；如果在所加入的量子點的發射波長處沒有信號，則表明樣品中沒有細菌，也就是表示待測樣品中不含細菌或者是不含某種特定的細菌，所謂特定的細菌是指可以同加入的抗體特異性結合的細菌。所謂的抗體和抗體'可以具有相同的結合表位，也可以有不同的結合表位。在本發明使量子點和抗體進行共價結合的反應中，在同一反應中，一般是一種量子點和一種抗體進行結合；所使用的交聯劑濃度應當既能使量子點和抗體共價結合，同時又能保持抗體和相應抗原(如細菌)結合的能力，一般量子點、交聯劑和抗體的混合比例為25—500咖ol:0.05—4mg:l—20ng;較佳地，為50—250nmol:0.l—2mg:2—10^ig。本發明提供的方法可以施用于各種細菌，包括致病菌和非致病菌。所述的致病菌包括對人體會產生治病性的細菌，由于細菌表面有特異性的抗原存在，從而可以使它與聯有量子點的抗體特異性的結合。本發明提供的檢測細菌的方法是通過特異的抗原抗體反應，將生物功能化量子點和相應的細菌結合，所述的生物功能化量子點和待測樣品的混合比例為約50—200ul:5—10ml。然后通過離心，將量子點一抗體一細菌復合體同沒有結合細菌的生物功能化量子點分離，所述的離心條件應小于15000轉/分鐘，一般可以是3000—12000;較佳地為5000—10000轉/分鐘；更佳地為6000—8000轉/分鐘。離心后的上清液部分為沒有結合細菌的生物功能化量子點，其下層液含有量子點一抗體一細菌復合體，可以使用常規的方法進行熒光觀測，例如但不限于，熒光顯微鏡、熒光分光光度計。在同一個檢測體系中，可以使用一種或一種以上的量子點，不同尺寸的量子點會有不同的熒光信號，其連接上結合的抗體是不同的，與不同種特異性抗體相結合，就可制備出多種生物功能化的量子點，就可在同一個步驟中同時檢測一種或一種以上細菌。其上所帶有的量子點結構相同但尺寸不同。本發明提到的上述特征，或實施例提到的特征可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發明的主要優點在于1、本發明提供的方法具有極低的最低檢測限；2、本發明提供的方法靈敏度高、特異性強；3、本發明提供的方法可同時檢測多種細菌；4、本發明提供的方法快速、簡便，而且設備簡單、成本低廉；5、本發明提供的方法既可用于定性，又可用于定量。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1制備生物功能化量子點I將5ul(50nmol—250nrao1)的已修飾羧基的熒光納米量子點(QDs655，d:20一40nm)以下簡稱量子點)，加入到pH值6—8，0.l—lmol/L的PBS緩沖溶液中；這種混合物被超聲IO分鐘，將O.l—2mg的EDAC[乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽]加入到混合溶液中，渦流5分鐘；再加入O.l—lmg的NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)，渦流5分鐘，振蕩反應I一IO小時；然后將lmg/ml的2—10ul的抗體(沙門氏菌A-F多價血清)加入到溶液中，渦流10分鐘，振蕩反應l一5小時；最后反應產品通過S-400HR過濾柱來過濾，來去除未參加反應的抗體，過濾后將得到的生物功能化量子點I保存在4'C備用。實施例2制備生物功能化量子點II按實施例l的方法，將量子點(QDs655，購自中科院)與沙門氏菌屬診斷血清A-F多價血清(以下簡稱沙門氏抗體，購自蘭州生物制品研究所)混合反應，最后反應產物通過S-400HR過濾柱過濾，得到生物功能化量子點II保存在4。C備用。取50ul所制得的生物功能化量子點II用PBS稀釋至3ml，在熒光分光度計下觀測。得圖1。結果表明，量子點已成功地連接到抗體上。該量子點的發射波長為655nm左右。實施例3生物功能化量子點和細菌結合試驗1將原始濃度約為100個/ml的大腸桿菌(具體濃度通過凝膠劃板得知)，增菌4一6小時；取增菌液10—4濃度的稀釋液(10—2濃度對應lCFU/ml，10—3濃度對應0.lCFU/ml，10—4濃度對應0.01CFU/ml，依此類推，其中CFU/ml是檢出限單位個菌落/毫升)50ul加入到1號管中；再向1號管中加入50ul(實施例1制得的生物功能化量子點)，室溫下反應O.5—1小時；6000—8000轉/分鐘離心，離心5分鐘，棄去上清液70ul;再加70ul的PBS振蕩重懸；重復同樣步驟(即再離心、棄去上清液、加PBS、重懸)操作兩次，得30ul的下層液，振蕩，在熒光顯微鏡下觀測。得圖2。(同時收集上清液，分別標為A、B、C)結果表明，大腸桿菌未與實施例2制得的生物功能化量子點II結合在一起；表明，通過上述一系列步驟，菌與生物功能化量子點不會吸附在一起；表明離心可以將未與菌結合的生物功能化量子點去除。實施例4未生物功能化量子點和細菌結合試驗2將原始濃度約為100個/ml的沙門氏菌(具體濃度通過凝膠劃板得知)，增菌4一6小時；取增菌液10—4的稀釋液50ul，加入到2號管中；再向2號管中加入50ul未生物功能化量子點(即未修飾抗體的量子點)，室溫下反應O.5一l小時；6000—8000轉/分鐘離心，離心5分鐘，棄去上清液70ul;再加70ul的PBS振蕩重懸；重復同樣步驟(即再離心、棄去上清液、加PBS、重懸)操作兩次，得30ul的下層液，振蕩，在熒光顯微鏡下觀測。得圖3。(同時收集上清液，分別標為0、P、Q)。結果表明，致病菌(沙門氏菌)和未生物功能化量子點不結合在一起；表明通過上述一系列步驟，未生物功能化量子點與沙門氏菌不會吸附在一起；表明離心可以將未與菌結合的未生物功能化量子點去除。實施例5檢測沙門氏菌(離心法)將原始濃度約為100個/ml的沙門氏菌(具體濃度通過凝膠劃板得知)，增菌4一6小時；取增菌液10—4的稀釋液各50ul分別加入到3號管中；再向3號管中加入實施例1得到的各50ul生物功能化的量子點，室溫下反應0.5—1小時；6000—8000轉/分鐘離心，離心5分鐘，棄去上清液70ul;再加70ul的PBS振蕩重懸；重復同樣步驟(即再離心、棄去上清液、加PBS、重懸)操作兩次，得30ul的下層液，振蕩，在熒光顯微鏡下觀測。得圖4和圖5。(同時收集上清液，分別標為X、Y、Z)。結果表明，說明了實施例l得到的生物功能化量子點與沙門氏菌已成功地結合在一起，且通過上述一系列步驟是特異性的結合(基于抗原抗體特異性)，而不是菌與樣品的吸附作用而結合。同時由上述數據和圖1說明了該方法的最低檢出限《0.01CFU/ml。通過圖5可以看見菌的移動，這不僅可以說明食品中是否有污染，還可以直觀的判斷是否為陽性(該圖表明為陽性，即有活的沙門氏菌)，這是其它檢測方法所不能夠達到的。也進一步說明了抗體與量子點已結合在一起。實施例6離心速度確定將實施例3—5中離心得到的上清液A、B、C、0、P、Q、X、Y、Z梯度稀釋，涂布于BS(亞硫酸鉍瓊脂)選擇性平板上，40-48小時觀察結果，發現沒有菌落長出。結果表明，實驗所選的離心速度可以達到較好的將菌富集起來的效果。實施例7檢測沙門氏菌(免疫磁珠法)將原始濃度約為100個/ml的大腸桿菌(具體濃度通過凝膠劃板得知)，增菌2—3小時；取增菌液10—2濃度的稀釋液0.5ml置于R管中；將原始濃度約為100個/ml的沙門氏菌(具體濃度通過凝膠劃板得知)，增菌2—3小時取增菌液10—2濃度的稀釋液0.5ml置于S管中；將修飾了沙門氏菌A—F價多價抗體的免疫磁珠0.5ml(lmg/ml)分別加入到R管和S管，置于振蕩器上，200—260r/min振蕩0.5h，在管外放置一永久磁鐵，富集磁珠，用生理鹽水洗滌磁珠2遍，定容于O.2ml的體系；然后分別加入50ul實施例1中的功能化量子點，置于振蕩器上，200—260r/min振蕩0.5h，管外再放置一永久磁鐵，富集磁珠，用生理鹽水洗滌磁珠3遍，定容于0.2ml的體系中，熒光顯微鏡觀察，分別得圖6，圖7。圖6中，由于免疫磁珠是聯有沙門氏菌(A-F)多價抗體，因此它無法和大腸桿菌結合，再加入聯有沙門氏菌(A-F)多價抗體的功能化量子點，由于無法和磁珠連接在一起，通過洗滌，最終的圖片就只是磁珠的熒光照片(紫外激發即暗場)，而沒有量子點的熒光信號QDs655,不顯紅光。圖7中，由于免疫磁珠是聯有沙門氏菌(A-F)多價抗體，因此它可以和沙門氏菌結合，得到通過磁珠一細菌結合物，再加入聯有沙門氏菌(A-F)多價抗體的功能化量子點，由于抗原抗體特異性結合，聯有沙門氏菌(A-F)多價抗體的功能化量子點會與沙門氏菌結合，形成磁珠一細菌一量子點復合物，再通過熒光顯微鏡觀測，通過觀測到量子點的熒光信號QDs655，看到紅色光(紫外激發即暗場)，可知樣品中有目標菌(沙門氏菌)。結果表明，功能化量子點與免疫磁珠的聯用，進一步說明了實施例l中制備出的功能化量子點具有特異性，能結合/檢測目標細菌。以上所述僅為本發明的較佳實施例而己，并非用以限定本發明的實質技術內容范圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義于申請的權利要求范圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權利要求范圍之中。權利要求1.一種檢測細菌的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1)將量子點、交聯劑和抗體混合，得到含有交聯有抗體的量子點的溶液，所述的抗體能與待測細菌特異性結合；(2)將含有交聯有抗體的量子點的溶液和待測樣品混合；(3)富集量子點-抗體-待測細菌復合物，進行熒光觀測，有熒光的表示待測樣品中有待測細菌；所述的交聯劑選自乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺；所述的富集量子點-抗體-待測細菌復合物的方法包括離心和使用免疫磁珠。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(1)將量子點、交聯劑和抗體混合，得到含有交聯有抗體的量子點的溶液，所述的抗體能與待測細菌特異性結合；(2)將含有交聯有抗體的量子點的溶液和待測樣品混合；(3)離心除去上清液，然后對下層液進行熒光觀測，有熒光的表示待測樣品中有待測細菌；所述的交聯劑選自乙基一(3—二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的量子點、交聯劑和抗體的混合比例為25—500nmol:0.05—4mg:l—20jng。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的量子點、交聯劑和抗體的混合比例為50—250nmol:0.l—2rag:2—10pg。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(2)中所述的交聯有抗體的量子點和待測樣品的混合比例為50—200ul:1—10ml。6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離心條件為3000—12000轉/分鐘；較佳地為5000—10000轉/分鐘；更佳地為6000—8000轉/分鐘。7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的量子點是水溶性量子點。8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的量子點和抗體是共價交聯。9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細菌包括致病菌和非致病菌。10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的致病菌包括沙門氏菌、大腸桿菌、單增李斯特菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌、糞腸球菌以及葡萄球菌、克雷伯桿菌、和/或變形桿菌。全文摘要本發明公開了一種檢測細菌的方法，它包括步驟(1)將量子點、交聯劑和抗體混合得到含有交聯有抗體的量子點的溶液；(2)將交聯有抗體的量子點和與抗體相應的細菌混合，得到量子點—抗體—細菌復合體；(3)富集量子點—抗體—待測細菌復合物，進行熒光觀測，有熒光的表示待測樣品中有待測細菌；所述的交聯劑選自乙基—(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDAC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)；所述的富集量子點—抗體—待測細菌復合物的方法包括離心和使用免疫磁珠。文檔編號G01N21/00GK101158635SQ20071017058公開日2008年4月9日申請日期2007年11月19日優先權日2007年11月19日發明者葉明強,沈鶴柏,渝趙申請人:上海師范大學