專利名稱：一種兩相整體柱及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及毛細管整體柱，具體地說是一種應用于微柱液相色譜Oi-LC) 在線多維分離的毛細管整體柱及其制備。
背景技術：
微柱液相色譜(li-LC)是色譜微型化的一個重要方向，指內徑為10 pm到 1 mm的色譜柱的液相色譜分析方法。與常規液相色譜法相比具有柱效高、 流動相試樣消耗低、柱通透性好、易于實現多級色譜分離及易與質譜聯用 而提高分析靈敏度等優點，廣泛應用于生物類樣品的分離分析，特別適用 是蛋白組學方面的分析(Ivanov， A. R.， ect, Anal. Chem.， 2003, 75， 5306)。
1999年，Yates等人提出了在一根拉伸了噴霧尖端的毛細管中依次填充 兩種不同分離機理的顆粒填料，毛細管前端填充反相分離C18硅膠顆粒填 料，而在后端填充強陽離子交換硅膠顆粒填料。該兩相毛細管填充柱被應 用于微柱液相色譜在線多維分離與電噴霧質譜的聯用，分析對象為酵母蛋 白的胰蛋白酶酶解產物，應用NH4AC溶液從0mM到500mM分15個鹽洗 梯度將強陽離子交換填料上的肽段按等電點的升高逐步洗脫到C18填料部 分，每次洗脫后都緊跟著一個反相的梯度分離。該兩相填充柱表現出了卓 越的分離性能，具有無樣品污染，樣品用量少，無樣品丟失與稀釋，靈敏 度高登諸多優點(Yates, J. R., ect, Nat. Biotechnol.， 1999, 17, 676; Nat. Biotechnol. 2001， 19, 242; Anal. Chem. 2001, 73， 5683)。由于使用的是填充 的毛細管兩相柱，如果要提高該柱的分離能力及上樣量的話就必須在毛細 管內部填充更大長度的C18反相分離材料和強陽離子交換材料。而填充的 操作壓力也隨著柱的長度的增加而增大，只有在超高壓的液相色譜儀器上 面才能操作更長的兩相毛細管整體柱。但是要想在常規的儀器上面實現超 高壓分離是十分困難的，而商品化儀器又什么昂貴，這成為制約提高兩相 整體柱分離能力的最大限制。
毛細管整體柱被人們廣泛的應用于微柱液相色譜的分離中，由于它具有 很高的滲透性，操作壓力比填充柱小很多。而且毛細管整體柱還具有多孔 結構，傳質速度快，可進行快速分析，具有在酸堿中的穩定性，生物分子 兼容性，易于制作等諸多優點(Zou, H. F., ect, J. Chromatogr. A, 2002, 954)。 吳仁安等人制作了一種強疏水性的毛細管整體柱，應用的功能單體為十二 烷基甲基丙烯酸酯(LMA)，這種整體柱被成功的應用與毛細管電色譜中 分離離子性化合物(Wu,R.A.，ect,Anal. Chem. 2001,73,4918)。董靖等人
制作了一種基于磷酸根的強陽離子交換整體柱。這種整體柱被證明能應用 于多維色譜分離，且與商品化的C18硅膠填料具有很好的正交性(Wang, F.J.,ect,Anal. Chem. 2007, 79， 6599)。迄今為止，還沒有人報到過在同一根 毛細管中合成前后兩種不同的整體材料。
發明內容
本發明旨在制作一根含有兩段不同分離機理材料的毛細管整體柱，而 且在兩種材料的中間基本消除死體積，真正實現兩種分離介質的"零死體積" 連接。并將這種兩相整體柱應用于多維微柱液相色譜分離。本發明的這種 兩相毛細管整體柱是國內外首次報道的兩相整體柱，它既具有兩相填充柱 的特點，可以方便應用于在線多維分離，又具有通透性好，可以在常規液 相色譜中實現長柱分離，大大提高了兩相柱的分離能力，并且具有容易制 作，可以在小內徑柱中實現等諸多優勢。
為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為
一種兩相整體柱，在同一根柱管內存在有不同分離機理的兩種固定相， 兩相以前后兩段的形式存在。
.所述兩相整體柱的制備方法，在同一根柱管內制備具有不同分離機理 的兩種固定相，分兩步制作兩相整體柱，先在柱管的一端合成所需長度的 第一種整體材料，然后在柱管剩余部分合成第二種與第一種材料具有不同 分離機理的整體材料。兩種整體材料的長度可以根據需要而控制。
如在毛細管一端先合成一段基于磷酸基的強陽離子交換的整體材料， 然后再在另一端合成基于十二烷基鏈的強疏水性材料，從而制備得到強陽 離子交換(SCX)-反相(RP)兩相整體柱。在微柱液相色譜在線多維分離與質譜
聯用分析中，這種整體柱被應用于分離復雜的酵母提取全蛋白的胰蛋白酶
酶解液。酶解肽段首先上樣到兩相整體柱的強陽離子(SCX)材料部分， 當用不同的鹽梯度降肽段逐步洗脫到強疏水性(RP)材料部分后，應用反 相梯度分離反相材料上的肽段，從而大大提高了分離鑒定蛋白肽段的能力。 但該兩相整體柱的分離作用并不局限于蛋白酶解液，對其它復雜的混合物 同樣具有良好的多維分離能力。
整體柱制備前應先對毛細管內壁表面進行接雙鍵活化，然后再分兩步 在毛細管中合成具有不同分離機理的兩種整體材料。
所述兩相毛細管整體柱可應用于微柱液相色譜在線多維分離并與質譜 聯用的系統中，可對復雜樣品進行分離分析。所述復雜樣品為蛋白酶解混 合物；應用時，可進行大規模蛋白鑒定。
本發明具有以下優點
1. 基本消除了同一根整體柱中不同兩相之間的死體積，實現了兩種 不同分離機理整體柱的"零死體"積連接；
2. 可以直接與質譜相聯用，進行在線多維分離質譜鑒定分析；
3. 具有優良的滲透性，可以很容易的增加柱長，從而實現高效分離；
4. 容易制作，可以在小內徑的毛細管中實現。
圖l為兩相整體柱示意圖；圖中A:毛細管；B:強陽離子交換材料 部分；C:強疏水性材料部分。
圖2為兩相毛細管整體柱制作過程的工藝框圖； 圖3為兩相毛細管整體柱兩相交界處的實物照片；
圖4為兩相毛細管整體柱應用在微柱液相色譜在線多維分離電噴霧質 譜聯用分析中所得到的譜圖。
具體實施例方式
由于整體柱中的聚合物材料具有優良的滲透性，申請可以分兩步在同一 根柱管中合成具有完全不同分離機理的兩種材料。根據兩相柱的需要設計 不同兩相的長度，然后先合成較短的一相，合成的長度可以由虹吸等方法 控制，然后在第一相合成好后再把第二相的聚合液壓入柱管空的部分，制 備第二相。以下實施實例以制備基于磷酸基團的SCX和基于C12基團的兩 相柱為例，但本發明并不局限于此，本發明的特征是同一根柱管內制備具 有不同分離機理的兩種固定相，兩相以前后兩段的形式存在。
實施例l
一.兩相毛細管整體柱的制備
如圖2所示，在100微米內徑，75厘米長的毛細管內先后依次合成了10 厘米長的強陽離子交換材料和65厘米長的強疏水性材料。
1. 毛細管預處理
首先用O.l MNaOH溶液沖洗毛細管空柱1 h,再用去離子水沖洗毛細管 至流出液體pH值為7.0,接著用0.1 M HC1溶液沖洗毛細管4 h，再用去離子水 沖洗毛細管至流出液體pH值為7.0,然后用甲醇溶液沖洗毛細管柱IO min,用 氮氣吹干。往毛細管中注入甲醇與甲基丙烯酰氧丙基一三甲氧基硅烷的混 合物。在20度至70度溫度下反應5—24小時。然后用甲醇及水沖洗。最后用 氮氣吹干待用。
2. 強陽離子交換整體材料在毛細管中的合成
合成該材料所采用的原料及配比來自于董靖等人發明的基于磷酸根的 強陽離子交換整體材料(Wang,F. J., ect， Anal. Chem. 2007, 79， 6599)。
(2.1) 以2— (甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯為功能單體，亞甲基雙丙烯 酰胺為交聯劑，十二醇，二甲基亞砜和N,N-二甲基甲酰胺為致孔劑，單體、 交聯劑、致孔劑按質量百分比分別為13%、 10%和77%均勻混合，所加引 發劑的用量為聚合物單體用量的1%，將混合液用超聲振蕩15min。
(2.2) 將(2.1)中配制的聚合溶液通過虹吸進入毛細管，進入的長度 可以根據該兩項整體柱在實際要求中的上樣量決定；
(2.3) 將毛細管兩端用硅橡膠封口，然后放入6(TC水浴反應12個小時；
(2.4) 取出毛細管，接在高效液相色譜泵上，以甲醇為流動相沖去未 反應完全的聚合單體和制孔劑。沖洗在衡壓模式下進行，壓力控制在10兆 帕；(2.5)用氮氣在2兆帕壓力下吹干毛細管及其中的強陽離子交換整體材
料，吹干時間為半小時。
3. 強疏水性整體材料在毛細管中的合成
合成該材料所采用的原料及配比來自于吳仁安等人合成的基于十二烷 基甲基丙烯酸酯(LMA)的強疏水性整體柱材料(Wu， R. A., ect, Anal. Chem. 2001， 73,4918)，并且為了提高其在反相梯度分離中的分離能力，我們對 該配比進行了優化，在制作兩相毛細管整體柱中所用的就是優化后的配比。
(3.1) 以十二烷基甲基丙烯酸酯為功能單體，二甲基丙烯酸乙二酯為 交聯劑，正丙醇，1， 4-丁二醇為制孔劑，單體、交聯劑、致孔劑按體積百 分比分別為24%、 24%和52%均勻混合，所加引發劑的用量為聚合物單體 用量的1%，將混合液用超聲振蕩15min。
(3.2) 將(3.1)中所配制的聚合液用氮氣壓入(2.5)中干燥后的毛細 管，聚合液從沒有整體材料的一端壓入，氮氣的壓力控制在0.03-0.1兆帕。 在壓入聚合液的過程中在顯微鏡下觀察液流的流動，控制液流到達強陽離 子交換材料后再讓它進入2-5厘米；
(3.3) 將毛細管兩端用硅橡膠封口，然后放入6(TC水浴反應12個小
時；
(3.4) 取出毛細管，接在高效液相色譜泵上，以甲醇為流動相沖去未 反應完全的聚合單體和制孔劑。沖洗在衡壓模式下進行，壓力控制在20兆 帕；
(3.5) 用氮氣在2兆帕壓力下吹干兩相毛細管整體柱，吹干時間為1小時。
4. 在線電噴霧噴針的拉制
為了實現在線多維分離與電噴霧質譜的聯用，最后還需要在兩相毛細 管整體柱的強疏水材料端拉出一個電噴霧的噴針。在整體柱上拉電噴霧噴 針的方法為謝傳輝等人提出(Xie， C. H.， ect， Mol. Cell. Proteomics, 2006， 5, 454)，即在用水溶液沖過毛細管整體的情況下用丁烷焰將整體柱末端l-2 厘米燒軟，然后用一根空的毛細管在火焰燒結下與整體柱聯在一起后平穩 拉出，控制拉出尖端內徑為5微米左右。至此，兩相毛細管整體柱制作完成。 這樣所得到的兩相毛細管整體柱在兩相交界的地方所產生的死體積幾乎可 以忽略，如圖2所示。
二.兩相毛細管整體柱在微柱液相色譜在線多維分離質譜聯用分析中 的應用
該兩相毛細管整體柱可以應用到在線多維分離復雜樣品，在本例中分析 對象為酵母提取蛋白的胰蛋白酶酶解液。 1.樣品溶液的制備
1 mg的酵母提取蛋白溶解在lmL， 50 mM的Tris,8 M的尿素溶液中 (pH8.2)，然后用DTT將蛋白中二硫鍵還原，再加入IAA將游離巰基烷基化，然后將溶液稀釋8倍，按照與胰蛋白酶的質量比25:1的比例加入胰蛋白酶進 行酶解反應，反應時間為16h,酶解溫度控制在37"C。獲得的蛋白酶解溶液 置于-3(TC冰箱中保存備用。 2.在線多維分離
將10 )ig酵母蛋白的酶解產物用560 psi的壓力使其通過兩相毛細管整體 柱，酶解肽段通過靜電相互作用上樣到兩相毛細管整體柱的強陽離子交換 材料部分。然后將兩相毛細管整體柱接入液相色譜-質譜聯用系統，流速為 通過分流控制在300納升每分鐘，整個體統操作壓力約為900psi。實驗中用 到三種流動相，分別為(A) 0.1%甲酸水溶液；(B) 0.1%甲酸乙腈溶液； (C) 1000mMNH4AC溶液，pH用甲酸調節在2-3之間。
由溶液A和B產生分離梯度，0-35%乙腈梯度為92分鐘；由溶液A和C產 生鹽溶液梯度，將強陽離子交換材料上的肽段分五次沖洗到強疏水性材料 部分，每次沖洗10min,然后用溶液A平衡系統10min，然后開始分離。五個 鹽梯度沖洗所用的濃度為1， OmM; 2， 100 mM; 3， 200 mM; 4， 300 mM; 5， 500 mM。所得到的質譜譜圖如圖3所示。
將所得到的質譜譜圖通過數據庫檢索匹配，得到的結果再用ACn 0.35,Xcorr,1.9, 2.2, 3.75分別對帶電荷為+1， +2， +3的肽段進行篩選，然后 得到的結果肽段假陽性率為0.85%。總共鑒定得到780個蛋白，1253個不同 肽段。
權利要求
1. 一種兩相整體柱，其特征在于在同一根柱管內存在有不同分離機理的兩種固定相，兩相以前后兩段的形式存在。
2. —種權利要求1所述兩相整體柱的制備方法，其特征在于在同一 根柱管內制備具有不同分離機理的兩種固定相，分兩步制作兩相整體柱， 先在柱管的一端合成所需長度的第一種整體材料，然后在柱管剩余部分合 成第二種與第一種材料具有不同分離機理的整體材料。
3. 按照權利要求2所述兩相整體柱的制備方法，其特征在于所述第 一種材料為基于磷酸根的強陽離子交換整體材料，第二種整體材料為基于 十二烷基的強疏水性材料。
4. 按照權利要求2所述兩相整體柱的制備方法，其特征在于整體柱 制備前應先對毛細管內壁表面進行接雙鍵活化，然后再分兩步在毛細管中 合成具有不同分離機理的兩種整體材料。
5. —種權利要求l所述兩相整體柱的應用，其特征在于所述兩相毛 細管整體柱可應用于微柱液相色譜在線多維分離并與質譜聯用的系統中， 可對復雜樣品進行分離分析。
6. 按照權利要求5所述兩相整體柱的應用，其特征在于所述復雜樣 品為蛋白酶解混合物；應用時，可進行大規模蛋白鑒定。
全文摘要
本發明涉及毛細管整體柱，具體地說是一種兩相整體柱，其特征在于在同一根柱管內存在有不同分離機理的兩種固定相，兩相以前后兩段的形式存在。本發明的主要優點是基本消除了微柱液相色譜分離系統中連接兩根不同分離機理的整體柱時產生的死體積，可以進行自動的在線多維分離，具有很強的分離復雜樣品如蛋白質酶解物的能力。另外，該整體柱滲透性好，操作壓力低，易于在常規液相色譜儀器上操作而得到高效的分離結果。
文檔編號G01N30/00GK101413932SQ200710157520
公開日2009年4月22日 申請日期2007年10月17日 優先權日2007年10月17日
發明者葉明亮, 王方軍, 靖 董, 鄒漢法 申請人:中國科學院大連化學物理研究所