專利名稱：快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體金試紙條及其制法的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測赤潮毒素的檢測器具，特別是涉及一種腹瀉性貝 毒(Diarrhetic shellfish poisoning, DSP)的快速檢測試紙條，另外還涉及其制法。
背景技術：
赤潮災害日益嚴重，已成為一種全球性的海洋生態災害。腹瀉性 貝毒是由有毒赤潮藻類鰭藻屬和原甲藻屬產生的一類脂溶性多環醚類天然化合物，主要成分是軟海綿酸(Okadaicacid， OA)及其衍生 物，經過雙殼貝類等率食性動物的食物鏈傳遞，能引起人類食用者發 生中毒，產生腹瀉、惡心、嘔吐及腸胃絞痛等，OA是強烈的蛋白磷 酸酶抑制劑，是一種很強的促癌劑，是目前極受關注的海洋生物毒素。 腹瀉性貝毒的分析方法主要有生物小鼠法、高效液相色譜法以及一些 免疫化學方法。其中小鼠法簡便易行，適合于大規模、批量樣品的檢 測，該法的缺點是不能區別毒素的種類和結構、干擾大、不精確；現 在被廣泛接受且較為完善的高效液相色譜分析方法在許多國家使用， 可以準確分析確定毒素的含量和種類，檢測限可低至ng/g，缺點是 樣品前處理繁瑣費時，儀器昂貴，對操作人員的技術要求較高，嚴重 的阻礙了這種分析方法的普及推廣，更無法實現現場檢測。免疫化學 方法是利用抗體對抗原的特異性結合建立的分析方法，具有靈敏度 高，特異性強，儀器設備簡單易操作、樣品前處理相對簡單等優點， 適用于一定條件下的現場監測和大量樣本快速篩查；目前德國、日本等公司生產的ELISA檢測DSP的試劑盒，是以競爭性酶聯免疫反應為 檢測原理，檢測全過程需2-4小時，可一次檢測多個樣品，即可定性 又可定量，但存在假陽性問題；由于ELISA是一種很敏感的技術，分 析結果的變異性較大，不同分析人員的結果有差異，結果判斷往往需 要有經驗的操作人員，容易發生誤檢和漏檢，同時腹瀉性貝毒組分化 學結構較多，各異構體之間也存在一定的抗原性差異，且檢測時間也 比較長，實現真正的野外現場操作有困難。近年來，我國每年均有在貝中檢測出腹瀉性貝毒的報道，雖然其急性中毒未發生有死亡的案例，但其腫瘤促進劑的慢性效應不容忽 視，已引起了全世界的關注。建立腹瀉性貝毒的快速靈敏準確的檢測 方法和產品，對確保海產品食用安全具有十分重要的意義。
發明內容
本發明的目的是克服上述腹瀉性貝毒檢測技術的不足，提供一種 特異、敏感和簡便的快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體金試紙條；用膠 體金標記抗體，通過競爭免疫反應，快速檢測貝類中的軟海綿酸；簡 單易操作，快速，不需任何其他儀器設備，非專業人員可現場使用， 產品性能穩定。本發明為實現上述目的所采用的技術方案是 一種快速檢測腹瀉 性貝毒的免疫膠體金試紙條，包括樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、 吸水墊和PVC背襯；其具體結構是在PVC背襯上按順序依次粘附有樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、吸水墊，膠金墊上包被有膠體金標 記的抗軟海綿酸單克隆抗體，賽多利斯NC膜上分別包被有軟海綿酸與卵清蛋白偶聯物構成的檢測線和羊抗鼠多抗構成的質控線。 所述抗軟海綿酸單克隆抗體為用軟海綿酸一血藍蛋白偶聯物免疫B a 1 b / c小鼠，經細胞融合，篩選得到抗軟海綿酸單克隆抗體 的雜交瘤細胞系分泌的。
所述樣本墊、膠金墊、NC膜、吸水墊按順序依次粘附在PVC背 襯上并裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區。所述試紙條為檢測腹瀉性貝毒主要成分軟海綿酸的試紙條。 所述快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體金試紙條的制法，其步驟包括1、 將軟海綿酸與載體蛋白偶聯，制備得到軟海綿酸一載體蛋白偶聯物；2、 用軟海綿酸一血藍蛋白偶聯物免疫B a 1 b / c小鼠，經細胞融 合，篩選得到分泌抗軟海綿酸單克隆抗體的雜交瘤細胞系；3、 制備抗軟海綿酸單克隆抗體；4、 用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金；5、 將步驟3制得的抗軟海綿酸單克隆抗體加入步驟4制備得到的膠 體金中，得到抗軟海綿酸單克隆抗體一膠體金標記物；6、 將抗軟海綿酸單克隆抗體一膠體金標記物噴點(包被)在膠金墊 上；7、 將軟海綿酸一卵清蛋白偶聯物噴點(包被)在NC膜上構成檢測線， 并將羊抗鼠多抗噴點(包被)在NC膜上構成質控線。8、 將樣本墊、膠金墊、NC膜、吸水墊按順序依次粘附在PVC背襯上， 并包裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區，得到檢測軟海綿酸 的免疫膠體金試紙條。所述快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體金試紙條在檢測軟海綿酸 中的應用。本發明借助膠體金標記顯色的免疫層析反應，用以制備快速檢測 腹瀉性貝毒主要成分軟海綿酸的免疫膠體金試紙條，結構更加合理， 應用膠體金標記抗軟海綿酸單克隆抗體，選用軟海綿酸一載體蛋白偶 聯物作為檢測線，建立競爭免疫層析快速檢測待測樣品中是否含有腹
瀉性貝毒軟海綿酸。通過待檢樣品中的軟海綿酸與包被于NC膜上的 軟海綿酸一載體蛋白偶聯物共同競爭抗軟海綿酸單克隆抗體一膠體 金標記物，在檢測線處出現深淺不同的紅色條帶或不出現條帶，質控 線處出現紅色條帶。若待測樣品試紙條檢測線無色，同時質控線上出 現紅色條帶則判斷為陽性樣品，即待測樣品中軟海綿酸的濃度高于12.5ng/mL;若待測樣品試紙條檢測線有紅色出現，同時質控線上出 現紅色條帶則判斷為陰性樣品，即待測樣品中軟海綿酸的濃度小于12.5ng/mL;如果質控線上沒有出現紅色條帶，則該試紙條失效。 與現有技術相比，本發明具有以下突出優點1 、本發明的檢測軟海綿酸的免疫膠體金試紙條，具有特異性強， 檢測靈敏度高(可達12.5ng/mL)，檢測快速(只需15min)，前處理 簡單等優點。2 、本發明的試紙條不需任何儀器設備，攜帶方便，檢測成本低。3、 本發明的試紙條操作簡單易掌握，無需專業人員操作。4、 本發明的試紙條儲存方便，穩定性好，在室溫下至少可保存 六個月。5、 本發明的試紙條檢測結果準確性高，精度高。
圖1為本發明檢測試紙條結構示意中l為樣品墊，2為膠金墊，3為賽多利斯NC膜，4為吸水墊， 5為PVC背襯，6為檢測線，7為質控線，8為試紙條卡，9為加樣 孔，IO為顯色區圖2為本發明的檢測試紙條結果判定示意中A為陰性標準品結果，B為陰性樣品結果，CD為陽性樣品結 果，E F為試紙條失效具體實施方式
實施例l (制備實施例)檢測腹瀉性貝毒軟海綿酸的免疫膠體金試紙條制備方法1、 軟海綿酸一載體蛋白偶聯物的制備將軟海綿酸(0A)溶于lmL的二甲基亞砜中，加入水溶性碳化二亞胺 (EDC) 、 N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) ，25。C反應1.5小時后，加入溶于 磷酸鹽緩沖液(pH7.0)的血藍蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)， 25°C 反應3小時。將反應混合物移入透析卡中透析3d， 4'C，每12h換液l 次。透析物分裝后，-2(TC保存。制備得到OA — KLH和OA — 0 VA偶聯物備用。2、 抗軟海綿酸單克隆抗體的制備 利用制備的軟海綿酸一血藍蛋白偶聯物(0 A — K L H )作為免疫原，免疫6 8周齡的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用200uL OA-KLH 與等體積完全弗氏佐劑，充分乳化后，腹腔注射小鼠，第2、 4、 6、 8、 10、 12周取同量OA-KLH與等體積不完全弗氏佐劑充分乳化，腹 腔注射。取尾血測定小鼠血清效價，待效價大于要求值后，用同量 OA-KLH的PBS溶液腹腔注射進行加強免疫，三天后取脾細胞融合。取生長狀態良好的骨髓瘤SP2/0細胞與免疫的小鼠脾細胞按1:10 的比例混合，加入PEG進行細胞融合。融合后接種于96孔細胞培養 板中，在15X血清的HAT培養基中選擇培養，5天后換HT培養液， 取細胞培養液上清ELISA檢測。選取陽性細胞孔，用有限稀釋法克隆， 篩選可穩定分泌抗軟海綿酸(OA)單克隆抗體的雜交瘤細胞株。取8 周齡健康BALB/c雌性小鼠或雜交一代鼠，腹腔注射液體石蠟0. 5mL/ 每只，待用。1500r/min離心收集對數生長期的陽性雜交瘤細胞，懸浮 于生理鹽水中，濃度為10VmL。在石蠟油處理的小鼠腹腔內注射0. 5mL 雜交瘤細胞懸液誘生腹水，收集腹水，3000r/min離心10min，收集上 清液即為含單克隆抗體腹水。
腹水用辛酸硫酸氨方法得到粗制抗體蛋白，再用0.01M的PBS 緩沖液(pH7.4)透析4-5天。取出用紫外分光光度計測得蛋白濃度 為1.78mg/mL。3 、抗軟海綿酸單克隆抗體一膠體金標記物的制備及包被膠金墊 用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金；取40nm的膠體金于 干凈的燒杯中，用1M的NaOH調節其pH值為8.2，加入抗軟海綿 酸單克隆抗體，使其在膠體金中終濃度為2ug/ml，攪拌lh，加入膠 體金1/10體積的10%BSA溶液，攪拌30min， 5000rpm離心30min， 取沉淀，用0.01M的PBS緩沖液復溶，約加入4ml緩沖液，用紫外 分光光度計掃描膠體金特征吸收峰，確定膠體金OD值后用0.01M的 PBS緩沖液稀釋OD值為5，用XYZ-3000噴點儀包被到經預處理的 膠金墊上，包被量為3uL/cm。真空干燥備用。 4、偶聯抗原包被NC膜軟海綿酸-卵清蛋白偶聯抗原用0.01M的PBS緩沖液稀釋8倍， 用XYZ-3000噴點儀包被到經預處理的NC膜上，包被量為 0.74ul/cm。 37'C干燥1小時備用。并將羊抗鼠多抗包被在NC膜上 構成質控線。 5、試紙條的組裝將處理好的樣本墊、包被有抗軟海綿酸單克隆抗體-膠體金標 記物的膠金墊、包被有軟海綿酸-卵清蛋白偶聯抗原作為檢測線和包 被有羊抗鼠多抗作為質控線的NC膜、吸水墊按順序依次粘附在PVC 背襯上，安裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區。陽性 12.5ng/mL完全抑制，無條帶出現；加樣量為80pL/孔；判斷時間 為15min;最低檢測限為12.5ng/mL。真空封裝，常溫保存，有效 期至少6個月。 實施例2(應用實施例) 檢測軟海綿酸的免疫膠體金試紙條使用方法 1、貝類等樣品的預處理將貝類樣品洗去泥沙，刨開，去殼，取全部肌肉組織，勻漿絞碎。稱取lg勻漿樣，加入4mL80。/。的甲醇-水溶液，攪拌萃取5min，離心,棄去組織殘渣，上清液待分析用。上述的貝類甲醇萃取液用0.01MPBS稀釋4倍，用微量移液槍取80pL 于加樣孔中，放置15min觀察顯色情況。同時分別取80pL 0.01M PBS 和80pL 12.5ng/mL的軟海綿酸標準溶液于另兩個試紙條的加樣孔中， 做陰性空白和陽性標準品對照實驗。 3、結果判定如圖2所示，若待測樣品試紙條檢測線顏色比陰性空白試紙條檢測線 顏色淺，同時質控線上出現紅色條帶，則判斷為陽性樣品，即樣品中 軟海綿酸的濃度小于12.5ng/mL;若待測樣品試紙條檢測線無顏色， 同時質控線上出現紅色條帶，則判斷為陽性樣品，即樣品中軟海綿酸 的濃度大于或等于12.5ng/mL;若待測樣品試紙條檢測線顏色與陰性 空白試紙條檢測線顏色一致，同時質控線上出現紅色條帶，則判斷為 陰性樣品，即樣品中不含軟海綿酸；若質控線上無顏色，則該試紙條 失效。實施例3 (應用實施例) 檢測軟海綿酸的免疫膠體金試紙條的應用 1、特異性實驗將腹瀉性貝毒的五種組分軟海綿酸(Okadaic acid,OA)、扇貝毒素 (pectenotoxin-2，PTX-2 )、蝦夷扇貝毒素(Yessotoxin，YTX )、 13-Desmethyl spirolide C(decMeC，SPXl)和Gymnodimine(GYM)配置 成0 . 1 nM (約等于8 0 n g / m L )的樣品，將記憶缺失性貝毒的
主要成分軟骨藻酸(Domoic acid, DA)配成1 280ng/mL的 樣品，將河豚魚毒素(Tetrodotoxin, TTX)配成8 0 0ng/mL的 樣品。按照實施例2所述方法進行實驗。實驗結果表明，軟海綿酸(Okadaic acid,OA)樣品檢測線無顏色出現，同時質控線出現紅色 條帶；而腹瀉性貝毒的其它四種組分扇貝毒素(pectenotoxin-2,PTX-2 )、蟲下夷扇貝毒素(Yessotoxin,YTX )、 13醒Desmethyl spirolide C(decMeC，SPXl)和Gymnodimine(GYM)以及 記憶缺失性貝毒的主要成分軟骨藻酸(Domoicacid， DA)和河豚魚毒 素(Tetrodotoxin， TTX)的樣品檢測線與陰性空白檢測線顏色一致， 同時質控線出現紅色條帶，這表明腹瀉性貝毒的其它四種組分扇貝毒 素(pectenotoxin-2,PTX-2 )、蟲下夷扇貝毒素(Yessotoxin，YTX )、 13-Desmethyl spirolide C(decMeC,SPXl)和Gymnodimine(GYM)以及 記憶缺失性貝毒的主要成分軟骨藻酸(Domoicacid， DA)和河豚魚毒 素(Tetrodotoxin, TTX)與本發明試紙條無交叉反應。顯示本發明試 紙條有良好的特異性。 2、樣品中的軟海綿酸模擬檢測實驗分別向貝肉中添加軟海綿酸標準品，按實施例2制成0 n g /m L、 12.5ng/mL和20.0ng /mL的樣品待測液，并按實 施例2所述方法，用本發明試紙條對Ong/mL、 12.5ng/ mL和2 0.0 n g /mL的樣品檢測，重復實驗6次，結果顯示0 n g /mL樣品的試紙條檢測線與陰性空白檢測線顏色一致，同時質 控線出現紅色條帶，判斷為陰性樣品；而1 2 . 5 n g / mL和2 0 . 0 n g /mL的樣品的試紙條檢測線無顏色，同時質控線出現紅色條 帶，判斷為陽性樣品。說明本發明試紙條可以用來檢測貝類樣品。
權利要求
1、快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體金試紙條，包括樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、吸水紙和PVC背襯，其特征是在PVC背襯上按順序依次粘附有樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、吸水墊，膠金墊為包被抗軟海綿酸單克隆抗體-膠體金標記物的膠金墊，賽多利斯NC膜上分別包被軟海綿酸-卵清蛋白偶聯物構成的檢測線和羊抗鼠多抗構成的質控線。
2、 根據權利要求1所述的快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體金試 紙條，其特征是軟海綿酸單克隆抗體為用軟海綿酸一血藍蛋白偶聯 物免疫B a 1 b / c小鼠，經細胞融合，篩選得到抗軟海綿酸單克隆 抗體的雜交瘤細胞系分泌的。
3、 根據權利要求1或2所述的快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體 金試紙條，其特征是樣本墊、膠金墊、NC膜、吸水墊按順序依次 粘附在PVC背襯上并裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區。
4、 根據權利要求1或2所述的快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體 金試紙條，其特征是其為檢測腹瀉性貝毒主要成分軟海綿酸的試紙 條。
5、 快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體金試紙條的制備方法，其步 驟包括(1) 將軟海綿酸與載體蛋白偶聯，制備得到軟海綿酸一載體蛋白偶聯物；(2) 用軟海綿酸一血藍蛋白偶聯物免疫B a 1 b / c小鼠，經 細胞融合，篩選得到分泌抗軟海綿酸單克隆抗體的雜交瘤 細胞系；(3) 制備抗軟海綿酸單克隆抗體； (4) 用檸檬酸三鈉與氯金酸反應制備膠體金；(5) 將步驟(3 )制得的抗軟海綿酸單克隆抗體加入步驟(4 ) 制備得到的膠體金中，得到抗軟海綿酸單克隆抗體一膠體 金標記物；(6) 將抗軟海綿酸單克隆抗體一膠體金標記物噴點在膠金墊上；(7) 將軟海綿酸一卵清蛋白偶聯物噴點在NC膜上構成檢測線， 并將羊抗鼠多抗噴點在NC膜上構成質控線；(8) 將樣本墊、膠金墊、NC膜、吸水墊按順序依次粘附在PVC 背襯上，并包裝在試紙條卡里，上面開有加樣孔和顯色區，得到所述 的檢測軟海綿酸的免疫膠體金試紙條。
6、快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體金試紙條在檢測軟海綿酸中 的應用。
全文摘要
本發明涉及檢測赤潮毒素的檢測器具。一種快速檢測腹瀉性貝毒的免疫膠體金試紙條，包括樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、吸水墊和PVC背襯；其具體結構是在PVC背襯上按順序依次粘附有樣本墊、膠金墊、賽多利斯NC膜、吸水墊，膠金墊上包被有膠體金標記的抗軟海綿酸單克隆抗體，賽多利斯NC膜上分別包被有軟海綿酸與卵清蛋白偶聯物構成的檢測線和羊抗鼠多抗構成的質控線。本發明試紙條具有特異性強，檢測靈敏度高，檢測快速，前處理簡單等優點，不需任何儀器設備，攜帶方便，檢測成本低，操作簡單易掌握，無需專業人員操作；試紙條儲存方便，穩定性好，在室溫下至少可保存六個月；檢測結果準確性高，精度高。
文檔編號G01N33/558GK101131390SQ200710157470
公開日2008年2月27日 申請日期2007年10月15日 優先權日2007年10月15日
發明者劉仁沿, 劉永健, 梁玉波, 許道艷 申請人:國家海洋環境監測中心