專利名稱：一種白細胞分類試劑和其使用方法
技術領域：
本發明涉及白細胞分類試劑和其使用方法，具體地說涉及通過適宜的電子儀器自動區分血液中白細胞各亞群的試劑和方法。
背景技術：
正常外周血中的白細胞通常可分為五類，即淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞。由血液樣本分析白細胞群體可為眾多疾病的臨床診斷提供許多有用的信息。例如，在出現疾病時血液中的各類白細胞的比例和數量可能發生變化，同時還可能出現異常淋巴細胞和幼稚粒細胞等異常白細胞。因此，分類并測定不同類型的正常和異常白細胞可獲得有關疾病潛伏、起始和發展階段等方面的信息。
傳統血液樣本分析主要是將血液樣本涂片，用特異染料進行細胞內部結構的著色，并于顯微鏡下觀察，計數白細胞各亞群的種類和數目。這種方法費時，而且操作人員的個體識別差異產生不同的結果，因此發展了利用流式技術進行白細胞計數來自動分析白細胞亞群的方法。
目前的對血液樣本中白細胞進行分類的方法有很多，包括采用射頻、高角散射、低角散射、阻抗、側向散射等分別組合的方法，或采用幾步的方法實現對白細胞的分類。目前儀器分析主要采用溶血劑將血液樣本中的紅細胞系溶解，使白細胞產生不同的皺縮而形成大小或散射光強度的差異。
美國專利4751179公開了一種試劑體系和自動細胞計數裝置，其可確定白細胞的四種亞群，即淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性細胞。但該體系需要將樣本混合物在60-75℃下加熱，由此增加了設備的復雜性和成本，并且不能識別異常淋巴細胞和幼稚粒細胞。
中國專利CN1084473C、CN1113241C公開了白細胞4分類試劑和嗜堿粒細胞的測量試劑，以及使用它們將白細胞5分類的方法。該專利的方法采用狹角散射光測定細胞大小信息，并通過廣角散射光測定細胞形態信息而實現白細胞的4分類，而由嗜堿試劑單測嗜堿細胞，從而組成白細胞5分類識別，其獨特之處是采用有機酸類化合物調整白細胞的形態信息。然而該方法無法檢測異常白細胞。
美國專利US6004816公開了采用熒光染料標記細胞內RNA的方法，從而通過側向散射光和熒光強度來分類和計數白細胞，同時識別和計數異常淋巴細胞、未成熟粒細胞等。但是，該專利中使用的熒光染料光穩定性不足，容易造成實驗誤差。
因此，需要新的試劑和方法來區分和計數血液中的正常白細胞，同時識別血液中的異常白細胞，該方法應具有良好的準確度和精密度，并且成本低廉。
發明內容
本發明的一個目標是提供能夠區分和計數血液中的正常白細胞，同時識別血液中的異常白細胞(如異常淋巴細胞和未成熟粒細胞)的試劑，所述試劑包含具有以下結構的熒光染料
其中R1、R2、R3、R4獨立選自氫、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n為1-3的整數，Y-為負離子。
優選所述熒光染料具有如式II所示的分子結構
優選所述試劑還包含紅細胞溶解劑，所述紅細胞溶解劑可包含陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑、緩沖劑或它們的任何組合，還可任選包含醇。
在另一個方面，本發明提供了一種檢測試劑盒，所述試劑盒包含本文中所述的白細胞分類試劑。
在再另一個方面，本發明提供了一種將血液中白細胞分類的方法，所述方法包括 1)將血液樣品與適量的紅細胞溶解劑溶液混合； 2)將式I的熒光染料溶液加入步驟1)的混合物中
其中R1、R2、R3、R4獨立選自氫、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n為1-3的整數，Y-為負離子； 3)測定步驟2)中所得混合物的至少一種散射光特性和至少一種熒光特性； 4)根據散射光特性和熒光特性將白細胞分類和/或計數。
或者，本發明提供一種將血液中白細胞分類的替代方法，其中將紅細胞溶解劑溶液和熒光染料溶液同時加入樣品中。
本發明的這些特征和優點以及其他特征和優點在參考以下附圖和本發明的具體實施方式
之后將變得顯而易見。
圖1為使用實施例1的組合物對正常血液樣本(1號血液樣本)的分析結果二維示意圖。
圖2為使用實施例1的組合物對異常血液樣本(2號血液樣本)的分析結果二維示意圖。
圖3為使用實施例1的組合物對異常血液樣本(3號血液樣本)的分析結果二維示意圖。
具體實施例方式 除另有說明外，本文中使用的術語具有以下含義。
本文中使用的術語“血液”或“血液樣品”是指包含血細胞的體液樣品，例如外周血、骨髓液等。
本文中使用的術語“異常細胞”是指通常不出現在血液中的細胞，包括不成熟細胞和異常成熟細胞，例如不成熟淋巴細胞、不成熟髓細胞(在本文中也稱為Blast)、異常成熟淋巴細胞、異常成熟髓細胞、有核紅細胞等。
本文使用的術語“烷基”指有1-20個碳原子的直鏈或支鏈烴基；所述烷基可任選帶有一個或多個取代基，例如鹵素、羥基、氰基、硝基、氨基、巰基、烷氧基、芳基、芳烷基、雜環基、鹵代烷基、鹵代芳基、鹵代芳烷基等，只要所述取代可形成化學上穩定的化合物，并且不影響本發明熒光染料的熒光性質。
本文使用的術語“烯基”指有2-20個碳原子并具有至少一個碳碳雙鍵的直鏈或支鏈烴基；所述烯基可任選帶有一個或多個取代基，例如鹵素、羥基、氰基、硝基、氨基、巰基、烷氧基、芳基、芳烷基、雜環基、鹵代烷基、鹵代芳基、鹵代芳烷基等，只要所述取代可形成化學上穩定的化合物，并且不影響本發明熒光染料的熒光性質。
本文使用的術語“炔基”指有2-20個碳原子并具有至少一個碳碳三鍵的直鏈或支鏈烴基；所述炔基可任選帶有一個或多個取代基，例如鹵素、羥基、氰基、硝基、氨基、巰基、烷氧基、芳基、芳烷基、雜環基、鹵代烷基、鹵代芳基、鹵代芳烷基等，只要所述取代可形成化學上穩定的化合物，并且不影響本發明熒光染料的熒光性質。
熒光染料 本發明的熒光染料能夠特異性結合細胞內核酸(RNA、DNA)。優選所述染料為紅色激發熒光染料，能夠被紅色半導體激光器等提供紅色區域激光的器件發出的紅色激光所激發，這樣本發明試劑可用于采用半導體激光器等廉價設備作為光源的血液分析儀或流式細胞儀等。在一個實施方案中，熒光染料具有式I所示的結構
其中R1、R2、R3、R4獨立選自氫、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n為1-3的整數，Y-為負離子。
優選本發明的熒光染料具有下式II的結構
本發明的熒光染料可以溶解在乙醇、二甲亞砜、乙二醇中并作為儲存液保存，也可以溶解在其它非水溶劑中。本發明優選使用乙二醇作為溶劑，并任選含有5-10％的甲醇作為稀釋液的成分。此外，為了防止熒光染料聚集，本發明還可任選包含非離子表面活性劑作為分散劑，使熒光染料保持一定的溶解度，不產生聚集。這種非離子表面活性劑例如為聚氧乙烯乙二醇(POE)、聚丙烯乙二醇(POP)、聚氧乙烯乙二醇-聚丙烯乙二醇(POE-POP)、Brij系列非離子表面活性劑。本發明優選使用Brij 35、Brij56等作為熒光染料的分散劑，濃度為0.02-2％。
或者，本發明的熒光染料可與紅細胞溶解劑配制在一起，形成單組分試劑。
紅細胞溶解劑 本發明使用的紅細胞溶解劑可包含陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑、緩沖劑或它們的任何組合。
本發明采用陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑作為溶解紅細胞的試劑，它們的組合可溶解血液樣本中紅細胞，并且適當破壞各亞群白細胞的膜結構，使血液中白細胞的各亞群收縮成適當的大小，促進白細胞內部結構產生不同的凝聚，造成散射光特性的差別。陽離子表面活性劑可以為溴化辛基三甲基銨(OTAB)、溴化癸基三甲基銨(DTAB)、氯化十二烷基三甲基銨(LTAC)、十四烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十四烷基三甲基氯化銨(CTAC)等，優選為LTAC，使用濃度為300-800mg/L。非離子表面活性劑可采用聚氧乙烯型非離子表面活性劑，如長鏈脂肪醇聚氧乙烯、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪胺聚氧乙烯醚等，本發明優選非離子表面活性劑為聚氧乙烯-2，3-十二烷基醚(Brij35)，使用濃度為1-5g/L。
本發明的試劑中可含有保持pH并對血液樣本進行適當稀釋的緩沖液。緩沖液使pH保持在恒定范圍內，由此可穩定各亞群白細胞的染色效果，緩沖劑的使用濃度在0.01-200mM范圍內。對緩沖液的種類并沒有特別限定，只要它們可適用于本發明的目的，例如適當濃度的羧酸鹽類、磷酸鹽類、檸檬酸鹽類、Tris-HCl、MOPS以及其它有機緩沖劑等。本發明試劑中的合適pH因所選擇的具體熒光染料不同而有所不同，一般在pH 7.0-8.0范圍內，優選的pH是7.0。本發明優選Tris-HCl或MOPS緩沖體系。
本發明的紅細胞溶解劑中還可任選包含適當比例的醇，如甲醇，以促進白細胞內部結構的凝聚。
檢測試劑盒 在另一個方面，本發明還提供用于能夠區分和計數血液中的正常白細胞，同時識別血液中的異常白細胞如異常淋巴細胞和未成熟粒細胞的試劑盒，所述試劑盒包含白細胞分類試劑，所述白細胞分類試劑包含具有以下結構的熒光染料
其中R1、R2、R3、R4獨立選自氫、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n為1-3的整數，Y-為負離子。
優選所述熒光染料具有以下結構
優選所述白細胞分類試劑還包含本文上述的紅細胞溶解劑。
在一個實施方案中，所述熒光染料作為儲存液形式存在，保存在單獨的容器中。
在另一個實施方案中，所述熒光染料與上述紅細胞溶解劑一起配制為單成分溶液。
此試劑盒優選包含適于密封保持在至少一個容器中的分區存放的熒光染料。所述試劑盒還可包含將血液中白細胞分類所需的其它白細胞分類試劑以及測定白細胞的方法的說明。所述試劑盒還可包含可測定并與測試樣品對比的對照樣品或一系列對照樣品。試劑盒的各組分可封裝在單個容器中，不同容器連同說明一起全部在單獨包裝中，所述試劑盒用于分類和/或計數血液中的各類白細胞。
使用方法 在另一個方面，本發明還提供分類和/或計數血液中白細胞的方法。簡單地說，在本發明的方法中，通過將血液樣本與本發明的試劑混合，隨后測定樣品的至少一種散射光特性和至少一種熒光特性，并根據散射光特性和熒光特性將樣品分類和/或計數。
本發明方法中使用的血液樣本可以是全血，也可以是成分血。可使血液樣品首先與紅細胞溶解劑和緩沖劑混合，使得紅細胞被溶解，各亞群的白細胞產生不同程度的皺縮。該步驟同時在待測定白細胞的細胞膜上形成小孔，這種小孔足以允許熒光染料分子通過細胞膜。
隨后加入熒光染料儲存液，使得白細胞被熒光標記。在血液樣本與試劑混合時，血液樣本與本發明試劑的總體積應保證足夠的細胞濃度通過儀器的測量池。本發明的試劑組合物將血液樣本稀釋至1∶10、1∶50或1∶100或以上任何范圍中的任何值，只要該稀釋符合實際使用的要求。這種調整在本領域技術人員的范圍內。
樣品混合物可在孵育池中進行溫育，溫育時間不超過40秒，優選24秒；溫育溫度可為任何合適的溫度，例如42℃。隨后稀釋并染色的血液樣品導入流動室中，通過血液分析儀或類似的流式細胞儀的檢測通道，檢測和分析白細胞的至少一種散射光特性和至少一種熒光特性。
本發明中的散射光是指可由市售血液分析儀或類似的流式細胞儀檢測的散射光。這種散射光包括但不限于側向散射光、正向低角度散射光(接受光角度為約0-5度)和正向高角度散射光(接受光角度為約5-20度)。具有這種角度的散射光反映了白細胞大小或內部結構的信息，因此用作本發明的散射光。優選側向散射光。
與細胞中核酸如DNA和RNA結合的熒光染料發射熒光。熒光特性是反映血液樣本中細胞內熒光染料量的參數。由于不同亞群的細胞內代謝活動不同，而造成核酸含量的差異，因此不同亞群的白細胞的熒光特性在某些方面具有差異。取決于所使用的具體染料選擇合適的激發光波長，并監測相應波長的發射光。本發明優選采用紅色半導體激光器發射的紅色波長區域激光為檢測的光源。對所述紅色波長的光源沒有特殊的限制，只要能夠發出所選擇熒光染料的激發波長附近的紅色光，例如約波長600-680nm的光。例如可以使用He-Ne激光器、紅色區域的半導體激光器等。優選使用半導體激光器，因為它相對于其它激光器成本較低，并且體積較小，這樣可降低設備的成本和體積。
利用散射光特性和熒光特性識別各亞群白細胞，以及可能的異淋、幼稚粒細胞等異常信息，并對各聚類散點進行相關的分類計數，計算各亞群白細胞的百分比。散射光反映細胞內部顆粒程度，細胞內部的顆粒程度大致為嗜酸細胞內部有兩分葉核并且內部有很多酸性染料染色的脆質微粒；中性粒細胞核(分葉或桿狀)且內部顆粒較多；單核細胞為單大核內部顆粒較少；LYM細胞單大核基本沒有顆粒。所以相同條件下各類白細胞的散射光強度特性順序為EO(嗜酸細胞)＞NEUT(中性粒細胞)＞MONO(單核細胞)＞LYM(淋巴細胞)。
實施例1 染料的合成 示例性的熒光染料通過以下方式合成，其中所述染料具有以下結構
將20mmol 2-甲基苯并噻唑和22mmol溴化芐加入到50ml含20ml甲苯的圓底燒瓶中，氬氣保護。反應加熱回流持續反應24小時后停止。混合物冷卻后過濾沉淀并用乙醚洗滌濾餅。干燥后得到淡粉色的固體粉末，為中間體1-芐基-2-甲基苯并噻唑季銨鹽，收率58％。
將10mmol1-芐基-2-甲基苯并噻唑季銨鹽與30mmol N，N’-二苯基甲脒在60ml醋酸中，于90℃油浴上加熱攪拌1.5小時。將反應得到的紅色油狀物用石油醚懸濁洗滌3次，除去醋酸。然后加入一定量的乙醚析出橙色固體粉末，過濾，干燥。將此粗產品通過硅膠柱分離，用洗脫液二氯甲烷∶甲醇＝100∶3，收集黃色組分，收率42％。向其中加入4mmol 1-芐基-4-甲基喹啉季銨鹽及10ml吡啶，90℃油浴上加熱攪拌1.5小時。將反應液倒入乙醚中，析出暗紫色小顆粒，過濾，干燥。染料通過硅膠柱分離，用二氯甲烷∶甲醇＝100∶5洗脫液洗脫，收集藍色組分，收率70％。
1H-NMRδ(400MHz，CD3OD，TMS)5.49(s，2H)，5.71(s，2H)，6.44(d，1H)，6.98(d，1H)，7.18-7.80(m，18H)，8.23(t，1H)，8.31(d，1H)，8.36(d，1H)。MS(EI)C33H27BrN2S m/z483.2[M-Br]+。
實施例2 試劑的配制 配制如下組成的試劑體系。
A熒光染料儲存液 熒光染料30mg 乙二醇 900ml 甲醇100ml B紅細胞溶解劑溶液 LTAC 550mg Brij351.5g 三羥甲基氨基甲烷(Tris)13g HCl(13N) 5.8ml 精制水1L 最后將溶液調整pH為7。
實施例3 各種血液樣品的測定和結果 將1ml紅細胞溶解劑與經過抗凝劑處理的20微升血液混勻，并立即加入20微升熒光染料儲存液，在42℃下的孵育池中混勻孵育24秒，形成測定用試樣。測定測定用試樣的側向散射光強度和側向熒光強度。對正常血液樣本1號樣本的測試結果如圖1所示，表明本發明可以實現白細胞五個亞群的分類識別。對異常血液樣本2號樣本(如圖2所示)的測試表明，本發明可有效的區分嗜酸細胞，而且能夠有效的識別異常白細胞，包括幼稚粒細胞、異常淋巴細胞等。對異常血液樣本3號樣本(如圖3所示)的測試表明，本發明不僅能夠實現白細胞各亞群的有效分類，而且能夠有效的識別異常淋巴類細胞。
本文中的所有數據、圖像、儀器、試劑和步驟應理解為說明性而非限制性的。雖然已結合上述具體實施方案描述了本發明，許多修改和其它變化對于本領域技術人員是顯而易見的。所有這種修改和其它變化也落入本發明的精神和范圍內。
權利要求
1.一種白細胞分類試劑，所述試劑包含具有式I的熒光染料
其中R1、R2、R3、R4獨立選自氫、C1-20烷基、C2-20烯基或C2-20炔基，n為1-3的整數，Y-為負離子。
2.權利要求1的白細胞分類試劑，其中所述熒光染料為具有下式的化合物
3.權利要求1或2的白細胞分類試劑，其中所述熒光染料的濃度為1-1000mg/L，優選2-100mg/L，更優選5-50mg/L，最優選10-20mg/L。
4.權利要求1-3中任一項的白細胞分類試劑，所述試劑還包含紅細胞溶解劑。
5.權利要求1-4中任一項的白細胞分類試劑，其中所述熒光染料為單獨的熒光染料儲存液。
6.權利要求1-5中任一項的白細胞分類試劑，其中所述紅細胞溶解劑可包含陽離子表面活性劑、非離子表面活性劑、緩沖劑或它們的任何組合，所述陽離子表面活性劑選自溴化辛基三甲基銨(OTAB)、溴化癸基三甲基銨(DTAB)、氯化十二烷基三甲基銨(LTAC)、十四烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十四烷基三甲基氯化銨(CTAC)和它們的混合物，優選LTAC，濃度范圍為300-800mg/L；所述非離子表面活性劑選自長鏈脂肪醇聚氧乙烯、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪酸聚氧乙烯酯、脂肪胺聚氧乙烯醚和它們的混合物，優選聚氧乙烯-2，3-十二烷基醚(Brij35)，濃度范圍為1-5g/L；所述緩沖劑選自羧酸鹽類、磷酸鹽類、檸檬酸鹽類、Tris-HCl、MOPS和它們的混合物，優選Tris-HCl或MOPS，它們將測定體系的pH保持在7.0-8.0；任選其中還包含適當比例的醇，例如甲醇。
7.一種檢測試劑盒，所述試劑盒包含權利要求1-6中任一項的白細胞分類試劑。
8.一種將血液中白細胞分類的方法，所述方法包括
1)將血液樣品與適量的紅細胞溶解劑溶液混合；
2)將式I的熒光染料溶液加入步驟1)的混合物中
其中R1、R2、R3、R4、Y-和n如權利要求1中定義；
3)測定步驟2)中所得混合物的至少一種散射光特性和至少一種熒光特性；
4)根據散射光特性和熒光特性將白細胞分類和/或計數。
9.權利要求8的方法，其中所述式I的熒光染料為
10.權利要求8或9的方法，其中將紅細胞溶解劑溶液和熒光染料溶液同時加入樣品中。
全文摘要
本發明提供了包含式I熒光染料的白細胞分類試劑，其中R1、R2、R3、R4、Y-和n如說明書中定義。本發明還提供了包含該白細胞分類試劑的試劑盒，以及使用該白細胞分類試劑將白細胞分類的方法。
文檔編號G01N21/64GK101349644SQ20071013917
公開日2009年1月21日 申請日期2007年7月20日 優先權日2007年7月20日
發明者兵 徐, 張寶華, 匡玉吉 申請人:深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司