專利名稱：激光誘導熒光檢測器的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測分析儀器，特別涉及一種主要適用于藥物臨床和生命 科學等領域中的微量樣品檢測的柱內激光誘導熒光檢測器。
背景技術：
近年來，為適應分析儀器微型化的發展趨勢，各種微柱分離方法應運 而生。高靈敏度的檢測方法一直是分析化學研究的重要內容，因此提高檢 測器的靈敏度已成為微柱分離技術實用化的關鍵問題。由于微柱的內徑很 小(一般為幾十至幾百微米)，柱上檢測窗口的體積僅為幾至幾百納升， 常規的紫外光度檢測法不能滿足檢測的高靈敏度要求。激光誘導熒光(laser induced fluorescence, LIF)4僉測法作為一種新型的高靈萄丈度4僉 測方式近年來得到了快速發展和廣泛的應用，是迄今為止靈敏度最高的光 學檢測方法，其對焚光物質的檢測限可以達到zmol數量級，在適當的條 件下甚至可以實現單分子檢測[Lee Y H， Maus R G, Smith BW, et al. Anal Chem, 1994， 66 (23): 4142-4149]。因此，激光誘導焚光檢測可以作為一 種高靈敏度的柱上檢測方法而與毛細管液相色譜、毛細管電泳等微分離模 式連用，實現微量物質的高效分離分析。激光誘導熒光檢測器中所用激光光源一般使用氬離子激光器(488 nm)、氦-氖激光器(594 mn),氦-鎘激光器(325 nm)因壽命較短使用較少。 由于氣體激光器，存在光源體積大、能耗和成本高等缺點，限制了 LIF 的推廣應用。半導體激光器(或稱激光二極管)是近年來發展起來的激光誘 導熒光的理想光源，具有價格便宜，體積小，使用壽命長、穩定可靠等優 點，并且其發射波長已從原來的遠紅外區發展到了采用三倍頻和四倍頻的 藍、綠光以及紫外光，應用范圍正在逐步擴大。在光路設計方面，傳統的激光誘導熒光檢測器主要有正交型和共線 型。多數檢測器釆用的是正交型設計，即入射光、檢測窗口和熒光檢測方 向三者相互垂直。在正交型設計中，由于空間位阻的影響，不宜采用短焦 距透鏡。共線型設計(入射光和檢測光共線)則可以采用短焦距透鏡以及 內徑更小的毛細管，且易于操作。然而，在這兩種光學結構中，入射光都 要通過微柱(毛細管)壁來激發樣品，勢必在毛細管壁產生一定的光反射 的散射，使得由激光器發出的光不能充分用于激發焚光，進而導致較高的 背景噪音，影響熒光激發效率和檢測靈敏度，難以確保或提高微柱分離系統的^r測效率。 發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種具有更高熒光激發效率的激 光誘導熒光檢測器，可與毛細管電泳、毛細管液相色譜和流動注射等微柱 分離系統聯用，而且機構簡單、體積小。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:本發明的激光誘導焚光 檢測器，包括激發光路、分離微柱和熒光收集光路，其特征是所述激發 光路、熒光收集光路的軸線成直角交匯，且激發光路分離微柱同軸；所述 激發光路、分離微柱之間設置有光導纖維，該光導纖維的前端與激發光路 耦合，而其后端則伸至分離微柱的檢測窗口。作為本發明的一種優選方案，為提高熒光信號的收集效率，以達到最 佳的檢測效果，所述光導纖維之內端面與熒光收集光路軸線的垂距為 0.10-0. 2Omm。準確控制該距離，不僅可以得到較低的背景噪音，同時在 樣品測試時能得到較高的熒光信號，這有利于提高檢測信噪比，從而提高 檢測器的靈敏度。本發明的有益效果是，具有光學結構簡單、體積小的特點，可有效地 避免因激光穿透分離柱壁引起的光折射和散射，故能得到較高的熒光激發 效率；激發光通過透^:與一^f艮光導纖維有效耦合后，光導纖維直接伸入分 離微柱內將激發光導入檢測窗口部位，直接實現樣品的熒光激發，有利于 提高檢測靈敏度和準確性；可與毛細管電泳、毛細管液相色鐠和流動注射 等微柱分離系統聯用。
本說明書包括如下五幅附圖
圖1是本發明激光誘導熒光檢測器的結構示意圖； 圖2是本發明激光誘導熒光檢測器與毛細管電泳系統聯用的結構示 意圖；圖4上光纖端部與收集物鏡軸線間的距離對空白硼砂緩沖溶液 (pH9.2)和0.20卞M的NDA標記青霉胺溶液所產生的熒光強度的影響 曲線圖。圖5為本發明激光誘導熒光檢測器的電泳圖鐠。圖中零部件、部位名稱及所對應的標記激發光路10、光源11、透 鏡12、孔光闌13、分離微柱20、檢測窗口部位21、熒光收集光路30、透 鏡組31、孔光闌32、濾光片33、光電檢測器件34、光導纖維40、校準輔 助平臺50、上板51、下板52、螺栓53、垂距d。
具體實施方式
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明。本發明的激光誘導熒光^r測器，包括激發光路10、分離微柱20和焚 光收集光路30。參照圖1，所述激發光路10、熒光收集光路30的軸線成 直角交匯，且激發光路10與分離微柱20同軸。相對于傳統的正交型和共 線型激光誘導焚光檢測裝置而言，具有光學結構簡單、體積小的特點，同 時由于該結構可以有效避免因激光穿透分離柱壁引起的光折射和散射，能 得到較高的熒光激發效率。參照圖1,所述激發光路10、分離微柱20之 間設置有光導纖維40，該光導纖維40的前端與激發光路10耦合，而其后 端則伸至分離微柱20的檢測窗口 21。光導纖維40直接伸入分離微柱內將 激發光導入其檢測窗口，直接實現樣品的熒光激發，有利于提高檢測靈敏 度和準確性，可稱之為"柱內激光誘導熒光檢測器"。為提高熒光信號的收集效率，以達到最佳的檢測效果，所述光導纖維 40之內端面與熒光收集光路30軸線的垂距d為0. 10-0. 20mm。參照圖1,作為一種典型的配置形式，所述激發光路10包括依次設 置的光源11、透鏡12和孔光闌13,以及作用于光源11和透鏡12上使激 發光聚焦于光導纖維40前端的準直系統。激發光路10、分離微柱20熒光
收集光路30通過校準輔助平臺50校準。所述熒光收集光路30包括由下而 上依次設置的透鏡組31、孔光闌32、濾光片33和光電檢測器件34，光電 檢測器件34通常可采用光電倍增管或光子計數器。本發明的檢測器結構 緊湊，針對不同的分析體系只需更換相應的光源11和濾光片33,而這兩 部分均可很容易地實現更換。該檢測器結合相應的檢測池，可以方便的與 毛細管電泳、毛細管液相色譜和流動注射等分析系統在線聯用。圖2示出的是與毛細管電泳系統聯用的檢測系統筒圖。參照該圖，分 離微柱20為毛細管，所述光源11優選地采用半導體激光器。參照圖3， 校準輔助平臺50包括將分離微柱20夾持于其間的上板51、下板52，以及 間隔分布的將上板51、下板52連接且穿過下板52的螺栓53。檢測池設置 在校準輔助平臺50上。參照圖2，激發光通過一孔光闌13后，經透鏡12聚焦于光導纖維40實現樣品的熒光激發。產生的熒光信號以透鏡組31收集，通過調節校準 輔助平臺50，可以保證熒光信號的收集效率。將收集到的萸光信號分別 經過孔光闌32和濾光片33，以削除激發光帶來的背景干擾，最后利用光 電檢測器件34將熒光信號轉換成電信號實現熒光檢測。用上述激光誘導熒光檢測器-毛細管電泳聯用測試以萘-2， 3-二縮醛 (NDA)衍生后的青霉胺(Pen),得到如圖6所示的電泳圖鐠。光源11為457nm的半導體激光器，發出的光經纖維物鏡聚焦于光導 纖維的一端，雜散光可有孔光闌削除。通過光導纖維將激發光直接引入至 檢測窗口處的毛細管內部，實現樣品的熒光激發。產生的熒光信號以物鏡 收集，通過調節校準輔助平臺，輔助平臺為兩塊有機玻璃片制成，并用螺 釘對其進行固定，通過準確調整光導纖維之內端面與熒光收集光路軸線的 垂距d，可以保證熒光信號的收集效率。將收集到的熒光信號分別經過空 間濾光片和510nm的彩色濾光片，以削除激發光帶來的背景干擾，最后利 用光電倍增管將熒光信號轉換成電信號，然后利用色語工作站對所得信號 進行數據處理，從而實現焚光檢測。在對衍生后青霉胺的測試過程中，緩 沖溶液分別置于緩沖瓶和緩沖池中，以Pt絲作為電極，高壓以30kV的高 壓電源提供。 在檢測過程中，準確調整光導纖維之內端面與焚光收集光路軸線的垂距d，對檢測靈敏度影響非常大。通過分別對空白硼砂(pH9. 2)緩沖溶 液和0. 20-pM的NDA標記青霉胺溶液進行熒光信號測定，考察并記錄了 光導纖維處于不同位置(d = 0.10~0.45 mm)時空白緩沖溶液和樣品溶 液所產生的熒光信號強度，結果見圖4。根據此結果，將光導纖維內端面 控制在b點位置d: 0.10-0. 20 mm (其中最優為0.15mm)，可以提高檢 測的信噪比，從而得到最大的檢測靈敏度。對NDA衍生青霉胺后的樣品測試中，其電泳條件為(l)柱前衍生條 件取10 iiL青霉胺的標準溶液于500 uL的塑料離心管中，然后依次 加入150 ti L 10 mM的硼砂緩沖溶液(pH為9. 2 ), 50 u L 2. 0 mM的萘 -2, 3-二縮酪曱醇溶液和50 uL 20 mM的KCN水溶液，充分搖勻，室溫 下放置4h后，引入本發明柱內光纖型激光誘導熒光檢測器-毛細管電泳聯 用系統進行分離測定。(2 )毛細管電泳條件緩沖溶液為10 mM的硼砂緩 沖溶液(pH 9, 2);熔融石英毛細管100 |im i. d. X 50/48 cm (總長/ 有效)；電動進樣10 kV, 10 s;分離電壓18kV。其測試結果取信噪 比為3,本發明柱內光纖型激光誘導熒光檢測器對萘-2, 3-二縮醛標記的 青霉胺的濃度檢測限為0.8 nM。本發明柱內光纖型激光誘導熒光檢測器的電泳譜圖，如圖4所示。A 為0. 20 |oM NDA標記的Pen的電泳圖；B為NDA標記的Pen和氨基酸混合 物溶液的電泳圖，其中，峰a為NDA,峰b為0. 10 |iM NDA-Pen,峰c為 0. 22 pM的NDA-纈氨酸，峰d為0. 16 (oM的NDA-丙氨酸，峰e為0. 25 |oM 的NDA-甘氨酸。
權利要求
1.激光誘導熒光檢測器，包括激發光路(10)、分離微柱(20)和熒光收集光路(30)，其特征是所述激發光路(10)、熒光收集光路(30)的軸線成直角交匯，且激發光路(10)與分離微柱(20)同軸；所述激發光路(10)、分離微柱(20)之間設置有光導纖維(40)，該光導纖維(40)的前端與激發光路(10)耦合，而其后端則伸至分離微柱(20)的檢測窗口(21)。
2. 如權利要求l所述的激光誘導熒光檢測器，其特征是所述光導 纖維(40)之內端面與熒光收集光路(30)軸線的垂距(d)為0. 1 ~ 0. 2隱。
3. 如權利要求1所述的激光誘導焚光檢測器，其特征是所述光導 纖維(40)之內端面與熒光收集光路(30)軸線的垂距(d)為0. 15m。
4. 如權利要求l、 2或3所述的激光誘導熒光^r測器，其特征是所 述激發光路(10)包括依次設置的光源(11 )、透鏡(12)和孔光闌(13)， 以及作用于光源(11 )和透鏡(12)上使激發光聚焦于光導纖維(40)前 端的準直系統。
5. 如權利要求4所述的激光誘導焚光檢測器，其特征是所述光源 (11 )采用的是半導體激光器。
6. 如權利要求l、 2或3所述的激光誘導熒光檢測器，其特征是所 述焚光收集光路(30 )包括由下而上依次設置的透鏡組(31 )、孔光闌(32 )、 濾光片(33)和光電檢測器件(34)。
7. 如權利要求6所述的激光誘導熒光檢測器，其特征是所述光電 檢測器件(34)采用的是光電倍增管。
8. 如權利要求6所述的激光誘導熒光檢測器，其特征是所述光電 檢測器件(34)采用的是光子計數器。
9. 如權利要求l、 2或3所述的激光誘導熒光檢測器，其特征是所 述激發光路(10)、分離微柱(20)熒光收集光路(30)通過校準輔助平 臺(50)校準。
10. 如權利要求9所述的激光誘導熒光檢測器，其特征是所述校準 輔助平臺(50 )包括將分離微柱(20 )夾持于其間的上板(51 )、下板(52 ), 以及間隔分布的將上板(51 )、下板(52)連接且穿過下板(52)的螺栓(53 )。
全文摘要
本發明公開了一種激光誘導熒光檢測器，主要適用于藥物臨床和生命科學等領域中的微量樣品檢測。它包括激發光路(10)、分離微柱(20)和熒光收集光路(30)，所述激發光路(10)、熒光收集光路(30)的軸線成直角交匯，且激發光路(10)與分離微柱(20)同軸，所述激發光路(10)、分離微柱(20)之間設置有光導纖維(40)，該光導纖維(40)的前端與激發光路(10)耦合，而其后端則伸至分離微柱(20)的檢測窗口(21)。本發明的有益效果是，具有較高的熒光激發效率，光學結構簡單、體積小，直接實現樣品的熒光激發，有利于提高檢測靈敏度和準確性，可與毛細管電泳、毛細管液相色譜和流動注射等微柱分離系統聯用。
文檔編號G01N33/15GK101105455SQ20071013892
公開日2008年1月16日 申請日期2007年7月18日 優先權日2007年7月4日
發明者楊秀培, 王春玲, 丹 肖, 蔡明發, 袁紅雁, 趙書林 申請人:四川大學