專利名稱：：Gpr54敲除哺乳動物以及利用它們的篩選方法GPR54敲除哺乳動物以及利用它們的篩選方法本申請是申請號為200380101998.4(國際申請號PCT/GB03/04479)、申請日為2003年10月17日、發明名稱為"GPR54敲除哺乳動物以及利用它們的篩選方法"的申請的分案申請。本發明涉及已知受體的新功能。具體地，本發明涉及甘丙素(galanin)-樣受體或其配體在操縱垂體激素軸和生殖系統中的用途。編碼GPR54的Harrypotter位于人染色體19pl3.3。GPR54的cDNA為1197bp。研究顯示GPR54與大鼠甘丙素受體GalRl,GalR2具有45%同一性，而與GalR3具有44%同一性。甘丙素是神經肽，其不屬于任何已知的神經肽家族。它在中樞和周圍神經系統中表達并調節多種生理過程，包括學習和記憶，疼痛，進食，神經遞質和激素的釋放以及性行為，并被認為參與阿爾茨海默氏癥(Alzheimers)的發病(Lee等1999FEBSlett446:103-107)。然而，據報道甘丙素或甘丙素-樣肽都不活化GPR54(Lee等1999FEBSlett446:103-107;Ohtaki等2001Nature411:613-617)。報道提示FMRF酰胺相關的肽(FaRP)是GPR54的低效激動劑(微摩爾范圍)(Clements等2001BiochemBiophysResCommun284:1189-83)。FaRP是在無脊推動物中廣泛分布的神經肽，其功能為神經遞質和神經調節物。其它研究表明，GPR54的天然配體為kisspeptin(也稱metastin),其為Kiss-l基因的產物。具有常見RF-酰胺C末端的三種肽來自Kiss-l。有54,14和13氨基酸的kisspeptin。它們都以低納摩爾親和力與GPR54結合。Kisspeptin54也稱metastin。這些GPR54配體以低納摩爾親和力與GPR54結合(Muir等2001JBiolChem276:28969-75;Kotani等2001JBiolChem276:34631-36)。一些報道提示配體結合的GPR54具有多種功能。例如，已報道Kiss-l是黑素瘤和乳腺癌細胞的轉移阻抑基因。然而，研究提示Kiss-l基因不影響致腫瘤性(tumorigenicity)。推定metastin通過誘導過量細胞粘附性表型降低細胞移動性。在足墊中注入了黑素瘤的小鼠中，通過輸注給藥metastin—可顯著減少轉移(Ohtaki等2001Nature411:613-617)。類似地，metastin抑制GPR54受體轉染的B16-L16黑素瘤細胞的移動性，但不影響假-轉染(mock-transfected)的細月包。其它研究還顯示GPR54(也稱metastin受體)活化可刺激PIP2水解，4丐動員(mobilization),花生四烯酸釋放，ERK1/2和p38MAP激酶磷酸化，以及stressfibre形成，但抑制細胞增殖(Kotani等2001JBiolChem276:34631-3)。有趣的是，向雌性大鼠靜脈內注入kisspeptin-10刺激催產素分泌(Kotani等2001JBiolChem276:34631-3)。催產素參與性行為/睪丸功能；催產素拮抗劑抑制雄性交配行為(Argiolas等1988EurJPharmacol149:389-92)。然而，催產素KO小鼠顯示正常性行為并是可生育的(Nishimori等1996ProcNatlAcadSciUSA93:11699-704)。在大鼠的以下組織中通過northern蛋白印跡4企測GPR54:腦(橋腦(pons),中月S(midbrain),丘腦(thalamus),下丘月鹵(hypothalamus),海馬(hippocampus),杏仁核(amygdale)，皮質(cortex),額葉(frontal)皮質和纟丈狀體(striatum)),以及外周器官(肝和腸)(Lee等1999FEBSlett446:103-107)。大鼠腦中的原位分析顯示下丘腦和杏仁核區的表達最高。這些受體在以下區域高表達未定帶(zonaincerta)，腹側背蓋區(ventraltegmentalarea),齒狀回(dentategyrus),弓狀核(arcuatenucleus),背側中間核(dorsomedialnucleus),嗅(olfactory)皮質，縫外側核(latemlhabenularnucleus),外側下丘月S(lateralhypothalamus),藍斑(locuscoeruleus)，杏仁核的皮質和中間核(corticalandmedialnucleiofamygdala),上丘(superiorcolliculus)，視前核(preoptic),下丘腦前邵和后邵(anteriorandposteriorhypothalamus),導水管周灰質(periaqueducalgray),丘月S束旁斗亥(parafascicularthalamicnucleus),旁才亥(parabrachialnucleus)以及腹,'J乳頭體(ventralmamillarybody)。GPR54表達與甘丙素受體相似(Lee等1999FEBSlett446:103-107)。在人組織中，northern分析顯示在腦/神經系統(皮質，殼核(putamen)，延髓(medulla),脊髓，在海馬和丘腦中的表達較低)以及垂體，心，骨骼肌，腎，肝，胃，小腸，胸腺，肺，睪丸和胎盤中的表達(Clements等2001BiochemBiophysResCommun284:1189-93;Kotani等2001JBiolChem276:34631-36)。GPR54也通過免疫細胞化學(ICC)在人腦的以下區中檢測到大腦皮質(錐體細胞(pyramidalcell)及其在感覺運動皮質的第III層(laminarlayerIII)中的上行突(ascendingprocess)),丘腦，腦橋-延髓(pons-medulla)(中縫核(raphe),下橄欖核(inferiorolive),舌下神經核(hypoglossalnuclei)),小腦(蒲肯野細月包(purkinjecell)核周體(perikarya)及其上孑亍頂沖對突(ascendingapicaldendrite)。然而，本領域沒有關于GPR54在哺乳動物的總體作用以及其具體在腦內的作用的i/v識。報告表明，FaRP(GPR54的低效激動劑，其在微摩爾范圍起作用)的脊推動物受體在氨基酸水平上與神經肽Y(NPY)受體非常相似(Clements等2001BiochemBiophysResCommun284:1189-93)。其它研究顯示，FaRP與促性腺激素釋放激素(GnRH)共定位(colocalise),與穗狀花序(locusta)中的受精囊(spermatheca)以及食血昆蟲(bloodfeedingbug)的唾液腺共定位。果蠅(Drosophila)FMRF酰胺基因通過其與首先在海蝸牛黑斑海兔(marinesnailAplysia)中測序的基因的同源性鑒定。FMRF酰胺基因最初作為來自蛤(clam)的中樞神經系統的心血管系統調節性四肽而純化。在軟體動物(molluscs)中，其調節心臟輸出以及神經元的作用，并調節誘導的(evoked)肌肉張力。在牛(cattle)中，對相關龍蝦激素具有免疫反應性的兩種肽已經鑒定出；所述牛蛋白具有抗止痛活性。盡管FMRF-酰胺肽的作用主要在無脊推動物中研究，有3篇文獻描述了FmRF酰胺在哺乳動物腦內的免疫反應性一種在兔、大鼠和豚鼠中(Duann等1995GaoxiongYiXueKeXueZaZhi.11:142-9)，一種在樹錄(treeshrew)中(MalzandKuhn2002DevBrainRes135:39-44),還有一種在大褐蝙蝠(bigbrownbat)中(Oelschlager等1998BrainBehavEvol52:139-47)。有趣的是，所有這些文獻都描述了FmRF酰胺-樣及GnRH免疫反應性的共表達。在蝙蝠和樹鼯中，這種表達見于終末神經(terminalnerve)。所述終末神經是前顱神經(anteriorcranialnerve),其支配鼻腔的化學感受性上皮。該神經的功能未知，但據提示其具有神經調節作用。破壞該神經導致雄性倉鼠(hamster)的交配行為受損(Wirsig,andLeonard1987BrainRes417:293-303)。根據Raffa(RaffaandStone1988Peptides19:1171-75)，FMRF酰胺或FMRF酰胺-相關肽(FaRP)存在于哺乳動物中樞神經系統和胃腸道，并對哺乳動物具有心臟激動作用(cardioexcitatory),抑制嗎啡4秀導的抗疼痛作用，以及阻斷嗎啡-、擊敗(defeat)-和剝奪(deprivation)誘導的進食(feeding)。它還抑制結腸推進性運動(colonicpropulsivemotility),在鞘內注射時誘導對行為的影響，并據報道對嚙齒類動物具有致失憶(amnesic)作用。具體地，FMRF酰胺在小鼠體內產生中樞介導的抗疼痛作用(RaffaandStone1998Peptides19:1171-75，Gupta等1999Peptides20:471-78)。以前的研究表明，甘丙素敲除小鼠(至今沒有關于受體敲除(receptorknock-out)的描述)是可得的，其可正常生長并繁殖但不能泌乳。它們的感覺神經元對損傷的反應被破壞，周圍神經再生降低，并且神經性疼痛的出現明顯減少。DRG神經元的亞群在突變小鼠中缺失，表明甘丙素在細胞存活中有作用(Wynick等1998AnnNYAcadSci,863:22-47)。研究表明GPR54與多步驟轉移也有關，包括癌細胞從原發癌的脫離，侵入周圍組織，通過循環擴散，再入侵遠處器官并在其中增殖。然而，在本申請提交時，沒有發現GPR54的其它作用。因此，仍需要鑒定配體結合的GPR54在腦和其它組織內的功能，從而將其用于治療或其它用途。發明概述本發明人制成GPR54(HarryPotter)敲除(knockout)小鼠來研究GPR54的體內作用。本發明人還顯示所述敲除小鼠與非突變體的生殖形態以及生理有差異，提示GPR54具有在控制性激素軸以及生殖區諸如控制生育力和性;欲中的作用。此外，這種突變體的生理和形態提示GPR54在一些神經疾病和其它疾病例如月幾肉消耗性疾病(musclewasting)和炎癥中的作用。HarryPotter敲除小鼠可用作疾病模型以及鑒定用于治療的GPR54拮抗劑和〗敫動劑。因此，本發明的第一方面提供了GPR54敲除哺乳動物，其包含一或多種細胞，所述細胞中GPR54多肽是功能失活的。本發明人還發現本發明前述方面的GPR54敲除小鼠顯示許多限定性性質，包括接觸性翻正反射減少和Barnesmaze表現降低，生殖激素水平和/或模式(包括周期)改變，生殖器官和相關器官的形態改變，性/生殖行為改變。如上所述，生殖器官形態改變包括以下所述一或多種生殖器(genital)和相關器官萎縮，胃和頜下腺(submaxillarysalivaryglands)萎縮，肌肉和褐色脂肪萎縮。敲除哺乳動物的產生是本領域技術人員熟悉的并可利用本文所述涉及同源重組的標準實驗室技術。優選，所述轉基因動物是選自下組的哺乳動物之一小鼠，大鼠，地鼠(shrew),沙鼠(gerbil),豚鼠，猴，倉鼠，貓或狗。本領域熟練技術人員理解所列舉動物并非窮盡性的。最優選，所述哺乳動物是小鼠。本文術語"功能失活的"(GPR54,通過同源重組)意思是與其中的GPR54不是功能失活的對照相比，通常由GPR54多肽在其天然環境(即在體內環境中)下發揮的一或多種功能被明顯抑制。優選，術語"功能失活的"指與其中的GPR54不是功能失活的對照相比，GPR54在其天然環境(體內環境中)通常顯示的一種以上的功能被明顯抑制。更優選，本文術語"功能失活的"指與其中的GPR54不是功能失活的對照相比，GPR54在其天然環境(體內環境中)通常顯示的所有功能被明顯抑制。同樣，本文的"功能失活的(functionallyinactivated)"GPR54核酸編碼本文的功能失活的GPR54。如上所述，術語"明顯抑制的"(GPR54功能)指所述抑制(如上述通過同源重組對哺乳動物細胞中的至少一種GPR54功能而言)與適宜的對照相比被抑制至少20%。適宜對照的實例是相同或相似體內環境中的相同或相似細胞，其中GPR54沒有如本文所述由于同源重組而功能失活。優選，術語"明顯抑制的"(如上述通過同源重組對哺乳動物細胞中的GPR54功能而言)指至少一種GPR54功能與適宜的對照相比被抑制至少30%,40%，50%,60%,70%,80%,90%或95%。最優選，術語"明顯抑制的"(如上述通過同源重組對哺乳動物細胞中的GPR54功能而言)指至少一種GPR54功能與適宜的對照相比^皮抑制100%。另一方面，本發明提供了產生一或多種哺乳動物細胞的方法，所述細胞包括一或多種功能失活的GPR54基因，所述方法包括選擇一或多種包含一或多種功能活性內源GPR54基因的細胞。利用功能失活的GPR54核酸轉染步驟(a)的一或多種細胞，所述功能失活的GPR54核酸可通過同源重組與一或多種內源GPR54基因組合。選擇一或多種細胞，其中的一或多種內源GPR54基因已經和功能失活的GPR54核酸進行了同源重組。優選，本發明的哺乳動物細胞根據本發明上述方法產生。在本發明該方面優選的實施方案中，所迷哺乳動物細胞包含在哺乳動物內。即根據本發明上述方面的細胞將優選構成"敲除"哺乳動物。優選，本文的敲除哺乳動物是小鼠。用功能失活的GPR54轉染一或多種細胞的方法涉及利用標準分子生物技術以及本文所述技術。同樣，選擇一或多種細胞的方法利用標準實驗室技術(在本文描述)進行，所述細胞中的一或多個內源GPR54基因與功能失活的GPR54核酸已經進行了同源重組。另一方面，本發明提供核酸構建體，其適于宿主細胞中功能失活的一或多種內源GPR54基因，所述構建體包括(a)A非-同源置換區(replacementregion),(b)位于所述非-同源置換區上游的第一同源區，(c)突變的GPR54基因，其表達時不編碼功能活性GPR54,(d)位于所述非-同源置部分下游的第二同源區，所述第二同源區位于該非-同源置換區的下游，并具有與第二GPR54基因至少90%相同的核苷酸序列。本發明人鑒定了與GPR54相關的數種功能，由此他們認為GPR54多肽，或其一或多種結合蛋白或編碼它們的核酸有治療意義。因此，另一方面，本發明提供包含GPR54多肽的組合物、或其一或多種結合蛋白、或編碼它們的核酸，以及可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。根據本發明上述方面，優選所述組合物包含一或多種GPR54多肽結合蛋白。優選所述一或多種GPR54結合蛋白是GPR54的拮抗劑或激動劑。GPR54結合蛋白可以是天然存在的或合成的。天然存在的結合蛋白可為多肽諸如本文所述的抗體或核酸。合成GPR54結合蛋白優選可為較小的分子并可通過篩選方法選擇，所述篩選方法是本領域技術人員所熟悉的并在本文描述。在本發明另一可選實施方案中，優選所述組合物包含編碼GPR54結合蛋白的核酸或編碼GPR54多肽的核酸。9本發明人吃驚地發現GPR54敲除小鼠與正常對照小鼠相比具有改變的神經元功能以及改變的生殖系統。此外，GPR54敲除小鼠具有其它形態學和解剖學異常。GPR54敲除小鼠垂體下丘腦軸的促性腺激素產生有缺陷。GPR54受體因此據信通過控制垂體-下丘腦的促性腺激素分泌參與控制該軸。本發明人還顯示在GPR54敲除小鼠中(a)促性腺激素較低；(b)至少卵巢對給予外源性促性腺激素有反應，表明它們保持應答能力；和(c)外源性給予GnRH誘發至少部分FSH和LH分泌的反應，表明GPR54可能參與下丘腦-垂體中GnRH分泌的上游控制。因此，本發明人認為GPR54的激動劑和/或拮抗劑或包含它們的組合物具體可用于治療生殖激素(reproductivehormone)相關的、神經性和其它一些疾病。所述神經性疾病包括但不限于以下疾病中的一或多種阿爾茨海默氏癥,感覺神經元病(sensoryneuropathy)和癲癇(epilepsy)。這種生殖激素相關的疾病包括一或多種選自下組的疾病生育力(fertility)、節育(contracteption)、性欲和青春期開始(libidoandtheonsetofpuberty)的調節，泌乳(lactation),骨質疏松(osteoporosis)/骨硬化病(osteopetrosisi)或停經(menopause)。此外，GPR54激動劑或拮抗劑可用于激素替代治療(HRT)。其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛(pain),激素依賴性癌癥(hormonedependentcancer)和月巴胖(obesity)。因此，本發明另一方面提供了鑒定一或多激動GPR54多肽的功能活性的一或多種分子的方法，包括以下步驟選擇一或多種哺乳動物，其包含功能失活的GPR54多肽；(b)用一或多種可能的GPR54類似物(mimic)治療所述一或多種哺乳動物，所述類似物可能激動至少一方面的GPR54活性；(c)檢測根據步驟(b)治療的一或多種哺乳動物，以確定這些經過治療的哺乳動物與根據步驟(a)選出的哺乳動物相比是否具有一或多種恢復的性質和(d)選出一或多種GPR54-配體類似物，所述類似物使得根據步驟(a)選出的哺乳動物恢復野生型哺乳動物的一或多種性質。本發明還提供鑒定拮抗GPR54多肽的有功能活性的一或多種分子的方法，包括以下步驟(a)選擇一或多種哺乳動物，其包含功能活性GPR54多肽；(b)用一或多種可能的GPR54拮抗劑治療所述一或多種哺乳動物，所述拮抗劑可能拮抗至少一方面的GPR54活性；(c)檢測根據步驟(b)治療的一或多種哺乳動物，以確定這些經過治療的哺乳動物與根據步驟(a)選出的哺乳動物相比是否具有一或多種經過調節的性質。此外，本發明提供轉基因GPR54敲除哺乳動物在用于測定一或多種化合物的生物效應的實驗中的用途。根據本發明上述方面，術語"拮抗劑"指與適當的對照相比，顯著抑制(如本發明定義)GPR54的一或多種功能的分子。本發明利用GPR54本身，其激動劑和拮抗劑，以及GPR54活性的調節物。本領域技術人員應理解多種試劑可增加或降低GPR54的效應，且實現上述效應改變的途徑有多種；因此所述激動劑可模擬活化的GPR54,或與GPR54結合并增加其活性；GPR54活性的激動型調節物也如此，或增加GPR54的內源激動劑或內源GPR54本身的產生。拮抗劑和拮抗型調節物的作用可相同(likewise),但都降低GPR54的生物效應。本文術語"哺乳動物"指任何哺乳動物。優選所述哺乳動物是非人哺乳動物。優選所述哺乳動物選自小鼠，大鼠，豚鼠，兔，倉鼠，沙鼠，貓，狗和猴。本領域技術人員應理解所列動物并非窮盡性的。根據本發明這方面，術語"治療"(用可能的GPR54拮抗劑治療哺乳動物)指使得所述哺乳動物的一或多種細胞與一或多種可能的GPR54拮抗劑接觸。根據本發明上述方面，異常神經性質的指征包括接觸性翻正反射減少和Barnesmaze表現降低。根據本發明上述方面，術語"異常生殖系統和/或形態"包括'生殖激素水平和/或模式(包括周期)與適宜對照相比的任何改變，生殖器官和相關器官形態與適宜對照相比的任何改變，以及性/生殖行為與適宜對照相比的改變。優選，根據本發明上述方面，生殖器官形態與適宜對照相比的改變包括選自下組的一或多種改變生殖器及相關器官萎縮，胃及頜下腺萎縮，肌肉及褐色脂肪萎縮。異常神經功能，異常生殖系統和異常生殖形態的檢測利用標準實驗室技術并是本領域技術人員熟悉的。優選，本發明上述方面的步驟(c)涉及檢測一或多種哺乳動物，以確定所述哺乳動物是否顯示一或多種由GPR54敲除小鼠顯示的性質，所述性質是異常生殖系統和/或形態。根據本發明上述方面，根據步驟(a)選出的一或多種哺乳動物優選為GPR54敲除小鼠。優選，它們根據本文所述方法產生。本文術語"功能失活的"(GPR54)意思是與其中的GPR54沒有被功能失活的對照相比，通常由GPR54多肽在其天然環境(即在體內環境中)顯示的一或多種功能被明顯抑制。優選，術語"功能失活的"指與其中的GPR54沒有被功能失活的對照相比，GPR54在其天然環境(體內環境中)通常顯示的一種以上的功能被明顯抑制。更優選，本文術語"功能失活的"指與其中的GPR54沒有被功能失活的對照相比，GPR54在其天然環境(體內環境中)通常顯示的所有功能被明顯抑制。同樣，本文"功能失活的"GPR54核酸編碼本文功能失活的GPR54。如上所述，術語"明顯抑制的"(GPR54功能)指所述抑制(如上述通過同源重組對哺乳動物細胞中的至少一種GPR54功能而言)與適宜的對照相比被抑制至少20%。適宜對照的實例是相同或相似體內環境中的相同或相似細胞，其中GPR54沒有如本文所述由于同源重組而被功能失活。優選，術語"明顯抑制的，，(如上述通過同源重組對哺乳動物細胞中的GPR54功能而言)指至少一種GPR54功能與適宜的對照相比被抑制至少30%，40%,50%,60%,70%,80%,90%或95%。最優選，術語"明顯抑制的"(如上述通過同源重組對哺乳動物細胞中的GPR54功能而言)指至少一種GPR54功能與適宜的對照相比被抑制100%。根據本發明這方面，術語"治療"(用可能的GPR54拮抗劑治療哺乳動物)指使得所述哺乳動物的一或多種細胞與一或多種可能的GPR54拮抗劑接觸。根據本發明上述方面，術語"野生型哺乳動物的一或多種經過調節的活性"指調節野生型哺乳動物與包含本文所述功能失活的GPR54多肽的哺乳動物相比的一或多種活性。優選所述調節是恢復丟失的功能。本文的GPR54類似物復制野生型GPR54的至少一種活性或功能。所述類似物可模擬活化的GPR54，或模擬失活的GPR54,使得其進一步抑制功能，所述功能本身在缺乏天然失活的GPR54時被抑制。本發明人認為GPR54核酸或編碼GPR54的一或多種激動劑或拮抗劑的核酸可插入哺乳動物以產生一或多種治療效果。另一方面，本發明提供轉基因動物，其中至少部分細胞包含編碼一或多種選自下組物質的外源性核酸GPR54多肽，GPR54多肽的一或多種激動劑以及GPR54多肽的一或多種拮抗劑。優選，所述轉基因動物選自小鼠，人，豬，山羊，鹿，猴和母牛。本領域技術人員理解所列動物并非窮盡性的。根據本發明上述方面，術語"外源性核酸"指不源自所述具體動物的核酸。然而，其可來自相同動物種類或品系。例如，轉基因小鼠可包含細菌來源的GPR激動劑核酸。優選，轉基因動物的部分細胞包含外源性DNA，所述外源性DNA編碼GPR54的一或多種激動劑或一或多種拮抗劑。本文的非人轉基因動物可為選自下組的一或多種動物小鼠，大鼠，猴，狗，貓和豬。本領域技術人員應理解所列動物并非窮盡性的。利用根據本發明制備的GPR54敲除小鼠進行研究表明，GPR54多肽與神經元功能和生殖功能(包括生殖周期)以及其它疾病有關。這種神經疾病包括，但不限于以下疾病的一或多種阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病或癲癇。所述生殖激素相關疾病包含下組疾病的一或多種生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳，骨質疏松/骨硬化病或停經。此外，GPR54激動劑或拮抗劑可用于激素替代治療(HRT)。其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛,激素依賴性癌癥和肥胖。因此，本發明另一方面提供診斷選自下組的疾病的方法阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳,骨質疏松/骨硬化病，停經，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥或肥胖，所述方法包括以下步驟從待診斷的患者中選出細胞樣品，比較所述細胞樣品與來自健康個體的一或多個對照樣品的GPR54多肽表達水平和/或功能活性。另一實施方案中，HarryPotter或其天然配體的多態性可用于i會斷疾病。因此，本發明提供了診斷選自以下疾病的方法阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳，骨質疏松/骨硬化病,停經，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥或肥胖，包括以下步驟從待診斷的患者中選出細胞樣品，分析所述細胞中的內源核酸，以檢測內源性GPR54基因一或多種天然GPR54配體的一或多種多態性。根據本發明上述方面，其中GPR54的表達水平和/或功能活性增加、降低或改變，或其中GPR54核酸或編碼GPR54配體的核酸包含一或多種多態性的樣品，與來自健康個體的一或多種對照樣品相比可表明前一種樣品所來源的個體具有上述一或多種疾病。根據本發明上述方面，利用標準實驗室技術選擇來自患者的樣品細胞，所述技術是本領域技術人員熟悉的。上文術語GPR54多肽的"功能活性"指GPR54在其天然環境即在其細胞內中通常執行的功能。因此，另一方面，本發明提供治療患者中選自下組的疾病肌肉消耗性疾病，疼痛，炎癥，激素依賴性癌癥，泌乳，骨質疏松/骨硬化病，與停經相關的激素失衡或肥胖，所述治療包括用治療有效量的GPR54的一或多種拮抗劑或激動劑治療所述患者。另一方面，本發明提供GPR54的一或多種拮抗劑或激動劑在制備用于預防或治療疾病的藥物中的用途，所述疾病選自下組肌肉消耗性疾病，疼痛，炎癥，激素依賴性癌癥，泌乳，骨質疏松/骨硬化病，與停經相關的激素失衡或肥胖。另一方面，本發明提供操縱患者性激素軸的方法，包括用治療有效量的GPR54的一或多種拮抗劑或激動劑治療患者。另一方面，本發明提供GPR54的拮抗劑或激動劑在制備用于操作動物性激素軸的藥物中的用途。根據本發明上述兩方面，優選對性激素軸搡縱的導致對選自下組的任何一或多種影響(effect)或疾病的操縱生育力，性欲，節育和青春期早熟(precociouspuberty)。附圖簡述圖1顯示GPR54敲除前，小鼠GPR54基因組基因座的結構。圖2顯示GPR54敲除后，小鼠GPR54的基因組基因座的結構。圖3顯示用于GPR54同源重組的乾向型載體(targetingvector)的結構，包括相關限制位點。圖4a顯示敲除小鼠腦切片以及圖4b顯示對雜合子和野生型的檢測。圖5a顯示對野生型和突變體小鼠的檢測。圖5b顯示野生型小鼠的包皮腺(preputialgland)，且圖5c顯示突變體小鼠的包皮腺。圖6顯示野生型(上圖)和敲除小鼠(下圖)的卵巢。圖7圖示用Barnesmaze實驗比較野生型和敲除小鼠的行為的結果。圖8顯示敲除小鼠陰道涂片的照片。圖9圖示野生型和敲除小鼠的平均睪丸重量。圖10顯示野生型和敲除小鼠的平均肌肉重量。圖11顯示野生型和敲除小鼠的平均腎上腺重量(圖lla)和唾液腺重量(圖llb)。圖12顯示雄性和雌性GPR54敲除小鼠與野生型小鼠相比的睪酮水平。圖13圖示雌性敲除小鼠的雌二醇水平。圖14圖示雌性(圖14a)和雄性(圖14b)敲除小鼠的FSH水平。圖15圖示血清(圖15a)和垂體(圖15b)的LH水平。圖16顯示電Northern(electronicNorthern)。
發明內容除非特別說明，本發明的實踐采用傳統的化學、分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學技術，其是本領域技術人員能力范圍內的。所述技術在文獻中有描述。見例如，J.Sambrook，E.RFritsch,andT.Maniatis，1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二片反,Books1-3，ColdSpringHarborLaboratoryPress;Ausubel，F.M.等(1995andperiodicsupplements;CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,and16,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,andA.Kahn，1996，DNAIsolationandSequencing:EssentialTechniques,JohnWiley&Sons;J.M.PolakandJamesO'D.McGee,1990,InSituHybridization:PrinciplesandPractice;OxfordUniversityPress;M.J.Gait(Editor),1984,OligonucleotideSynthesis:APracticalApproach,IrlPress;and,D.M.丄LilleyandJ.E.Dahlberg，1992，MethodsofEnzymology:DNAStructurePartA:SynthesisandPhysical分析of.DNAMethodsinEnzymology,AcademicPress。所述文獻的內容包含在本文作為參考。GPR54為避免疑問，本文術語"GPR54"指任何通過相關GenBank登錄號鑒定的以下序列NT011255人(Homosapiens)染色體19基因組片段組(contig);NM053244小家鼠(Musmusculus)G蛋白-偶聯的受體54(Gpr54)，mRNA;BC016531小家鼠G蛋白-偶聯的受體54,mRNA(cDNA克隆MGC:27839IMAGE:3488082)，完全cds;M032551人G蛋白-偶聯的受體54(GPR54),mRNA;NM023992大家鼠(Rattusnorvegicus)G蛋白-偶聯的受體54(Gpr54),mRNA;NW047773大家鼠染色體7WGS超片段組(supercontig);AK039628成年雄性小家鼠脊髓cDNA，RIKEN全長富集的(enriched)文庫，克隆:A330075J02產物:G-蛋白-偶聯的受體GPR54(G蛋白COUPLED受體54)，整個(full)插入序列；NT039496小家鼠染色體10基因組片段組，品系(strain)C57BL/6J;AY029541人推定的G蛋白-偶聯的受體mRNA,完整(complete)cds;AF343726小家鼠G-蛋白偶聯的受體GPR54(Gpr54)mRNA，完整cds;AF343725人G蛋白-偶聯的受體GPR54(GPR54)mRNA,完整cds;BE506644db65fO8.ylWellcomeCRCpSK卯光滑爪蟾(Xenopuslaevis)cDNA克隆IMAGE:33778955'類似于TR:Q9ZOT7Q9ZOT7ORPHANG蛋白-偶聯的受體GPR54.;,MRNA序歹'J;BB261471BB261471RIKEN全長富集的，7日齡新生鼠小腦小家鼠cDNA克隆A730098N233'類似于AF115516大家鼠孤兒(orphan)G蛋白-偶聯的受體GPR54(GPR54)mRNA,MRNA序列；AF115516大家鼠孤兒G蛋白-偶聯的受體GPR54(GPR54)mRNA,完整cdsGPR54多肽本文術語"多肽"指任何包含相互通過肽鍵或修飾的肽鍵即肽同配體(isostere)相連的兩個或多個氨基酸的任何肽或蛋白。"多肽"指短鏈(通常稱為肽，寡肽或寡聚物)和長鏈(通常稱為蛋白)。多肽可包含20種基因所編碼的氨基酸以外的氨基酸。"多肽"包括通過天然過程(諸如翻譯后加工等)和本領域已知的化學修飾技術修飾的氨基酸序列。這種修飾在教科書中描述并在專論以及大量研究文獻中更具體地描述。修飾可出現在多肽任何部位，包括肽主鏈，氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。可理解給定多肽的數個位點的同類型修飾可相同或有不同程度變化。同樣，給定多肽可包含許多類型的修飾。由于泛化(ubiqitination)多肽可為分支的或有或無分支的環狀。環狀、分支的、和分支的環狀多肽可以是轉錄后天然加工的結果或可通過合成方法制備。修飾包括乙酰化，酰化，ADP-核糖基化，酰胺化，與黃素共價結合(convalentattachementofflavin)，與血紅素部分共價結合，與核苷S臾或核香酸衍生物共價結合，與脂質或脂質衍生物共價結合，與磷脂酰肌醇共價結合，交聯化(cross-inkings)，環化(clyclization),二硫鍵形成，去曱基化，共價交聯形成，半胱氨酸形成，焦谷氨酸鹽/酯(pyroglutamate)形成，曱酰化，Y-羧化，糖基化，GPI錨(anchor)形成，羥化，碘化，甲基化，肉豆蔻酰化，氧化，蛋白水解加工，磷酸化，異戊烯化(prenylation)，外消旋化(racemization),硒酰化(selenoylation),硫化，轉運-RNA介導的氨基酸添加到蛋白，諸如精氛酸化(arginylation)和泛化(ubiquitination)。見例如,Proteins-StructureandMolecularProperties,2ndEd.，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany,NewYork，1993and^Vold，F.,PosttranslationalProteinModifications:PerspectivesandProspects,pgs.1-12inPosttranslationalCovalentModificationofProteins,B.C.Johnson,Ed.,AcademicPress,NewYork,1983;Seifter等，"AnalysisforProteinmodificationsandnonProteincofactors",MethEnzymol(1990)182:626-646andRattan等，"ProteinSynthesis:PosttranslationalModificationsandAging",AnnNYAcadSci(1992)663:48-62本發明術語"變體"，"同源物"，"衍生物"或"片段"包括從或對序列的任何替換，變異，修飾，取代，缺失或添加一(或多個)氨基"S吏。除非具體說明，"GPR54"包括GPR54的所述變體，同源物，衍生物和片段。諸如GPR54的受體的"受體活性"或"生物活性"指GPR54受體的那些活性。還包括GPR54受體的抗原性和免疫原活性。GPCR活性的實例，測定并定量所述活性的方法是本領域已知的，并描述的本文其它部分。本文的"缺失"指核苷酸或氨基酸序列改變，其中一或多個核苷酸氨基酸分別缺失。本文術語"插入"或"添加"是核苦酸或氨基酸序列改變，其分別導致與天然物質相比一或多個核苷酸或氨基酸殘基的添加。本文的"替換"是不同核苷酸或氨基酸分別取代一或多種核苷酸或氨基酸的結果。本發明的GPR54多肽可具有氨基酸缺失，插入或取代，其導致沉默型(silent)改變并產生功能對等的氨基酸序列。基于所述殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性.親水性和/或兩親性的相似性可進行有目的的氨基酸取代。例如，帶負電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；帶正電的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；疏水性值相似的、具有不帶電極性頭基團的氨基酸包括亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，精氨酸，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。GPR54核苦酸和多核苷酸"多核苷酸"通常指任何聚多核糖核苷酸或聚多脫氧核糖核苷酸，其可為未修飾或修飾的RNA和/或DNA。"多核苷酸"包括，但不限于單-和雙鏈DNA、單-和雙鏈區的混合物DNA,單-和雙鏈的RNA,單-和雙鏈區的混合物RNA，雜合分子包括單鏈或雙鏈DNA和RNA,或更常見為雙鏈的或單-和雙鏈區混合物。此外，"多核苷酸"指三鏈區，包括RNA和/或DNA。術語多核苦酸還包括含有一或多個修飾的基團的DNA或RNA，以及具有為穩定性或其它原因而進行修飾的主鏈的DNA或RNA。"修飾的"基團包括，例如三苯曱基化的基團和不常見的基團諸如肌苷。已對DNA和RNA進行多種修飾，因此"多核芬酸"包括通常見于天然環境的多核苷酸的化學、酶或代謝修飾的形式，以及病毒和細胞的DNA和RNA的化學修飾形式。"多核苷酸"還包括相對較短的多核苷酸，通常稱為寡核苷酸。本領域技術人員應理解由于遺傳密碼的簡并性多種核苷酸序列可編碼相同的多肽。本文所述"核苦酸序列"指核苷酸序列，寡核苦酸序列，多核苦酸序列及其變體，同源物，片段和衍生物(諸如其一部分)。所述核苷酸序列可為基因組或合成或重組來源的雙鏈或單鏈DNA或RNA，代表有義鏈或反義鏈或其組合。術語核苷酸序列可通過利用重組DNA技術(例如重組DNA)制備。優選，術語"核苷酸序列"指DNA。本發明術語"變體"，"同源物"，"衍生物，，或"片段"包括從或對GPR54核苦酸序列的任何取代，變異，修飾，置換，缺失或添加一(或多個)氨基酸。除非具體說明，"GPR54"包括GPR54的所述變體，同源物，衍生物和片段。GPR54的表達分析為設計用于治療GPR54相關疾病的治療劑，可測定GPR54(野生型或具體突變體)的表達圖譜。因此本領域已知的方法可用于測定器官，組織和細胞類型(以及發育階段)，其中有GPR54表達。可進行例如傳統或"電，，Northern。反轉錄酶PCR(RT-PCR)也可用于測定GPR54基因或突變體的表達。測定GPR54表達圖譜的更敏感的方法包括RNAse保護實驗(protectionassay),這是本4頁i或已^口的。Northern分析是實驗室技術，可用于檢測基因轉錄物的存在，并涉及標記的核苷酸序列與膜的雜交，其中來自具體細胞類型或組織的RNA固定在所述膜上。(Sambrook,supra,ch.7andAusubel，F.M.等supra,ch.4and16.)類似的計算機技術("電Northern")利用BLAST,用于搜索核苷酸數據庫如GenBank或LIFESEQ數據庫(IncytePharmaceuticals)中的相同或相關分子。這種分析類型的優勢在于它們比多重膜雜交(multiplememebrane-basedhybridization)更快。此外，無論任何具體配對被分類為精確的(exact)或同源的(homologous),所述計算機搜索的敏感性可修飾。本發明的多核苷酸和多肽，包括上述探針，可用作研究試劑和材料以發現治療和診斷動物和人類的疾病，本文以下部分將詳述。GPR54多肽的表達GPR54多肽的表達是產生GPR54抗體所需的，所述抗體的功能為本文所述GPR54的激動劑或拮抗劑。為表達生物活性GPR54多肽，編碼GPR54或其同源物、變體或衍生物的核香酸序列被插入適宜的表達載體，即含有用于轉錄和翻譯插入的編碼序列所需元件的載體。用本領域技術人員已知的方法構建表達載體，所述載體含有編碼■GPR54的序列和適宜轉錄及翻譯控制元件。這些方法包括體外重組DNA技術，合成技術以及體內基因重組。所述技術描迷于Sambrook，J.等(1989;MolecularCloning,ALaboratoryManual,ch.4,8,and16-17,ColdSpringHarborPress,Plainview，N.Y.)andAusubel，RM.等(1995andperiodicsupplements;CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,and16，JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.)。多種表達載體/宿主系統可用于包含并表達編碼GPR54的序列。這些包括，但不限于諸如用重組噬菌體，質粒，粘粒DNA表達載體轉化的細菌；用酵母表達載體轉化的酵母；用病毒表達載體(諸如桿狀病毒)轉化的昆蟲細胞系統；用病毒表達載體(例如花椰菜嵌合病毒(cauliflowermosaicvims)(CaMV)或煙草嵌合病毒(TMV))或病毒表達載體(例如，Ti或pBR322質粒)轉化的植物細胞系統；或動物細胞系統。本發明不限于所用宿主細胞。"控制元件"或"調節序列"是載體的非翻譯區(例如增強子，啟動子以及5'和3'未翻譯區)，其與宿主細胞蛋白相互作用以便進行轉錄和翻譯。所述元件的強度(strength)和特異性不同。根據所用載體系統和宿主，可使用任何數目的適宜轉錄和翻譯元件，包括連續和誘導型啟動子。例如，當在細菌系統中克隆時，可使用誘導型啟動子諸如BLUESCRIPT噬菌粒(phagemid)(Stratagene,LaJolla，Calif.),或者PSP或Tl質粒(GIBCO/BRL)的雜合lacZ啟動子等。桿狀病毒多角體蛋白(polyhedrin)啟動子可用于昆蟲細胞。來自植物細胞基因組(例如，熱休克(heatshock),RUBISCO和儲存蛋白基因(storageproteingene))或來自植物病毒(例如，病毒啟動子或前導序列)的啟動子或增強子可克隆入所述載體。在哺乳動物細胞系統中，來自哺乳動物基因或來自哺乳動物病毒的啟動子是優選的。如果需要產生含有多個拷貝GPR54多肽編碼序列的細胞系，基于SV40或EBV的載體可與適宜的選才奪標記一起使用。在細菌系統中，許多表達載體可根據GPR54多肽的使用意圖選擇。例如，當需要大量GPR54多肽誘導抗體時，可使用指導易純化融合蛋白高水平表達的載體。所述載體包括，但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達載體，諸如BLUESCRIPT(Stratagene)(其中編碼GPR54多肽的序列可與所述載體中編碼氨基末端Met以及隨后的(3-半乳糖苷酶7個殘基的序列在框內相連，從而產生雜合蛋白)，pIN載體(VanHeeke,G.andS.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264:5503-5509)等諸如此類。pGEX載體(Prco，Madison,Wis.)也可用谷胱甘肽S-轉移酶(GST)將外來蛋白表達為融合蛋白。通常，所述融合蛋白是可溶的，并可容易地通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠、然后在游離谷胱甘肽存在下進行洗脫而自溶解的細胞純化。在所述系統中制備的蛋白可設計為包括肝素，凝血酶，或因子XA蛋白酶切割位點，使得感興趣的克隆的多肽可任意從GST部分釋放出來。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，可使用許多含有連續或誘導型啟動子的載體諸如a因子，醇氧化酶和PGH。綜述參見Ausubel(supra)andGrant等(1987;MethodsEnzymol.153:516-544)。如果使用植物表達載體，編碼GPR54多肽的序列的表達可通過多種啟動子之一驅動。例如，病毒啟動子諸如CaMV的35S和19S啟動子可單獨或與TMV的co前導序列聯合使用。(Takamatsu，N.(1987)EMBOJ.6:307-311.)可選，可使用植物啟動子諸如RUBISCO小亞基或熱休克啟動子。(Coruzzi,G,等(1984)EMBOJ.3:1671-1680;Broglie，R.等(1984)Science224:838-843;Winter,J.等(1991)ResultsProbl.CellDiffer.17:85-105.)這些構建體可通過直接DNA轉化或病原體介導的轉染導入植物細胞。所述技術在許多通常可得的綜述中描述。(見，例如，Hobbs，S.orMurry,L.E,inMcGrawHillYearbookofScienceandTechnology(1992)McGrawHill,NewYork,N,Y.;pp.191-196.)昆蟲系統可用于表達GPR54多肽。例如，在一種這樣的系統中，苜蓿4艮纟丈夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus)(AcNPV)用作在Spodopterafrugiperda纟田胞或夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達外來基因的載體。編碼GPR54的序列可克隆入該病毒的非必要區諸如多角體蛋白基因等，并且處于多角體蛋白啟動子的控制下。將GPR54多肽成功插入將使得多角體蛋白基因失活并產生缺乏外殼蛋白的重組病毒。所述重組病毒可用于感染例如，S.fiugEperda細胞或夜蛾幼蟲(GPR54多肽可z在其中表達)。(Engelhard,E.K.等(1994)Proc,Nat.Acad.Sci.91:3224-3227.)哺乳動物宿主細胞中，許多基于病毒的表達系統可利用。如果用腺病毒作為表達載體，編碼GPR54多肽的序列可連入腺病毒轉錄/翻譯復合物，所述復合物由晚期啟動子和三分(tripartite)前導序列組成。插入病毒基因組的非必要E1或E3區可用于獲得有活力的病毒，所述病毒能夠在感染的宿主細胞中表達GPR54多肽。(Logan,J,andT.Shenk(1984)Pro"Natl.Acad.Sci.81:3655-3659.)此外，轉錄增強子諸如勞斯(Rous)肉瘤病毒(RSV)增強子可用于增加在哺乳動物宿主細胞中的表達。DNA片段的DNA片段。構建并通過常規遞送方法遞送(脂質體，多陽離子氨基聚合物或囊泡)約6kb-10Mb的HAC用于治療。具體的起始信號也可更有效翻譯編碼GPR54多肽的序列。這種信號包括ATG起始密碼子以及鄰近的序列。如果編碼GPR54多肽的序列及其起始密碼子和上游序列被插入適宜的表達載體，無需其它轉錄或翻譯控制信號。然而，如果僅插入編碼序列或其一部分，應提供包含ATG起始密碼子的外源翻譯控制信號。此外，起始密碼子應在正確的閱讀框中以保證整個插入序列得以翻:^奪。外源翻:f斧元件和起始密碼子可為各種來源的，天然和合成的。表達的效率可通過將適合所用具體細胞系統的增強子來得以提高，所述增強子如文獻所述。(Scharf,D.等(1994)ResultsProbl.CellDiffer.20:125-162.)。此外，宿主細胞菌抹可根據其調節插入序列的表達以及按照所需方式加工所表達蛋白的能力來選擇。多肽的這種修飾包括，但不限于，乙酰化，羧化，糖基化，磷酸化，脂化和酰化。切割蛋白的"前原(prepro)"形式的翻譯后加工可用于促進正確的插入，折疊和/或功能。為翻譯后活性具有特HeLa,MDCK,HEK293和WI38)可得自美國典型培養物保藏中心(ATCC,Bethesda,Md.)，并可被選擇以保證所述外來蛋白的正確修飾及加工。為長期高產重組蛋白，優選穩定表達。例如，能穩定表達GPR54GPCR的細胞系可利用表達載體轉化，所述表達載體可包含位于相同或分離栽體上的病毒復制起點和/或外源表達元件以及選擇標記。導入所述載體后，細胞可在富集的培養基中生長約1-2天，然后轉移到選擇培養基中。選擇標記的目的是賦予選擇抗性，且其存在允許表達被導入序列的細胞的生長和回收。穩定轉化的細胞的抗性克隆可利用適合所述細胞類型的組織培養技術進行增殖。可利用任何數量的選擇系統來回收轉化的細胞系。所述系統包括但不限于，單純皰滲病毒(herpessimplexvirus)胸苷激酶基因(Wigler,M.等(1977)Cell11:223-32)以及腺。票呤磷酸核糖基轉移酶基因(Lowy，1.等(1980)Cell22:817-23)，所述系統分別可用于tk-或apr-細胞。此外，抗代謝物，抗生素或除莠劑抗性可用作選擇基礎。例如，dhfr賦予對曱氨蝶呤的抗性(Wigler,M.等(1980)Proc.Natl.Acad,Sci.77:3567-70);npt賦予對氨基糖香新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin，R等(1981)J.Mol.Biol.150:1-14);als或pat分別賦予對氯磺隆(chlorsulfUron)和草丁膦(phosphinotricin)乙酰轉移酶的抗性(Murry,見上文)。其它適宜基因也有描述，例如trpB(其允許細胞利用p引咮取代色氨酸)或hisD(其允許細胞利用組氨醇(histinol)取代組氨酸)(Hartman，S.C.andR.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:8047-51.)最近，可利用諸如花青素(anthocyanin)，p-葡糖醛酸酶及其底物GUS，以及螢光素酶及其底物熒光素作為可見標記(visiblemarker)。這些標記不僅可用于鑒定轉化體，也可用于定量具體載體系統的瞬時或穩定蛋白表達量。(Rhodes,C.A.等(1995)MethodsMol.Biol.55:121-131.)盡管標記基因表達的存在/缺失提示目的基因也存在，所述基因的存在和表達需要證實。例如，如果編碼GPR54多肽的序列;故被插入標記基因序列，含GPR54多肽編碼序列的轉化細胞可通過標記基因功能的缺失鑒定。可選，標記基因可與GPR54多肽編碼序列串聯地位于單個啟動子控制下。標記基因對誘導或選擇反應而表達通常表明所述串聯的基因也表達。可選，可通過本領域已知的多種方法鑒定含有GPR54多肽編碼核酸序列并表達GPR54的宿主細胞。這些方法包括，但不限于DNA-DNA或DNA-RNA雜交以及蛋白生物分析(proteinbioassay)和免疫分析(immunoassay)技術，包括基于膜，溶液或芯片的技術來檢測和/或定量核酸或蛋白序列。編碼GPR54多肽的多核苷酸序列的存在可利用探針或片段或編碼GPR54GPCR的多核苷酸片段通過DNA-DNA或DNA-RNA雜交或擴增來檢測。基于核酸擴增的實驗包括利用基于GPR54多肽編碼序列的寡核苷酸或寡聚物來檢測含有編碼GPR54的DNA或RNA的轉化體。多種利用對所述蛋白特異多克隆或單克隆抗體來^H則和測定GPR54表達的方案是本領域已知的。所述技術的實例包括酶聯免疫吸附實驗(ELISA)，放射免疫實驗(RIA)和熒光激活的細胞分選(FACS)。優選兩位點、基于單克隆的免疫實驗，所述實驗利用對GPR54上的兩種非干擾性(non-interfering)表位有反應的單克隆抗體，但可采用竟爭結合實驗。這些和其它實驗是本領域已知的，例如見Hampton,R.等(1990;SerologicalMethodsaLaboratoryManual,SectionIV，APSPress,StPaul，Minn.)andinMaddox，D.E.等(1983;J.Exp.Med.158:1211-1216)。多種標記和結合技術是本領域已知的，并用于多種核酸和氨基酸實驗。制備標記的雜交或PCR探針用于檢測與GPR54的編碼多核苦酸相關序列的方法包括利用標記的多核苷酸進行oligolabding，缺口翻譯(nicktranslation),末端標記(end-labeling)，或PCR擴增。可選，編碼GPR54的序列或其片段可克隆入載體以制備mRNA探針。所述載體是本領域已知、可購得并可用于通過加入適當的RNA聚合酶諸如T7,T3或SP6等以及標記的核苷酸在體外合成RNA探針。這些方法可利用多種可購得的試劑盒進行，例如Pharmacia&Upjohn(Kalamazoo,Mich,),Promega(Madison,Wis.),和U.S.BiochemicalCorp(Cleveland,Ohio)提供的那些。適宜的報道分子或標記可用于簡化檢測，其包括放射性核素(radionuclide)，酶，熒光，化學發光或生色制劑，以及底物，輔因子，抑制物，磁性顆粒等諸如此類。由編碼GPR54的核苷酸序列轉化的宿主細胞可在適宜表達和從細胞培養物回收所述蛋白的條件下培養。轉化的細胞產生的蛋白可位于細胞膜，根據所用序列和/或載體分泌或包含在細胞內。本領域技術人員應理解，含有編碼GPR54的多核苷酸的表達載體可設計為包含信號序列，所述信號序列指導GPR54分泌通過原核或真核細胞膜。其它構建體可用于連接GPR54編碼序列與編碼促進可溶蛋白回收的多肽區的核苷酸序列。所述純化促進區(purificationfacilitatingdomain)包括，-f旦不P艮于，金屬螯合肽諸如允許在固定的金屬上進行純化的組氨酸-色氨酸組件(module)，以及允許在固定的免疫球蛋白上純化的蛋白A區，以及FLAGS延伸/親合純化系統(ImmunexCorp.，Seattle,Wash.)中所用的區。在純化區和GPR54GPCR編碼序列之間包含可切割的接頭序列，諸如對因子XA或腸激酶特異性的接頭(Invitrogen,SanDiego,Calif.)，可用于促進純化。一種這樣的載體使得融合蛋白得以表達，所述融合蛋白含有GPR54和編碼6組氨酸殘基然后是硫氧還蛋白或腸激酶切割位點。所述組氨酸殘基可促進在固定的金屬離子親和層析Ji的純化(IMIAC;describedinPorath,J,等(1992)Prot.Exp.Purif.3:263-281)，而腸激酶切割位點提供從所述融合蛋白純化GPR54的方法。含有融合蛋白的載體的描述見Kroll,D.J.等(1993;DNACellBiol.12:441-453)。GPR54的片段不僅可通過重組制備產生，也可通過利用固相技術的直接肽合成產生(MerrifieldJ.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149-2154.)蛋白合成可通過人工或自動化技術進行。自動化的合成可通過例如使用AppliedBio系統431A肽合成儀(PerkinEhner)進行。GPR54的各種片段可單獨合成然后組合在一起產生全長分子。轉基因動物敲除本發明另一方面提供GPR54敲除哺乳動物，其包含一或多種細胞，其中的GPR54多肽是功能失活的。本發明的GPR54敲除可為GPR54基因或該基因任何一部分的功能破壞的結果，包括使GPR54基因喪失一或多種功能的突變，包括缺失或取代。所述突變體包括單點突變，并靶向GPR54的編碼或非編碼區。優選，所述敲除動物是非人哺乳動物，諸如豬，綿羊或嚙齒動物。最優選所述敲除動物是小鼠或大鼠。所述敲除動物可用于篩選方法中以鑒定GPR54的激動劑和/或拮抗劑，以及檢測其在體內治療疾病的效力。例如，經改造GPR54生成缺陷的敲除動物可用于實驗以鑒定GPR54的激動劑和/或拮抗劑。一種實驗設計為評估可能的藥物(候選配體或化合物)以測定其在缺乏GPR54受體時是否產生生理反應。這可通過將藥物給予上述敲除動物，并檢測所述動物的特定反應來進行。任何生理參數可在該實驗中測定。來自GPR54敲除動物的組織可用于受體結合實驗以測定所述可能的藥物(候選配體或化合物)是否與GPR54受體結合。所述實驗可通過從經改造GPR54生成缺陷的敲除動物獲得第一受體制備物，'并從已知與任何鑒定的GPR54配體或化合物結合的來源獲得第二受體來進行。通常，所述第一和第二受體制備物在除獲得它們的來源以外的所有方面都相似。例如，如果敲除動物(如上文和下文所述)的腦組織用于實驗中，來自正常(野生型)動物的可比(comparable)腦組織可用作第二受體制備物的來源。每種受體制備物都與已知與GPR54受體結合的配體一起、在存在或不存在候選配體或化合物的條件下進行保溫。優選所述候選配體或化合物可在不同濃度檢測。測定第一和第二受體制備物與已知配體的結合被檢驗化合物取代的程度。來自敲除動物的組織可直接用于實驗，或所述組織可經過加工成為分離的膜或膜蛋白(其本身可用于實驗)。優選的敲除動物是小鼠。配體可用任何與結合實驗相容的方法標記。這可包括，但不限于，放射活性，酶，熒光或化學發光標記(以及下文所迷其它標記技術)。此外，GPR54受體的拮抗劑可通過將候選化合物等給藥表達功能性GPR54的野生型動物，以及鑒定為顯示任何與GPR54受體功能表達的降低或消除相關的表型特征的動物來鑒定。產生非人敲除動物的詳細方法在下文描述。轉基因構建體可導入動物的種系以產生敲除哺乳動物。例如，一或數個拷貝的構建體可通過標準轉基因技術摻入哺乳動物胚胎基因組中。一個示例性實施方案中，本發明敲除非人動物通過將轉基因導入非人動物的種系制備。各個發育階段的胚胎靶細胞可用于導入轉基因。根據胚胎輩巴細胞的發育階段利用不同方法。用于實踐本發明的任何動物的具體的系(line)可根據總體健康良好，胚胎產量良好，胚胎中原核可見性良好以及生殖健康狀況良好來選擇。此外，單倍體是明顯的因素。將轉基因導入胚胎可通過本領域已知的任何方法進行，諸如微量注射(microinjection),電穿孔，或脂質轉染。例如，GPR54受體轉基因可通過將所述構建體微量注入受精的哺乳動物卵的原核中，從而使一或多個拷貝的構建體保持在發育動物的細胞中。將所述轉基因構建體導入受精卵中以后，所述卵可在體外保溫不同時間，和/或再植入代理宿主(surrogatehost)。體外保溫到成熟是本領域已知的。一種常用方法是將胚胎在體外保溫約1-7天(根據種類而不同)，然后將所述胚胎再植入代理宿主。可通過對組織部分進行Southern印跡分析，來檢測經轉基因操作的胚胎的后代中的所述構建體的存在。如果一或多個拷貝的外源克隆的構建體保持穩定整合在所述敲除胚胎的基因組中，可建立攜帶以轉基因方式加入的構建體的永久性敲除哺乳動物系。敲除改變哺乳動物的同窩幼仔出生后，可測定所述構建體摻入所述后代基因組中的情況。優選，該實驗通過將對應編碼所需重組蛋白產物或其片段的DNA序列的探針與所述后代的染色體物質進行雜交來進行。使基因組中含有至少一個拷貝的構建體的哺乳動物后代成長到成熟。為本發明的目的，合子(zygote)基本上是形成的二倍體細胞，其能發育成完整生物體。通常，所述合子包含有核的卵，所述核可通過將來自相同或不同配子的兩個單倍體核融合而天然或人工形成。因此，所述配子的核一定是天然相容的，即其產生能經過分化并發育成有功能的生物體的可存活合子。通常，優選整倍體合子。如果獲得非整倍體合子，根據配子所來源生物體的整倍體數目，染色體數目變化不能超過一個。此外，類似的生物考慮，物理因素也影響(govern)外源遺傳物質的量(體積)，所述外源遺傳物質可加入該合子的核或形成該合子核的一部分的遺傳物質。如果沒有遺傳物質被去除，可加入的外源遺傳物質量受到可被吸收而不會被物理因素破壞的量的限制。通常外源遺傳物質日不超過約IO皮升(picoliter)。加入的物理影響不能大到物理破壞所述合子的存活力。DNA序而變化，并且對于本領域技術人員而言是顯而易見的，這是由于所得合子的遺傳物質(包括所述外源性遺傳物質)必須在生物學上能夠起始并保持所述合子分化并發育成有功能的生物體。加入合子的轉基因構建體拷貝數目有賴于加入的外源遺傳物質總量，并且將是能夠使遺傳轉化成為可能的量。理論上，僅需一個拷貝；然而通常利用多個拷貝，例如，1,000-20,000拷貝的轉基因構建體，以保證一個拷貝有功能。對于本發明，每個插入的外源DNA序列有一個以上功能型拷貝以改善外源DNA序列的表型表達通常是有利的。任何允許將外源遺傳物質加入到細胞核遺傳物質中的技術均可用，只要其不破壞細胞、核膜或已有的細胞或遺傳結構。外源遺傳物質優選通過微量注射進入核酸遺傳物質。細胞和細胞結構的顯微注射是本領域已知的。再植入通過標準方法實現。通常，對代理宿主進行麻醉，并將胚胎插入其輸卵管。植入具體宿主的胚胎數目根據種類而不同，但通常與該宿主自然產生的后代數相似。可通過任何適宜方法篩選代理宿主的敲除后代中轉基因的存在和/或表達。篩選通常利用與至少部分轉基因互補的探針、通過Southern印跡或Northern印跡分析來進行。利用轉基因所編碼蛋白的抗體進行的Western印跡分析可用作篩選轉基因產物存在的可選或其他方法。通常DNA自尾組織制備，并通過Southern分析或PCR分析所述轉基因。可選，利用Southern分析或PCR檢測據信表達高水平轉基因的組織或細胞中轉基因的存在和表達，但任何組織或細胞類型均可用于該分析。評估轉基因存在的可選或其它方法包括，但不限于適宜的生化實驗，如酶和/或免疫實驗，具體標記物或酶活性的組織染色，流式細胞分析等。血液分析也可以用于檢測轉基因產物在血液中的存在，以及評價所述轉基因對各種類型血細胞和其他血液成分的水平的影響。逆轉錄病毒感染也可用于將轉基因導入非人動物。正在發育的非人胚胎也可在體外培養到胚泡(blastocyst)階段。該過程中，分裂球是逆轉錄病毒感染的靶(Jaenich,R.(1976)PNAS73:1260-1264)。分裂球的有效感染通過酶處理去除透明帶(zonapellucida)實現(ManipulatingthemiceEmbryo,Hoganeds.(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,1986)。用于導入轉基因的逆轉錄載體系統通常為攜帶該轉基因的復制缺陷型逆轉錄病毒(Jahner等(1985)PNAS82:6927-6931;VanderPutten等(1985)PNAS82:6148-6152)。轉染通過在單層產病毒細胞(vims-producingcell)上培養分裂球容易且有效地實現(VanderPutten,supra;Stewart等(1987)EMBOJ.6:383-388)。可選，感染可在以后的階段進行。病毒或產病毒細胞可注入嚢胚腔(blastocoele)(Jahner等(1982)Nature298:623-628)。大多數建立者(founder)對轉基因而言是嵌合的，這是由于摻入(incorporation)僅在部分形成轉基因非人動物的細胞中出現。此外，建立者基因組中的不同位置可含有轉基因的各種逆轉錄病毒插入物，其通常在后代分離。此外，還可對孕期中的胚月臺(midgestationembryo)進行子宮內逆轉錄病毒感染，來將轉基因導入種系(Jahner等(1982)，見上文)。轉基因導入的第三種類型的靶細胞是胚胎干細胞(ES)。ES細胞自植入前體外培養的胚胎獲得，并與胚胎融合(Evans等(1981)Nature292:154-156;Bradley等(1984)Nature309:255-258;Gossler等(1986)PNAS83:9065-9069;Robertson等(1986)Nature322:445-448)。轉基因可有效通過DNA轉染或逆轉錄病毒介導的轉導導入ES細胞。所述轉化的ES細胞隨后可與來自非人動物的胚泡結合(combine)。所述ES細胞隨后在胚胎建群并有成為產生嵌合動物的種系。參見Jaenisch，R.(1988)Science240:1468-1474.本發明還涉及用于功能破壞宿主細胞的GPR54基因的核酸構建體。該核酸構建體包括(a)非-同源置換部分(non-homologousreplacementportion);(b)位于所述非-同源置換部分上游的第一同源區；所述第一同源區具有與第一GPR54基因序列基本相同的核苷酸序列；和(c)位于所述非-同源置部分下游的第二同源區，所述第二同源區具有與第二GPR54基因序列基本相同的核苷酸序列，所述第二GPR54基因位于天然存在的內源GPR54基因中所述第一GPR54基因序列的下游。此外，當所述核酸分子被導入宿主細胞時，第一和第二同源區應足夠長，以進行核酸構建體與宿主細胞中的內源GPR54基因進行同源重組。優選實施方案中，所述非-同源置換部分包含表達報道物，優選包括lacZ和陽性選擇表達盒，優選包含可操作連接于調節元件的新霉素磷酸轉移酶基因。GPR54GPCR缺陷的轉基因動物可如下產生(a)構建體GPR54基因把向型載體(targetingvector)鼠GPR54基因組克隆分離自利用探針序列獲自HGMP(Hinxton,UK)的小鼠大插入子(mouselargeinsert)PAC文庫，所述文庫為利用標準技術自部分預測的鼠可讀框cDNA序列(SEQIDNO:4)擴增的。分離的鼠GPR54基因組克隆隨后利用小寡核苷酸探針和標準技術通過限制酶切作圖(restrictionmapped)在GPR54基因的區域中。對鼠基因組基因座進行部分測序，以使得可設計用于克隆入靶向型載體中的同源臂。通常為l-5kb的DNA的兩個區(從將被缺失的可讀框區域的任何一側起)稱為5'和3'同源臂，其通過PCR擴增且所述片段被克隆入靶向型載體。這些臂的位置選擇使得同源重組事件將通過缺失至少7個跨膜區而功能性破壞GPR54基因。靶向型載體被制備成其中缺失的GPR54序列被非-同源序列取代，所述非-同源序列包含選擇盒(selectioncassette)上游的內源基因表達報道物(不依賴框(frameindependent)的lacZ基因)，其由啟動的(promoted)新霉素磷酸轉移酶(neo)基因組成，所述基因的方向與GPR54基因一樣。(b)胚胎干細胞的轉染和分析胚胎干細胞(EvansandKaufman,1981)在新霉素抗性胚胎成纖維細胞培養基支持層(feederlayer)上培養、在Dulbecco's改良的Eagles培養基中生長，所述培養基補充了20%胎牛血清，10%新生牛血清，2mM谷氨酰胺，非必需氨基酸，100uM2-巰基乙醇和500u/ml白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor)。每天更換培養基，并每3天對ES細胞進行傳代。5xl06ES細胞用5jug線性化的質粒通過電穿孔(25jaF電容和400伏特)進行轉染。電穿孔24小時后，轉染的細胞在含200Mg/ml新霉素的培養基中培養9天。將克隆轉移至96孔板，復制并擴增，然后通過PCR鑒定其中內源GPR54基因與靶向型構建體發生同源重組的克隆。陽性克隆比例通常為1-5%。擴增這些克隆，以便允許復制體被冷凍并且制備足夠高質量的DNA用于通過Southern印跡利用外部5'和3'探針確定靶向事件(targetingevent),所述過程均使用標準技術(Russ等，2000,Nature2000Mar2;404(6773):95-9)。(c)GPRM缺陷小鼠的產生C57BL/6雌性和雄性小鼠進行交配，并在懷孕3.5天時分離胚泡。每個胚泡中注入來自選定克隆的10-12個細胞，并將7-8胚泡植入假孕Fl雌性小鼠子宮。同窩嵌合幼鼠出生時含較高水平(達100。/。)的有花紋雄鼠(agoutimales)(花紋外皮顏色表明被靶向的克隆的后代細胞的作用)。雄性嵌合體與雌性和MF1以及129小鼠交配，分別通過花紋外皮顏色和PCR基因型分析確定種系4專遞(germlinetransmission)。其它非人類轉基因動物本發明還涉及非人轉基因動物，其導致GPR54受體過表達或所述受體低表達(與適宜對照相比)。所述動物可用于鑒定受體功能的激動劑和拮抗劑(也可用于治療)。抗體本文的抗體可用作GPR54多肽的激動劑或拮抗劑。為本發明目的，除非特別說明，術語"抗體"包括但不限于，多克隆，單克隆，嵌合，單鏈，Fab片段和通過Fab表達文庫產生的片段。所述片段包括完整抗體的片段(其保持與靶物質結合的活性)，Fv,F(ab')和F(ab')2片段，以及單鏈抗體(scFv)，融合蛋白以及包含抗體的抗原結合位點的其它合成蛋白。抗體及其片段可為人源化抗體，例如EP-A-239400所述。此外，可使用具有完整人可變區的抗體(或其片段)，例如美國專利5,545,807和6,075,181所述。中和抗體，即抑制所述物質氨基酸序列的生物活性的抗體，具體優選用于診斷和治療。抗體可通過標準:技術制備，諸如通過免疫(immunization)或利用嗟菌體展示文庫。本發明的多肽或肽可用于通過已知技術制備抗體。所述抗體可與GPR54蛋白或其同源物、片段等特異性結合。如需要多克隆抗體，選定的哺乳動物(例如，小鼠，兔，山羊，馬等)可用免疫原性組合物免疫，所述組合物包括本發明的多肽或肽。根據宿主種類可利用多種佐劑來增強免疫反應。所述佐劑包括，但不限于，Freund's，礦物鹽凝膠諸如氫氧化鋁，以及表面活性物質諸如溶血卵磷脂，聚醚多羥基化合物(pluronicpolyol),聚陰離子，肽，油乳液，匙孔血藍蛋白(keyholelimpethemocyanin)禾口二》肖基酚。BCG(BacilliCalmette-Guerin)和少豆小才奉^if菌(Corynebacteriumparvum)是可能有用的人佐劑，如果所述物質氨基酸序列給藥免疫受損(compromised)的個體以刺激系統防御時可使用所述佐劑。根據已知方法收集來自免疫的動物的血清并進行處理。如可獲自本發明多肽的、含有抗表位多克隆抗體的血清含有其它抗原的抗體，所述多克隆抗體可通過免疫親和層析純化。用于制備并加工多克隆抗血清的技術是本領域已知的。為制備所述抗體，本發明還提供本發明的氨基酸序列或其片段，其對用作動物或人的免疫原的其它氨基酸序列是半抗原化的(haptenised》抗表位的單克隆抗體可由本領域技術人員輕易制備，所述表位可獲自本發明的多肽或肽。通過雜交瘤制備單克隆抗體的常用方法已知。不朽的(immortal)產抗體細胞系可通過細胞融合以及其它技術制備，所述其它技術諸如用致癌(oncogenic)DNA直接轉化B淋巴細胞，或用EB病毒進行轉染。可篩選針對眼眶(orbit)表位制備的所有單克隆抗體的各種性質，諸如對于同種型和表位的親和力。單克隆抗體可通過任何可通過連續細胞系培養制備抗體分子的方法制備。這些技術包括，但不限于KoehlerandMilstein(1975Nature256:495-497)的雜交瘤技術，trioma^支術，人B細月包雜叉瘤4支術(Kosbor等(1983)ImmunolToday4:72;Cote等(1983)ProcNatlAcadSci80:2026-2030)以及EBV-雜交瘤技術(Cole等,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,pp.77-96,AlanR.Liss,Inc"1985)。此外，可使用為制備嵌合抗體發展的技術，如將小鼠抗體基因與人抗體基因進行拼接以獲得具有適宜抗原特異性和生物活性的分子的技術(Morrison等(1984)ProcNatlAcadSci81:6851-6855;Neuberger等(1984)Nature312:604-608;Takeda等(1985)Nature314:452-454)。可選，用于制備單鏈抗體(美國專利4,946,779)的技術可用于制備物質特異性單鏈抗體。針對獲自本發明多肽或肽的表位的單克隆和多克隆抗體尤其可用于診斷，且其中的中和型抗體可用在被動免疫治療中。具體地單克隆抗體可用于激發抗-獨特型抗體。抗-獨特型抗體是攜帶物質"內部圖像(intemalimage)"和/或需要防止其攻擊的試劑的免疫球蛋白。用于激發抗獨特型抗體的技術在本領域已知。這些抗獨特型抗體也可用于治療。抗體也可通過在淋巴細胞群誘導體內產生或通過篩選重組免疫球蛋白文庫或全部高特異性結合試劑來制備，如Orlandi等(1989,ProcNatlAcadSci86:3833-3837),andWinterGandMilsteinC(1991;Nature349:293畫299)所述。也可產生含有多肽或肽的特異性結合位點的抗體片段。例如，所述片段包括，但不限于F(ab')2片段(其可通過用胃蛋白酶消化抗體分子制備)，和Fab片段(其可通過還原F(ab')2片段的二硫橋制備)。可選，可構建Fab表達文庫以允許快速容易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段(HuseWD等(1989)Science256:1275-1281)。用于制備單鏈抗體的技術(美國專利4，946，778)可用于制備本發明多肽的單鏈抗體。同樣，轉基因小鼠或其它生物體包括其它哺乳動物可用于表達人源化抗體。因此，本發明人認為GPR54抗體或包含它們的組合物尤其可用于治療神經性，生殖激素相關的和一些其它疾病。所述神經疾病包括但不限于以下一或多種疾病阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病或癲癇.所述生殖激素相關的疾病包括下組的一或多種生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳，骨質疏+>/骨硬化病或停經。此外，GPR54激動劑或拮抗劑可用于激素替代治療(HRT)。其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖。診斷實驗本發明另一方面提供診斷選自下組的疾病的方法阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳，骨質疏松/骨硬化病，停經，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖，所述方法包括以下步驟(a)從待診斷的患者中選出細胞樣品，(b)比較所述細胞樣品與來自健康個體的一或多個對照樣品的GPR54多肽表達水平和/或功能活性。本發明還涉及GPR54多核苷酸，編碼GPR54肽配體的多核苷酸和多肽(以及其同源物，變體和衍生物)在診斷試劑和基因分析中的用途。與能夠和GPR54核酸(包括同源物，變體及衍生物)互補或能與其雜交的核酸，以及抗GPR54多肽以及GPR54配體多肽的抗體也可用于所述實^^。GPR54基因突變形式、metastin基因或與功能不良相關的其它天然配體基因的檢測可提供診斷工具，其可添加或限定疾病或疾病易感性的診斷，所述疾病是GPR54或其天然配體的表達過低，超量表達或表達改變的結果。可通過各種技術在DNA水平4全測攜帶GPR54基因(包括對照序列)中突變的個體。例如，DNA可分離自患者并測定GPR54或metastinDNA多態性模式。所述鑒定的模式可與對照患者比較，已知所述對照患者患有與GPR54或metastin表達過低，超量表達或表達異常相關的疾病。表達與GPR54或metastin相關疾病的遺傳多態性的患者可由此鑒定。GPR54或metastin的基因分析可通過本領域任何已知技術進行。例如，個體可通過RFLP或SNP分析等測定GPR54或metastin等位基因的DNA序列來篩選。通過檢測GPR54或metastin的基因序列或控制其表達的任何序列中的DNA多態性存在，可將患者鑒定為具有患與GPR54或metastin表達過低，超量表達或表達異常相關的疾病的遺傳傾向。可治療或預防如此鑒定的患者的GPR54或metastin相關疾病，或更進一步在GPR54或metastin相關疾病的早期治療，以防止所述疾病的進一步發展。GPR54或metastin相關疾病包括阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳，骨質疏松/骨硬化病，停經，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥。優選實施方案中，GPR54或metastin相關疾病包括阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳，骨質疏松/骨硬化病，停經，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖。優選，所述疾病涉及性類固醇激素軸(sexsteroidhormonalaxis)調節。本發明還涉及試劑盒，其用于鑒定患者GPR54或metastin相關疾病的遺傳多態性模式。所述試劑盒包含DNA樣品收集裝置，以及測定遺傳多態性模式的裝置，其可與對照樣品比較來確定患者對GPR54或metastin相關疾病的易感性。診斷GPR54或metastin相關疾病的試劑盒包含GPR54或metastin多肽和/或所述多肽(或其片段)的抗體。診斷用核酸可獲自受試者細胞，諸如來自血，尿，唾液組織活檢或尸;險的物質。在優選實施方案中，所述DNA可獲自收集在吸收紙上的患者指血的血細胞。另一優選實施方案中，所述血液收集在AmpliCard.TM.(UniversityofSheffield,DepartmentofMedicineandPharmacology,RoyalHallamshireHospital,Sheffield,EnglandSlO2JF)。所述DNA可直接用于檢測或用PCR或其它擴增技術進行酶促擴增，然后進行分析。可制備目的基因中靶向特異性多態性DNA區的寡核苷酸DNA引物，使得在PCR反應中實現靶序列的擴增。RNA或cDNA也可以相似方式用作模板。從模板DNA擴增的DNA序列可利用限制酶分析，以確定擴增的序列的遺傳多態性，并由此提供患者的遺傳多態性圖譜。限制片段長度可通過凝膠分析確定。可可選或聯合地使用諸如SNP(單核苷酸多態性)分析等技術。缺失和插入可通過擴增產物與正常基因型相比而言的大小改變來檢測。點突變可通過使擴增的DNA與標記的GPR54或metasin核苷酸序列的雜交來鑒定。優選匹配的序列可通過RNase消化或解鏈溫度差異來與未配對的雙鏈體區分。DNA序列差異也可通過DNA片段在凝膠(可包含或不包含變性劑)中電泳遷移率的改變，或通過直接DNA測序來檢測。見例如,Myers等，Science(1985)230:1242。具體位置的序列改變也可通過核酸酶保護實驗(nucleaseprotectionassay)諸如RNase和SI保護或化學切割法顯示。見Cotton等，ProcNatlAcadSciUSA(1985)85:4397-4401。另一實施方案中，可構建包含GPR54或metastin核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探針的陣列，以有效篩選例如基因突變。陣列技術法是已知并常用的，可用于說明分子遺傳學中的多種問題，包括基因表達，基因連接以及基因多樣性(見例如M.Cheeetal.,Science,Vol274，pp610-613(1996))。單鏈構型多態性(SSCP)可用于檢測突變體和野生型核酸之間的電泳遷移率差異(Orita等(1989)ProcNatl.Acad.SciUSA:86:2766,seealsoCotton(1993)MutatRes285:125-144;andHayashi(1992)GenetAnalTechAppl9:73-79)。樣品和對照GPR54或metastin核酸的單鏈DNA片段可變性并允許其復性。單鏈核酸的二級結構根據序列而不同，產生的電泳遷移率改變可用于檢測單個堿基改變。DNA片段可被標記或用標記的探針檢測。所述實驗的敏感性可通過利用RNA(而不是DNA)來增強，其中的二級結構對序列改變更敏感。在優選實施方案中，目的(subject)方法利用異源雙鏈分析基于電泳遷移率分離雙鏈異源復合體分子(Keen等(1991)TrendsGenet7:5)。診斷實驗提供診斷或確定對以下疾病的敏感性的方法感染諸如病毒，真菌，原核生物和病毒感染、尤其是HIV-1或HIV-2的感染；疼痛；癌癥；糖尿病；肥胖；厭食；貪食(bulimia);哮喘；帕金森氏癥；血栓形成(thrombosis);急性心衰，4氐血壓；高血壓；P曰痿(erectiledysfunction);尿潴留(urinaryretention);代謝性骨病諸如骨質疏松和骨硬化病；心絞痛；心肌梗塞；潰瘍；哮喘；過敏；類風濕性關節炎；炎性腸病；腸易激綜合征；良性前列腺肥大以及精神和神經性疾病，包括焦慮(anxiety),精神分裂(schizophrenia),狂燥型抑郁(manicdepression),譫妄(delirium),癡呆(dementia),嚴重4青4申遲纟爰和運動功能障石孚(severementalretardationanddyskinesia),諸如亨廷頓(Huntington)氏病或GillesdelaTourett's綜合征，可通過所述方法檢測GPR54或metastin基因中的突變。在具體優選的實施方案中，所述診斷試驗用于診斷或治療對阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳,骨質疏松/骨硬化病，停經，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖的易感性。優選，所述疾病涉及調節性類固醇激素軸。可沖全測樣品中GPR54或metastin多肽和核酸的存在。因此，上述感染和疾病可通過以下方法診斷，所述方法包括測定來自個體的樣品中異常降低或增加的GPR54或metastin多肽或者GPR54或metastinmRNA水平。所述樣品可包含來自患有或易患與增加，降低或異常GPR54或metastin表達相關疾病的生物體的細胞或組織，包括表達水平或模式的空間性或暫時性改變。患有或易患所述疾病的生物體中的GPR54或metastin的表達水平或模式可通過與正常生物體中的所述表達水平或模式比較作為疾病診斷方法。因此，通常本發明包括檢測樣品中核酸存在的方法，所述核酸包含GPR54或metastin核酸，所述方法通過將所述樣品與至少一種對所述核酸特異的核酸探針接觸，并監測該樣品中所述核酸的存在來進行。例如，所述核酸探針可特異性結合于GPR54或metastin核酸或其一部分，并檢測兩者的結合；所述復合物本身的存在也可被檢測。此外，本發明包括檢測GPR54或metastin多肽的方法，所述方法通過將細胞樣品與能結合所述多肽的抗體接觸，并檢測該樣品中所述多肽的存在來進行。這可通過監測所述抗體和多肽之間的復合物形成，或監測所述多肽與抗體的結合方便地實現。檢測兩種實體之間的結合的方法在本領域已知，并包括FRET(熒光共振能量專爭移(fluorescenceresonanceenergytransfer)),表面月包質團共振(surfaceplasmonresonance)等。降低或增加的表達可利用本領域已知任何用于定量多核苷酸的方法在RNA水平測定，所述方法諸如PCR,RT-PCR，RNase保護，Northern印跡和其它雜交法。可用于測定宿主樣品中蛋白如GPR54或metastin水平的實驗技術是本領域技術人員已知的。所述實驗方法包括放射免疫實驗，竟爭結合實驗，Western印跡分析和ELIA實驗。本發明涉及用于診斷以下任意疾病或對以下任意疾病的易感性的診斷試劑盒阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳，骨質疏松/骨硬化病，停經，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥或肥胖。優選，所述疾病涉及性類固醇激素軸的調節。用具體優選的診斷試劑盒來診斷以下疾病或對以下任意疾病的易感性阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病和癲癇，生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳,骨質疏松/骨硬化病，停經，肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥或肥胖。優選，所述疾病涉及性類固醇激素軸的調節。所述診斷試劑盒包含GPR54或metastin多核苷酸或其片段；互補核苷酸序列；GPR54或metastin多肽或其片段，或抗GPR54或metastin多肽的抗體。預防和治療方法
技術領域：
：本發明提供治療與GPR54多肽活性過高或不足相關的異常疾病的方法，且GPR54多肽，其結合蛋白和/或編碼它們的核酸具體可用于治療神經性，生殖激素相關的和一些其它疾病。所述神經疾病包括但不限于一或多種選自下組的疾病阿爾茨海默氏癥，感覺神經元病或癲癇。所述生殖激素相關的疾病包括選自下組疾病的一或多種疾病生育力、性欲和青春期開始的調節，泌乳，骨質疏松/骨硬化病或停經。此外，GPR54激動劑或拮抗劑可用于激素替代治療(HRT)。其它疾病包括肌肉消耗性疾病，疼痛，激素依賴性癌癥和肥胖。如果GPR54活性過高，可采用多種方法。一種方法包括給藥受試者有效抑制活化的量的本文上述的抑制性化合物(拮抗劑)以及可藥用載體，其通過阻斷配體與GPR54的結合，或通過抑制第二信號從而緩解所述異常疾病。另一方法中，可給藥仍能與內源GPR54竟爭結合配體的可溶形式的GPR54多肽。這種竟爭物的常見實施方案包括GPR54多肽的片段。另一方法中，內源GPR54多肽編碼基因的表達可利用表達阻斷技術抑制。已知的這種技術涉及利用反義序列，所述反義序列可內部產生或分別給藥。見例如O'Connor,JNeurochem(1991)56:560inOligodeoxynucleotidesasAntisenseInhibitorsof基因Expression,CRCPress,Bocaraton，Fla.(1988).可選可提供與所述基因形成三螺旋的寡核苷酸。見，例如，Lee等，NucleicAcidsRes(1979)6:3073;Cooney等，Science(1988)241:456;Dervan等，Science(1991)251:1360。這些組合物可按原樣給藥或相關寡聚物可在體內表達。為治療GPR54或其活性低表達相關的異常疾病，可采用多種方法。一種方法包括給藥受體治療有效量的化合物與可藥用載體，所述化合物類似配體結合的GPR54(即上述激動劑)，從而緩解所述異常疾病。可選，可用基因治療以通過受試者中的相關細胞內源性產生GPR54。例如，本發明的多核苷酸可經改造以表達如上所述的復制缺陷的逆轉錄病毒載體。所述逆轉錄病毒表達構建體可隨后被分離并導入包裝細胞(packagingcell),所述包裝細胞用含有編碼本發明多肽的RNAd的逆轉錄病毒質粒載體轉導，使得所述包裝細胞可產生含有目的基因的感染性病毒顆粒。可將這些制備型細胞(producercdl)給藥受試者，以在體內改造細胞并在體內表達所述多肽。基因治療的綜述參見Chapter20,GeneTherapyandotherMolecularGenetic-basedTherapeuticApproaches,(andreferencescitedtherein)inHumanMolecular基Genetics,TStrachanandAPRead,BIOSScientificPublishersLtd(1996)。配制和給藥肽諸如GPR54多肽的可溶形式，以及激動劑和拮抗劑肽或小分子可與適宜的藥用載體配制在一起。所述配制劑包含治療有效量的所述多肽或化合物以及可藥用的載體或賦形劑。所述載體包括但不限于鹽水，緩沖的鹽水，右旋糖，水，甘油，乙醇及其組合物。配制劑應適合給藥，并且是本領域技術人員已知的。本發明還涉及藥物包和試劑盒，其包含一或多種容器，所述容器中充滿本發明前述組合物的一或多種成分。本發明的多肽和其它化合物可單獨使用或與其它化合物諸如治療性化合物聯用。所述藥物組合物系統給藥的優選形式包括注射，通常經靜脈內注射。可使用其它注射途徑，諸如經皮下，肌肉內或腹腔內。系統給藥的其它方式包括經粘膜(transmucosal)和經皮(transdermal)給藥，利用穿透劑(penetrant)諸如膽鹽或梭鏈孢酸(FusidicAcid)或其它清潔劑。此外，如果適當地配制成腸溶或包嚢化的制劑，也可口服給藥。這些化合物也可經局部(topical)和/或局部化(localize)，以藥膏(saWe),膏劑(paste)，凝膠等形式給藥。所需劑量范圍有賴于所選肽，給藥途徑，配制劑性質，以及受試者疾病的性質，以及主治醫師判斷。適宜的劑量為0.1-100ug/kg受體。預期所需劑量范圍可變化較大，這是由于可獲得各種化合物并且各種給藥途徑的效率不同。例如預期口服給藥需要的劑量高于靜脈內注射。這些劑量水平的差異可利用優化的標準經驗途徑調節，這也是本領域已知的。用于治療的多肽也可在受體內源中，在如上所述通常稱為"基因治療"的藥征(modality)中產生。因此，例如來自受體的細胞可用在離體條件下編碼多肽的多核普酸諸如DNA或RNA以及例如通過利用逆轉錄病毒質粒載體進行改造。所述細胞隨后被導入受試者。藥物組合物本發明還提供藥物組合物，包括給藥治療有效量的本發明GPR54多肽，其結合分子或編碼它們的核酸分子，以及可選的可藥用載體、稀釋劑或賦形劑(包括其組合)。所述藥物組合物在人和獸醫醫學中可用于人和動物，并將通常包括任何一或多種可藥用稀釋劑、載體或賦形劑。可用于治療的載體和稀釋劑在藥學4貞；或已^口，^口Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)所述。藥用載體、賦形劑或稀釋劑可根據給藥途徑以及標準藥物實踐選擇。所述藥物組合物可包含載體、賦形劑或稀釋劑，任何適宜的粘合劑、潤滑劑、懸浮劑、包被劑(coatingagent)、增溶劑等。防腐劑，穩定劑，染料甚至調味劑可用于本發明藥物組合物。防腐劑實例包括苯曱酸鈉(sodiumbenzoate),山梨酸(sorbicacid)以及對羥苯甲酸的酯。還可使用抗氧化劑和懸浮劑。不同遞送系統需要不同組合物/配制劑。例如，本發明的藥物組合物可配制成利用微型泵(mini-pump)或通過粘膜途徑遞送(例如作為噴鼻劑或氣溶膠以便吸入)或可攝取的溶液，或經胃腸外(其中所述組合物配制稱可注射形式用于通過例如經靜脈內，肌肉內或皮下遞送)。可選，所述配制劑可設計成通過所述兩種途徑遞送。當所述制劑通過胃腸道粘膜而經粘膜遞送時，其在通過胃腸道時應保持穩定；例如，其應抵抗蛋白水解，在酸性pH穩定并抵抗膽汁的清潔作用。適宜的藥物組合物可通過如下方式給藥經吸入，以栓劑或陰道栓劑(pessary)的形式，以洗液、溶液、乳膏、油膏或細粉(dustingpowder)的形式，通過利用貼皮劑(skinpatch),以含有賦形劑諸如淀粉或乳糖的片劑形式口服，或在膠嚢或卵形嚢(ovule)中單獨或與賦形劑一起，或以含有調味或著色劑的的酏劑、溶液或混懸液的形式，或經胃腸外諸如，例如經靜脈內，肌肉內或皮下注射。對于胃腸外給藥，所述組合物最好為無菌含水溶液的形式，所述溶液可含有其它物質，諸如足夠的鹽或單糖，使得所述溶液與血液等張。對于經口含(buccal)或舌下給藥，所述組合物可以以常用方式配制的片劑或錠劑形式給藥。給藥通常，醫師決定適合個體受試者的實際劑量，且所述劑量隨年齡、體重或具體患者的反應變化。所述劑量低于示例性平均情況。當然可有優選高于或低于所述范圍的劑量個別情況。本發明藥物組合物可通過直接注射給藥。所述組合物可配制成經胃腸外，經粘膜，經肌肉內，經靜脈內，經皮下，經耳內(intraocular)或經皮給藥。通常，每種蛋白的給藥劑量為0.01-30mg/kg體重，優選0.1-10mg/kg，更優選0.1-1mg/kg體重.術語"給藥的"包括通過病毒或非病毒技術遞送。病毒遞送機制包括但不限于腺病毒載體，腺伴隨病毒(AAV)載體，皰滲病毒載體，逆轉錄病毒載體，慢病毒載體和桿狀病毒載體。非病毒遞送基質包括，脂質介導的轉染，脂質體，免疫脂質體(immunoliposome)，脂質轉染，陽離子表面兩親物(cationicfacialamphiphil)及其組合。這種遞送機制的途徑包括但不限于經粘膜，經鼻，口服，經胃腸外，經胃腸道，經局部或經舌下途徑。術語"給藥的"包括但不限于通過粘膜途徑遞送，例如作為噴鼻劑或氣溶膠用于吸入或作為可攝取的溶液；胃腸外途徑，其通過可注射的形式諸如經靜脈內、肌肉內或皮下途徑遞送。術語"共同給藥的(co-administered)"指每種例如本發明的多肽和其它實體諸如佐劑的給藥位點和時間使得可實現對免疫系統的必要調節。因此，雖然可將所述多肽和佐劑同時給藥同一位點時，但優選在不同時間和位點給藥所述多肽和佐劑。所述多肽和佐劑甚至可在同一遞送載體內給藥，且所述多肽和抗原可為偶聯和/或非偶聯和/或基因偶聯/或非偶聯的。所述多肽、多核苦酸、肽、核苷酸以及可選佐劑可作為單一劑量或多個劑量分開或共同給藥宿主受體。本發明的藥物組合物可通過多種不同途徑給藥，諸如注射(包括經胃腸外，經皮下和經肌肉內注射)，經鼻內、粘膜內、經口服、經陰道內、經尿道內或經耳給藥。本發明的藥物組合物可常規通過注射例如通過皮下或肌肉內而經胃腸外給藥。適合其它給藥方式的其它配制劑包括栓劑，以及一些情況下的口服制劑。對于栓劑，常用粘合劑和載體可包括，例如，聚乙二醇或三甘油酯；所述栓劑可以由有0.5%-10%或1%-2%的性組分的混合物形成。口服制劑包括諸如通常采用的賦形劑，例如藥用級甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素，碳酸鎂等。所述組合物可為溶液，混懸液，片劑，丸，膠囊，持續釋放的配制劑或粉末，并含有10%-95%,優選25%-70%的活性成分。當疫苗組合物為凍干的時，凍干的物質可在給藥前溶解，例如溶解為混懸液。溶解優選在緩沖液中進行。本發明將根據實施例進行具體說明，所述實施例不應理解為對本發明的限制。實施例實施例1.轉基因GPR54敲除小鼠構件靶向GPR54基因的載體鼠GPR54基因通過生物信息學方法(bioinformatically)鑒定，并發現其位于來自PAC文庫的10.3kb基因組片段組中。進一步生物信息學研究將該片段組擴大到28kb。該片段組提供足夠的側翼序列信息，使得可設計同源臂以便克隆入靶向型載體(所用靶向載體的結構，包括相關限制位點顯示在圖3)。鼠GPR54基因有五個編碼型外顯子。靶向策略設計為去除7tm編碼區前的部分第一夕卜顯子和第二含7tm的夕卜顯子(second7tm-containingexon)的大部分。側接待缺失的含7tm的外顯子的4.7kb5'同源臂和1.0kb3'同源臂可通過PCR擴增，并將其片段克隆入把向型載體。合成用于擴增所述臂的每種寡核苷酸引物的5'末端，其含有稀少切割型限制酶(rarecuttingrestrictionenzyme)的不同識別位點，并與所述載體的多聚接頭(polylinker)的克隆位點相容且從臂本身缺失。對于GPR54,所述引物設計為以下序列所示那樣，具有Agel/Spel的5'臂克隆酶(cloningenzyme)和Ascl/Fsel的3'臂克隆酶。此外，對于臂引物對(5'臂5'l(Agel)/5'臂3'(Spel)以及3'臂5'末端AscI/3'臂3'2Fse),其它對GPR54基因座特異的引物被設計為用于以下目的5'和3'探針引物對(5'探針FII/5'探針RII和3'探針Fl/3'探針Rl),用于擴增在分離的推定靶向克隆中的非重復性基因組DNA的兩個150-300bp短片段(所述片段位于每個臂外側并延伸超過所述臂)，從而允許對靶基因座進行Southern分析；小鼠基因型引物對(hetF和hetR),當其與載體特異性引物(本文中為Asc403)用于多元PCR時，允許野生型、雜合和純合小鼠之間的區分；最后，靶篩選引物(targetscreeningprimer)(3P3A)，其在3'臂區末端上游退火，且當與載體3'末端特異性引物(neo36)配對時產生靶事件特異性1.2kb擴增引物(amplimer)。該擴增引物可僅來自出現所需基因組改變的細胞的模板DNA,并允許區分正確靶向的細胞與背景，所述背景為含有該載體隨機整合的拷貝的克隆。靶向策略(targetingstrategy)中的這些引物的位置和GPR54的基因座結構顯示在SEQIDNO:10中。musHarryP5'探針eFIImusHanyP5'探針eRIImusHarry5'臂5，1AgemusHarry5'臂3'SpemusHarry3'臂5'末端AsclmusHarry3'臂3'2FsemusHarry3P3AmusHarry3'探針eFlmusHarry3'探針eRlmusHarryPheftmusHarryPhetRAsc403Neo36GTGTACCAGGTGAGGAGGCCATCAGAGGTGTGTCATCCTGAGGCCCAATGGTTCTTCAGGAAAACCGGTAAATGCTGTTAATCCTGCCAAGAGATAACTAGTGTAGCGAAAAACAGGGGAACAAATTCGTCAACTACATCCAGCGGGAAGTGGGATAGACACGGGAAAAGCTAAGAACTAAGTGTGGATGAGTGTGGACCGCTGGTATGTGACTCTGAGACTGAGTATGTGCCCTTGTCACTCGGACCCGGATGTACAGGTCAGAGCCCGCGTACCTGCTGGATGTAGTTGCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGAC同源臂的位置選擇為通過缺失7個跨膜區的大部分5'來功能性破壞GPR54基因。制備靶向型載體，所述載體中缺失的GPR54序列用非同源序列取代,所述非同源序列由選擇盒上游的內源基因表達報道物(不依賴框的lacZ基因)組成，所述選擇盒由與GPR54基因方向一致的、啟動的(promoted)新霉素磷酸轉移酶(neo)基因組成。一旦將5'和3'同源臂克隆入靶向型載體pTK4IBLMNL(見圖5),大的高純度DNA制備物利用標準分子生物技術制備。20ug新鮮制備的無內毒素DNA用另一中稀有切割限制酶Pmel限制(restricted),其存在于載體支架(backbone)中氨千青霉素抗性基因和細菌復制起點之間的獨特位點。線性化dna被沉淀并重懸于IOOmI磷酸緩沖的鹽水，為電穿孔做好準備。電穿孔24小時后，轉染的細胞在含200g/ml新霉素的培養基中培養9天。克隆被轉移到96孔板、復制并擴增，然后通過PCR篩選(利用引物3P3A和neo36,如上所述)以鑒定克隆，所述克隆中在內源GPR54基因與靶向型構建體之間發生了同源重組。陽性克隆較少，為1-5%。擴展這些克隆到允許復制物(replica)被冷凍，并且可制備足夠高質量的DNA用于利用如上述制備的外部5'和3'探針通過Southern印跡確定所述靶向事件，所有過程都利用標準技術(Russ等，Nature2000Mar2;404(6773):95-92000)。當用診斷性限制酶消化的DNA的Southern印跡與外部探針雜交時，被同源耙向的(homologouslytargeted)ES細胞克隆通過突變帶以及改變的野生型帶的存在來證實。例如，利用5'探針，BglII消化的DNA產生9kb野生型帶以及14.5kb耙向的帶；HindIII消化的DNA產生15kb野生型帶以及9.5kb靶向的帶；Xbal消化的DNA產生15kb野生型帶以及19.5kb靶向的帶。類似，利用3'探針，BamHI的DNA產生7.5kb野生型帶和4kb靶向的帶；EcoRI的DNA產生7kb野生型帶以及4.5kb靶向的帶。敲除前小鼠GPR54的基因組基因座的結構顯示于圖1。敲除后小鼠GPR54的基因組基因座的結構顯示于圖2。與Southern證實(verification)相關酶的位點已經表示出。GPR54GPCR,C57BL/6雌性和雄性小鼠進行交配，并在孕期(gestation)第3.5天分離胚泡。每個胚泡中注入來自所選克隆的10-12個細胞，并將7-8個胚泡植入假孕Fl雌性小鼠的子宮。嵌合同窩幼鼠出生時含有數只高水平(達100%)有花紋的雄性(agoutimale)小鼠(花紋外皮顏色(agouticoatcolour)提示靶向的克隆的細胞的作用)。這些雄性嵌合小鼠與雌性MF1和129小鼠交配，并通過有花紋外皮顏色與PCR基因分型(PCRgenotyping)分別測定種系、傳遞(germlinetransmission)。PCR基因分型在溶解的尾碎片(clip)上，利用引物hetF和hetR，以及第三種載體特異性引物(Asc403)來進行。該多元PCR允許從野生型基因座(如存在)從引物hetF和hetR進行擴增產生217bp帶。hetF的位點在敲除小鼠中缺失，使得所述擴增不能從靶向的等位基因開始(failfromatargetedallele)。然而，Asc403引物將與與3，臂區內的區退火的hetR引物一起從耙向的基因座擴增439bp的帶。因此，該多元PCR顯示同窩鼠的基因型如下:野生型樣品顯示單217bp帶；雜合DNA樣品顯示兩條帶217bp和439bp;純合子樣品僅顯示靶特異性439bp帶。實施例2B)結果I)基因表達模式L)電Northern電Northern見圖16。PCR結果。給定組織的表達表示為(-)未檢測到，(+)檢測到低水平豐度，(++)檢測到中等水平豐度,(+++)檢測到高水平豐度。睪丸+,肌肉-,卵巢+，前列腺-，小腸+，肺++，腎+,白細胞+,肝-,腦+++,心+,脾+Est數據庫搜索結果<table><row><column>BF470621</column><column>小鼠</column><column>10個樣品的標準化文庫</column></row><row><column>BE309865</column><column>小鼠</column><column>乳腺胂瘤，大體組織</column></row><row><column>AL541044</column><column>人</column><column>胎盤</column></row><row><column>BF470621</column><column>小鼠</column><column>腦(匯集的(pooled))</column></row><row><column>BB193083</column><column>小鼠</column><column>脊髓</column></row><row><column>AI823800</column><column>人</column><column>腎腫瘤</column></row><row><column>AA887801</column><column>人</column><column>結腸胂瘤</column></row><table>2)被LacZ染色的結構lacZ實驗中，以下結構含有LacZ表達的證據腦(以下區)，脊髓(感覺區)，睪丸。LacZ表達見于腦的不同區域，諸如海馬(最強的區)，視交叉上核(suprachiasmaticnucleus),乳頭體，腦橋和小腦，以及脊髓背側(感覺)區。觀察和顯微鏡切片固定6只野生型和6只突變體GPR54敲除小鼠的腦經并在冷凍切片機(freezingmicrotome)切出40張顯微:4竟切片。在顯微鏡下觀察切片顯示LacZ染色在以下區域的定位海馬嗅球(01factoryb函s)-f見交叉前(Preoptic)下丘腦腦室周(Periventricular)下丘腦韁核(Habenularnucleus)下丘腦束(Hypothalamictract)蟲咼一申纟至才亥(Cochlearnucleus)上乳頭體(Supramamillarybody)3J丄acZ《這^突變體腦切片見圖4a;雜合子和野生型的睪丸見b。II)解剖學觀察HarryPotter敲除小鼠顯示一些大體解剖異常突變體的生殖道總體明顯畏萎縮(雄性包皮腺(preputialgland)萎縮，小陰莖(micropenis),睪丸和儲精嚢/凝固(coagulatory)腺非常小)，肌肉重量減少，椋色脂肪減少且胃和頜下腺較小。雌性突變體乳腺發育不良，卵巢(圖6)、子宮和輸卯管萎縮。雄性突變體的肛門生殖器距離(anogenitaldistance)短于野生型(以cm為單位突變體0.97±0.03野生型1.4±0.3,p<0.001),這導致飼養人員錯誤判斷動物的性別。但在雌性中沒有觀察到差異。子宮和卵巢(上圖，野生型；下圖，突變體)III)行為所有動物被圏養，其可自由獲得食物和水，晝-夜循環為12小時晝/12小時夜，7am開始給光。在小鼠8-10周齡時進行檢測，除Barnesmaze和性行為4全測在下午15-17點進行以外，所有實驗都在早上10-12點進行。檢測顯示突變體和野生型之間有差異a)BarnesmazeBarnesmaze為空間記憶(spatialmemory)實驗，其在白色圓形平臺上進行，需要區分特定空間。其包含圓形平臺，所述平臺上有18個孔沿周長平均分布。一個孔下方有黑色逃跑盒子。Barnesmaze實驗利用嚙齒類動物避免有光照的非封閉表面(brightlylitunenclosedsurface)并尋找暗的封閉場所(darkenedenclosedshelter)的天然傾向。訓練所述動物動物IO天以上，記錄進入所述逃跑盒子的等待期以及錯誤次數和搜索策略。有趨勢表明，雄性突變體的該實驗表現較差(圖7)。5只雄性突變體和5只野生型同窩小鼠與野生型雌性動情期小鼠(通過陰道涂片評估)一同置于新籠中，并觀察30分鐘。所述小鼠都顯示對雌性有興趣(嗅(sniffmg))并在觀察期間進行交配。突變體對雌性沒有顯示有興趣，且在觀察期間不進行交配。此外，數只雄性和雌性突變體小鼠同處一籠但沒有懷孕，表明GPR54敲除小鼠是不育的。6只突變體雌性和6只野生型同窩小鼠在連續5天中接受涂片實驗。還檢驗了3周大+/+雌性。利用曱基藍染色所述載片。所有野生型顯示明顯的動情周期階段，但突變體不顯示。-A雌性的陰道圖片與3周大野生型小鼠相似(圖8)。d)生理建立15個交配對，其包含任意性別的GPR54突變與異性野生型小鼠，但從不產生同窩小鼠。因此，雄性和雌性GPR54突變體都不育。1)重量a)器官重量測定睪丸(圖9),肌肉(圖10)，腎上腺(圖lla)和唾液腺(圖llb)的重量。2)實驗a)睪銜，雌激素和GnRH測定測定6雄性突變體和6只野生型小鼠的睪酮。突變體的睪酮水平明顯低于(P<0.05)野生型小鼠(圖12)。雌性突變體的雌激素水平明顯低于動情期正常雌性小鼠。這于前者缺乏動情期周期一致。在動情前期，動情期，動情后期，以及動情間期的野生型雌二醇水平顯示正常的循環水平(圖13)。下丘腦中GnRH水平與野生型動物是可比的。這表明突變對于敲除小鼠的GnRH合成沒有影響(未顯示)。b)LH/FSH實驗突變體中FSH低得多(圖14a為雌性的；圖14b為雄性的)。LH水平沒有差異(未顯示)。c)外源性促性腺激素.給藥1000iuPMS(懷孕母馬血清-FSH-樣促性腺激素)后兩天給予1000iubHCG((3人絨毛膜促性腺激素)，導致50%雌性突變體(n=6)排出成熟卵，表明所述末端器官(endorgan)保持對天然促性腺激素產生反應的能力。這與GPR54受體和配體在垂體下丘腦軸而非末端器官水平起作用的推定一致。3)給藥外源性GnRH以及對垂體FSH和LH分泌的影響方法將25ngGnRH肽分四次間隔30分注入，并在末次注射后30分鐘處死動物以收集血液和垂體。所有小鼠在llam到lpm之間處死。動物分組6WT僅注入PBS(對照)，6WT注入在PBS中制備的GnRH，6HP注入GnRH/PBS。所有WT動物被分期并在動情間期(LH和FSH峰末期)使用。所有小鼠均為2-4月齡。重復所述過程測定LH和FSH。血清FSH實驗注入GnRH的WT的血清FSH比僅注入PBS的那些增加1.9-倍。HP水平比僅注入PBS的WT增加1.7倍，這表明所述突變體動物保持至少對GnRH有部分反應。這表明GPR54的作用可由下丘腦中的GnRH釋放控制。血清LH實驗注入GnRH的WT的血清LH比僅注入PBS的那些增加5倍。HP水平比僅注入PBS的WT增加5倍。這表明LH的釋放由外源性GnRH(圖15a)刺激。外源性刺激后測定垂體中LH水平的消耗。結果顯示垂體LH水平相應消耗，表明突變體仍對自垂體釋放的GnRH和LH有反應(圖15b)。從突變體敲除基因沒有任何有害影響。上文所述所有公開出版物包含在本文作為參考。所述方法和系統的的各種修飾和改變對本領域技術人員而言顯而易見，且不偏離本發明范圍和精神。盡管本發明根據具體優選實施方案進行描述，應理解本發明權利要求不限于所述具體實施方案。實際上，實踐本發明的所述模式的各種變化是化學、分子生物學以及生物技術或相關領域技術人員顯而易見的，并意圖包含在權利要求中。權利要求1.鑒定適合用于治療或緩解生殖疾病或生殖激素相關疾病，用作激素替代治療(HRT)，用于操縱動物的性激素軸或用于調節生育力和性欲的分子的方法，所述方法包括測定候選分子是否是GPR54多肽的激動劑或拮抗劑，所述GPR54多肽包含Genbank登錄號AF343725，NM_032551，AY029541，NT_011255，NM_053244，BC016531，AK039628，NT_039496，AF343726或BB261471所示核酸序列編碼的氨基酸序列或與其具有至少90％序列同一性的序列。2.具有功能破壞的內源GPR54基因的轉基因非人動物或其分離的細胞或組織在鑒定GPR54多肽的激動劑或拮抗劑的方法中的用途，其中所述GPR54基因包含Genbank登錄號AF343725,NM—032551，AY029541,NT—011255,NM—053244,BC016531,AK039628，NT—039496,AF343726或BB261471所示的核酸序列或與其具有至少卯％序列同一性的序列，所述GPR54多肽的激動劑或拮抗劑用于治療或緩解生殖疾病或生殖激素相關疾病，用作激素替代治療(HRT)，用于操縱動物的性激素軸或用于調節生育力和性欲，其中所述GPR54多肽包含Genbank登錄號AF343725，NM—032551，AY029541，NT一011255，NM—053244，BC016531,AK039628,NT—039496,AF343726或BB261471所示核酸序列編碼的氨基酸序列或與其具有至少90%序列同一性的序列。3.根據權利要求2的用途，其中所述轉基因非人動物是嚙齒類動物，優選小鼠。4.根據權利要求1,2或3中任一項的方法，其中所述激動劑或拮抗劑包括免疫球蛋白，優選能夠與GPR54多肽特異性結合的抗體，所述GPR54多肽具有Genbank登錄號AF343725,NM—032551，AY029541,NT—011255，NM—053244,BC016531,AK039628,NT—039496,AF343726或BB261471所示核酸序列編碼的氨基酸序列或與其具有至少90%序列同一性的序列。5.GPR54多肽的激動劑在制備藥物組合物中的用途，所述GPR54多肽具有Genbank登錄號AF343725,NM—032551,AY029541,NT—011255，NM—053244，BC016531，AK039628，NT—039496，AF343726或BB261471所示核酸序列編碼的氨基酸序列或與其具有至少90%序列同一性的序列，其作激素替代治療(HRT),用于操縱動物的性激素軸或用于調節生育力和性欲。6.根據前述任一權利要求的方法或用途，其中所述生殖疾病或生殖激素相關疾病選自以下疾病組成的組生育力疾病和性名炎疾病，生育力、節育、性欲和青春期開始的調節，泌乳，骨質疏松癥/骨硬化癥，停經包括停經相關的激素失衡，激素依賴性癌癥和良性前列腺肥大。全文摘要本發明涉及GPR54敲除哺乳動物以及利用它們的篩選方法，以及甘丙素樣受體和/或其配體在操縱垂體激素軸和生殖系統中的用途。文檔編號G01N33/50GK101173922SQ20071013832公開日2008年5月7日申請日期2003年10月17日優先權日2002年10月25日發明者塞繆爾·阿帕里西奧,威廉·科利奇,德克·贊,索菲·梅薩格,約翰·狄克遜,羅斯瑪麗·思雷舍,艾倫·亨德里克申請人:武田劍橋有限公司