專利名稱：Hiv蛋白酶活性測定指示劑、其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型的HIV蛋白酶活性測定指示劑及其制備方法，該 指示劑是一種多肽熒光試劑，HIV蛋白酶能大大增強該試劑的熒光強度。本 發明還涉及該指示劑的應用，所述的HIV蛋白酶指示劑可用于樣品中蛋白 酶生物活性的測定，特別適用于各種生物樣品中蛋白酶生物活性的測定，并 可用作HIV蛋白酶抑制劑的高通量篩選方法，這對研制治療艾滋病新藥具 有極大的應用價值。
背景技術：
在治療獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)患者時，引入有效的具有特殊 HIV蛋白酶抑制劑功能的化合物，在臨床上已獲得很大的成功。研究表明， 人類免疫缺陷病毒(HIV)是艾滋病的元兇。HIV蛋白酶的作用是催化裂解 HIV多肽中的gag和gag-pol，抑制該酶的活性會產生無感染能力的子代病 毒，從而阻止病毒進一步感染。因此HIV蛋白酶是抗艾滋病病毒藥物的理 想耙點，HIV蛋白酶抑制劑可以降低甚至終止HIV蛋白酶的活性。目前經美國食品藥品管理局(FDA)批準上市，用于治療艾滋病患者的 HIV蛋白酶抑制劑有六種，amprenavir(安普那韋)，indinavir(茚地那韋), lopinavir(洛匹那韋)，nelfinavir(奈非那韋)，ritonavir(利托那韋)，禾口 saquinavir(沙奎那韋)。聯合用藥療法(雞尾酒療法)是目前治療艾滋病感染的基石， 其中就包括HIV蛋白酶抑制劑和HIV逆轉錄酶抑制劑。但是，并非所有的 艾滋病患者在進行雞尾酒療法時都能得到理想的效果，不同的患者對藥物反 應變化很大。蛋白酶抑制劑和抗病毒性的關系已經被臨床數據所證實；當雞 尾酒療法用于治療患者時，潛在的藥代動力學及藥物之間的相互作用，既可 以提高也可能降低治療效果。患者的配合程度直接影響藥效，同樣也就影響 治療效果。因此，測定患者體內的HIV蛋白酶的濃度是非常必要的，以確保藥物 在維持AIDS病人體內抗病毒活性方面是充分有效的；另外，生物樣品中 HIV蛋白酶的定量測定對藥物的研發至關重要。在治療艾滋病其它重要的方面包括HIV蛋白酶代謝物的測定和抗HIV蛋白酶抗體的測定。HIV蛋白酶代謝物的測定可提供治療效果方面的信息；抗HIV蛋白酶抗體則顯示患 者被HIV感染，因此抗體的測定可用來診斷感染的可能性。定量測定在患者樣品內HIV蛋白酶的經典方法是通過化驗的方法，需 要復雜而昂貴的儀器，使臨床分析變得非常困難。例如，用色譜的方法(HPLC 或者HPLC/MS/MS)分析血漿樣品，可測定大量HIV蛋白酶的存在。(例如 Poirier， J. M. et al" Ther. Drug Monit. 22:465-473 (2000); Marzonlini, C., et al" J. Chromatogr. 740:43-58 (2000); and Remmel, R. P. et al" Clin. Chem. 46(1):73-81 (2000))。通常在血漿樣品檢測前進行了固相萃取，這樣血漿沒 有被直接分析而是進行了修飾，這種測定前的修飾增加了分析的復雜性并提 高了分析成本。放射性免疫測定通常在樣品內含HIV蛋白酶類似物的放射標記物，與游 離的的HIV蛋白酶之間存在競爭。受體一般是特定HIV蛋白酶的抗體。據報 道在一放射性免疫測定的例子中，用I-125標記HIV蛋白酶的類似物，與病人 血漿樣品中任何接有抗體的HIV蛋白酶存在競爭。沉淀出的抗體化合物通過 分析放射活性水平來測定HIV蛋白酶的濃度(例如Wiltshire, H. R. et al. Analyt.Biochem. 281:105-114 (2000))。在利用放射性免疫法間接測定，是將 HIV蛋白酶加入到含HIV蛋白酶培養基樣品中，放射性標記抗體與分裂產物 發生特異性結合，通過測定放射性活度來測定培養基的分裂。如果分裂產物 不存在則意味著抗HIV蛋白酶抗體的存在(例如U.S.Pat. No. 5,171,662)。所有這些測定HIV蛋白酶抑制劑和他們代謝物的方法都取得了一定的 成功。但是，目前所有的HIV蛋白酶測定方法都存在測定速度慢，操作復雜 以及生物樣品干擾太大的缺點。本發明則提供了一種簡單快速測定的方法。發明內容本發明的一個目的是提供了一種新型熒光測試試劑，在HIV蛋白酶存在 時它的熒光顯著增強，因此可作為HIV蛋白酶活性測定指示劑，適用于快速 測定具有HIV蛋白酶活性的物質。本發明的熒光測試試劑被HIV蛋白酶消化后，在近紅外區產生非常強的 熒光信號。鑒于他們的熒光信號在近紅外區，這些HIV蛋白酶熒光底物非常適合測定各種生物樣品(特別是冰凍切片)中HIV蛋白酶的活性。利用熒光 顯微鏡可以測定組織學樣品以及流式細胞儀的懸浮樣品。因此，本發明含熒光團的化合物HIV蛋白酶底物可以用來測定HIV蛋白酶活性和篩選HIV蛋白酶抑制劑。本文中，本發明的熒光測試試劑也稱為熒光指示劑，或被稱為HIV蛋 白酶熒光底物。本發明提供了一種熒光指示劑，該指示劑可增強HIV蛋白酶的熒光強度，并具有下述通式結構熒光淬滅團——多肽鏈——熒光發射團......................(I)其中所述的熒光淬滅劑是非熒光染料；所述的多肽是含有HIV蛋白酶 氨基酸的聚合物，可被HIV蛋白酶誘導水解；以及所述的熒光發射團是可 發射熒光的染料。優選的，上述通式中的熒光淬滅團的吸收波長大于600nm;以及其中 的熒光發射團的發射波長也大于600nm。 S卩，其中所述的熒光淬滅劑是最大 吸收波長大于600nm的非熒光染料；所述的多肽是含有HIV蛋白酶氨基酸 的聚合物，可被HIV蛋白酶誘導水解；所述的熒光發射團是最大發射波長 大于600nm的染料。由于本發明的熒光測試試劑結構中采用了吸收波長和發射波長都位于 近紅外區的發色團，使該試劑有最大的熒光共振能量轉移效率。因此而完成 了本發明。例如，本發明說明書的附圖1A和1B分別給出了可作為熒光淬 滅劑的Super Quencher 5TM和可作為熒光發射團的Cyanine 5的發射光譜。兩 個光譜重疊得非常好，因而說明了兩者之間具有最大的熒光共振能量轉移效 率。本發明的熒光指示劑中，熒光淬滅團，多肽鏈和熒光發射團具有可調節 的多肽空間。所述的多肽是包含HIV蛋白酶結合點的氨基酸生物聚合物， 此結合點極易被HIV蛋白酶誘導水解；所述的HIV蛋白酶結合點提供的氨 基酸序列可以被HIV蛋白酶識別并切斷，來顯示HIV蛋白酶的水解活性。本發明熒光指示劑中的多肽鏈，即HIV蛋白酶結合點通常是由大約2 50個氨基酸的多肽組成，優選2 20個氨基酸，更優選2 10個氨基酸。 優選的，其中所述的多肽是選自以下片段HVSFNFPQITH ; Gaba-SQNYPIVQ; VSFNFPQITK;或SQNYPIVQK。本發明特別優選如下方程式II和III的熒光化合物作為熒光指示劑，其 熒光發射團的發射波長大于600nm，以及熒光淬滅劑團的吸收波長也大于 600nm:熒光淬滅團一HVSFNFPQITH—C (熒光發射團).............(II)熒光淬滅團一Gaba-SQNYPIVQ—熒光發射團 .................(III)以上方程式中的簡寫字母代表不同的標準氨基酸。本發明所用的術語"蛋白酶結合點"是指可被蛋白酶特定識別和切斷的 氨基酸序列。蛋白酶結合點含有可被蛋白酶水解的多肽鍵，肽鍵連接的氨基 酸殘基可形成切斷點。本發明所用的術語"熒光發射團"是指一個可吸收特定波長的光，然后 發射出不同波長特定光的分子。常用的熒光發射團有菁染料，羅丹明及其衍 生物，熒光素及其衍生物，香豆素和鑭系元素螯合物。優選的，其中所述的 熒光發射團是Cy5、 Cy 5.5、 Cy7、 Cyanine 5、 Alexa Fluor 647、 Alexa Fluor 680、 AlexaFluor 750、 Super Fl匿647、 Super Fl療680或Super Fl麗750。最優 選的熒光發射團是Cy5或Cyanine5。本發明所用的術語"熒光淬滅團"是指一個能夠吸收特定波長的光但是 不會再發光的化學分子。常用的熒光淬滅團有偶氮染料，蒽醌類化合物，酞 菁染料和重金屬絡合物等。優選的，其中所述的熒光淬滅劑是Super Quencher 5或BHQ3。本發明所用的術語"肽"和"多肽"是指氨基酸組成的長鏈，它們的a-碳通 過一個氨基酸與另一個氨基酸縮合形成的肽鍵相連。肽鏈的一端的氨基酸有 一個自由的氨基，另一端有一個自由的羧基。術語"末端氨基"(簡稱 N-termi皿s)指的是多肽末端氨基酸的自由氨基；同樣，"末端羧基"或"羧基 末端"(簡稱C-terminus)指的是多肽末端氨基酸的自由羧基。在本發明中多肽的氨基末端在左邊，羧基末端在右邊。在本發明中，多肽中的氨基酸在蛋白酶的切斷處編號，編號隨著羧基氨基的方向從切斷處 連續遞增。本發明所用的術語"殘基"或"氨基酸"是指形成多肽的氨基酸。除非另有 說明，本文中的氨基酸是指自然產生的氨基酸，或者是天然氨基酸的類似物， 但與天然氨基酸性質相同。本發明所用的術語"蛋白酶活性"或"蛋白酶的活性"是指多肽被蛋白酶 切斷。蛋白酶活性"消化"一個或多個多肽形成大量的更小的多肽片斷。特異 性的蛋白酶可以識別特定蛋白的位置并水解。特異性的蛋白酶可以通過多肽 片斷上的特異氨基酸末端來表征。優選的，本發明的熒光指示劑是如下化合物Super Quencher 5—HVSFNFPQITH—C(Gyanine》；Super Quencher 5—Gaba-SQNYPIVQ—Cy5;RG(Cy5)—VSFNFPQITK—(Super Quencher 5)-R;Ac-RG(Alexa Fluor 647)—SQNYPIVQK—(Super Quencher 5)-R-NH2;或RRG(DyLight 647) —SQNYPIVQK—(Super Quencher 5)-RR。更優選的本發明熒光指示劑是Super Quencher 5—HVSFNFPQITH —C(Cyanine 5):下面，對本發明的熒光測試試劑，即HIV蛋白酶活性的熒光指示劑做 詳細描述。"給體熒光發射團"和"受體淬滅劑"熒光發射團吸收光子被激發，隨后發射出波長更長的光。但是，在另 一種叫作"受體或熒光淬滅劑"分子存在下，給體發射團發出的光被受體吸收 從而淬滅了熒光信號。這樣，用最好的熒光團/生色團配對，使給體的發射 光譜與受體的吸收光譜有最大的重疊，從而使多肽骨架的HIV蛋白酶底物Super Quencher 5—《 hvsFNFPQiTi o o達到淬滅的最優化，給體/受體高效率的能量傳遞便于測定低濃度HIV蛋白 酶活性。本發明就是利用熒光團/生色團的分子內有效能量傳遞作為測定熒 光蛋白酶的指示劑。"給體"和"受體"匹配的選擇一般是根據受體分子的吸收光譜和給體分 子的發射光譜盡可能的完全重疊。另外，受體的吸收光譜和給體的發射光譜盡可能在近紅外區域(>600nm)。熒光團因而能提供測定生物樣品中HIV蛋 白酶活性的信號，這些生物樣品包括:生物體液，組織勻漿等類似物。發射 光譜，吸收光譜以及許多熒光團的化學結構己有很多報道(例如Molecular probe公司白勺產品說明書Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, R. P. Haugland編輯，第9版)。HIV蛋白酶的活性的熒光指示劑本發明提供了一種新型的熒光測試試劑，用于測定樣品中HIV蛋白酶 的活性。這種熒光HIV蛋白酶指示劑通常由熒光發射團(給體)與一個熒 光淬滅團(受體)分子通過多肽相連，這個多肽的特定氨基酸序列可被HIV 識別并切斷。給體發色團被特定波長的光激發后，發出波長更長的光。當給 體發色團與受體分子距離足夠近的時候，受體分子吸收了給體發色團發出的 光，從而淬滅了給體熒光發射團的熒光信號。不管兩個發色團是否相同，淬 滅過程都會產生。如實施例1所示，在本發明中我們用兩種不同的染料標定 了多肽。用同樣熒光發射團雙標定的多肽也可以作為蛋白酶的指示劑。在給 體發射團和受體之間巧妙設計的斷裂，使得兩個分子分離，從而終止了淬滅 過程而使熒光增強。本發明中的熒光發射團分子一個基本的應用就是，無論在實驗室還是 工業上都可以作為檢測HIV蛋白酶活性的試劑。與許多其它酶一樣，HIV 蛋白酶隨著時間活性降低，特別是以活性形式存放。另外，很多蛋白酶以非 活性的前體存放(酵母)，在使用前必須水解特定的肽鍵，從而轉化成活性 的形式。因為活度總是變化并且HIV蛋白酶活性隨時間而降低，因此在應 用特定的蛋白酶前，非常有必要經常測定HIV蛋白酶的活性和活度質量。傳統的確認和量化HIV蛋白酶活性方法，是用HIV蛋白酶倍數級的培 養基消化一段時間后，用HPLC測定消化的蛋白質的數量。這種方法耗時， 需要昂貴的試劑，很多的步驟和相當大的工作量。與此形成鮮明對照的是，本發明的熒光試劑可以在數分鐘內 一步快速測定HIV蛋白酶的活性。即HIV 蛋白酶只需簡單加入和熒光試劑接觸，接著檢測熒光變化(例如可用熒光 計或者熒光微板讀取儀)。另外，由于測定HIV蛋白酶活性是在"試劑"溶液中，因此本發明的熒光化合物可以用來測定生物樣品中HIV蛋白酶的活性。這里的"生物樣品"是指來自生物體或生物體成分(例如細胞)的樣品。樣品也可以是任何生 物組織和體液。樣品往往是直接來自患者的"臨床樣品"。這些樣品包括唾 液，血液，血細胞(如白細胞)，組織或細針狀組織切片，尿液，腹液或 胸膜液和細胞。生物樣品也包括組織學上的冰凍切片的部分組織。現有的熒光HIV蛋白酶指示劑的吸收是在紫外或可見區，因此在測定生物樣品特別是在紫外區有吸收的生物樣品時(如蛋白質)樣品干擾很大。與此相反，本發明的熒光指示劑無論吸收還是發射都在近紅外區(>600 nm)。 這些信號是不會被背景分子吸收后淬滅干擾測定，因此非常利于生物樣品的 測定。本發明中的熒光HIV蛋白酶指示劑中含有高效率的熒光發射團，當多 肽底物被切斷后可以釋放出非常強的熒光信號。這種強的熒光信號可以用來 測定低濃度的HIV蛋白酶的活性。因此發明中的熒光HIV蛋白酶指示劑特 別適合測定HIV蛋白酶的活性。本發明的另一目的是提供了所述熒光指示劑的制備方法，該方法包括以 下步驟(1) 將所需多肽底物用熒光發色團進行修飾，將所需的熒光發射團接 到多肽末端氨基上；和(2) 然后將含有熒光發射團的多肽與含有熒光淬滅團的分子偶聯，得 到所需的熒光指示劑。本發明方法中，所述的多肽底物或稱為多肽骨架可從市場上購得，例如 可從Bachem和Novabiochem公司買到；也可以按照常規方法合成，例如按 照FMOC化學標準方法合成。[例如可參見G Barany和R.B. Merrifield， Solid-phase peptide synthesis, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 2，Academic Press, p 3-284， 1979年，New York;R.B. Merrifield，J.Am. Chem. Soc.， 巻85， p2149 2156; N.Y, 1980 and Stewart等人，Solid Phase Peptide Synthesis,第二版，Gross禾卩Meienhofer編輯，Academic press, Pierce Chem. Co. ， Rockford, 111. (1984)]。具體的，有兩種方法可用來制備熒光HIV蛋白酶能切斷的多肽底物， 它們是預先標記法和后標記法。所述的預先標記法是用染料標記的氨基酸作 為骨架，按照標準的多肽化學利用FMOC和t-BOC基團的保護，可以非常 容易的將染料標記的氨基酸連接成多肽。許多染料標記的FMOC保護的氨 基酸可以從市場上買到，例如可從泛博生物化學有限公司買到。另一種方法 是后標記法，利用標準序列的多肽與活性染料反應得到。對于后標記法應首 先制備熒光HIV蛋白酶的多肽骨架，即HIV蛋白酶的切割點(P)。熒光團 和淬滅劑然后通過化學方法鍵連到多肽上，熒光團或者直接與多肽相連，或 者通過連接劑(linker)與多肽相連。最后，將熒光蛋白酶指示劑直接或間 接地通過化學鍵連接在一起。多肽骨架的制備利用固相合成制備多肽，C-末端氨基酸序列連接到不溶性支撐體上， 然后依次加入氨基酸形成多肽，本發明正是采取此方法制備多肽骨架。關于 固相制備技術Barany和Merrifield在這方面已作有大量報道，參考文獻同 上。目前，固相合成是商業上利用FMOC禾P t-BOC保護合成多肽最簡單的 方法。熒光HIV蛋白酶抑制劑多肽成分的化學合成是實例在實施例1和2 中有詳細描述。現在普遍應用的多肽合成是利用FMOC合成化學來實現的。Asp, Ser, Thr和Tyr的側鏈是用叔丁基保護，Cys的側鏈殘基是用S-三苯甲基(trityl) 和S-叔丁基硫基保護，Lys殘基是用t-Boc (叔丁氧羰基)，Fmoc (9-芴甲基 羰基)和S-叔丁基硫基保護，所用的氨基酸保護劑都是可以買到的。多種保 護基團的利用可以選擇性的脫保護，從而將熒光團連接到預想的側鏈位置 上。例如t-Boc可在二氯甲烷中用TFA脫保護；Fmoc可在20%哌啶DMF 或N-甲基吡咯垸酮溶液中脫保護；4-甲基三苯甲基用1~5%的TFA水溶液和 5%三異丙基硅烷在二氯甲垸中脫保護；S-叔丁基硫基使用10%的巰基乙醇 的水溶液脫保護；叔丁基、t-Boc和S-三苯甲基可用TFA:苯酚:水:苯硫醚:二 巰基乙醇(85:5:5:2.5:2.5)—起脫保護；叔丁基和t-Boc可用TFA:苯酚:水(95:5:5)—起脫保護；詳細的合成、保護以及熒光團的連接過程在實施例1 和2中通過實例進行了詳盡的描述。另外，熒光HIV蛋白酶指示劑的多肽合成也可利用DNA重組技術來合 成。簡單來說，就是將帶有想要的氨基酸序列密碼的DNA分子通過各種化 學方法合成出來，這些方法包括Beaucage和Carmthers報道的磷酰亞胺法 (Tetra. Letts. 22: 1859-1862 (1981));和Matteucci的磷酸三酯法(J. Am. Chem. Soc., 103:3185 (1981));商業上合成DNA的方法是采用的是(5-腈乙基 磷酰亞胺法合成。如果必要的話，寡聚核糖核酸可以通過以下技術純化，經典的純化技 術有凝膠電泳，離交換色譜(如Mono-Q column, Pharmacia-LKB, Piscataway, N丄，USA)，或者反相高效液相色譜(HPLC)。蛋白質和多肽純化方法的標 準技術例如可參見Methods in Enzymology， Vol. 182， Guide to Protein Purification, M. Deutscher編輯，(1990)， p619-626。寡聚核糖核酸可轉換為雙鏈DNA或者通過DNA聚合酶聚合，然后在 啟動子的控制下DNA插入到載體中，用來轉化主體細胞表達氨基酸序列密 碼。克隆技術和多肽的表達技術有如下文獻Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual ， 第二版， Vols.l-3， Cold Spring Harbor Laboratory (1989);Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques Berger禾口 Kimmel編輯,San Diego: Academic Press, Inc. (1987),Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等人編輯，Greene Publishing and Wiley-lnterscience, New York (1987)。熒光發射團和淬滅劑與多肽骨架的連接按照常規方法將所需的熒光發射團接到多肽末端氨基上，然后將含有熒 光發射團的多肽與含有熒光淬滅團的分子偶聯，得到所需的熒光指示劑。熒光發射團和淬滅劑可采用很多方式連接到多肽骨架上。例如可直接 將熒光團的反應位點與多肽的反應位點如末端氨基或羧基相連，或者是氨基 酸側鏈的活性基團如巰基，羥基或羧基部分。許多熒光發射團和淬滅劑一般 都含有合適的反應位點。而且，熒光發射團和淬滅劑的衍生物可提供連接其它分子的反應位點。帶有反應官能團的熒光發射團和淬滅劑，可以從市場上 買到。熒光發射團的衍生化只需要接上一個簡單的取代基或者具有官能團的 連接劑。如上所述，熒光發射團和淬滅劑可直接與HIV蛋白酶指示劑的多肽骨 架相連。例如Cy5琥珀酰亞胺酯可通過氨基酸的a氨基與天門冬氨酸相連。 Cy5熒光團的碘代乙酰胺可以通過與巰基反應而與半胱氨酸相連。這類結合 方法己有很多報道。本發明所使用的多肽空間長度，從空間構型上熒光團更適合與末端分 別是氨基和羧基的多肽Q或C2氨基末端側鏈上的活性基團連接。多肽長度和固相支持物的選擇本發明中的熒光HIV蛋白酶指示劑的肽鏈可以在溶液中與固相支持物 相連。本發明所用的術語"固相支持物"是指不溶于溶液或不與溶液中任何 組分發生反應的固體材料。這些組分是指本發明中用來檢測HIV蛋白酶活 性熒光HIV蛋白酶指示劑的分子，和用來連接熒光分子的功能化基團。常 用的固體材料有二氧化硅，可控孔度玻璃(CPG)，聚苯乙烯，聚苯乙烯/乳 膠，羧基修飾的聚四氟乙烯，葡聚糖，聚糖的衍生物例如含有氨基，羧基 和巰基的瓊脂，各種塑料如聚乙烯，聚丙烯酸等。另外，還可以使用"半固 體支持物"，所述的"半固體支持物"例如是細胞和脂質體內的脂肪膜。固體支持物最好帶有功能性基團(如羥基，氨基，羧基，酯基和巰基)，以提供與多肽直接或間接相連的反應位點。通過多肽骨架將底物連接到固相支持物上的時候，多肽骨架的長度可能會增加。本發明所述的氨基或羧基末端的多肽骨架空間約有2 50個氨基 酸，優選的是2 20個氨基酸，更優選的是2 10個氨基酸長度。多肽骨架中的有些氨基酸成分是用來為阻止不希望的相互作用，多肽 骨架中用來作為連接用的氨基酸必須選擇含支鏈的氨基酸(如Cys,Lys)，這 些氨基酸很容易與連接劑或固相支持物偶合。具體來講，多肽骨架實際上通過連接劑與固相支持物相連。本發明所 使用的術語"連接劑"是指用來連接多肽和其它分子(如固相支持物，熒 光團)的分子。連接劑是指含有不同或相同雙官能團的分子，第一個反應點能夠與多肽共價相連，第二個反應點能夠與固相支持物的反應基團共價相 連。多肽骨架的共價連接基團可以是末端氨基或羧基，也可以是氨基酸支鏈 的氨基(如通過雙硫鍵與Cys相連)。已報道的具有此功能的連接劑有直鏈或支鏈的碳連接劑，雜環碳連 接劑或多肽連接劑。如上所述，連接劑可與氨基酸末端的氨基和羧基或帶反 應活性的支鏈相連。特別好的連接劑是能與氨基，羧基或巰基形成共價鍵。與氨基結合的 連接劑包含的反應基團有羧基，異氰酸酯，異硫氰酸酯，酯基，氯代垸烴 等。與羧基結合的連接劑含有的反應基團有各種氨，羥基等。最后，巰基 連接劑的反應基團有巰基，丙烯酸酯，異氰酸酯，異硫氰酸酯等。首選的 連接劑有SulfoMBS (間-馬來酰亞胺苯甲酰基-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯) (m隱maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)，用來連接巰基固定在 固相支持物上的氨基(特別是多肽上Lys支鏈上的氨基)；其它連接劑例如 有EDC : 1-乙基-3-(3- 二甲氨基丙基)-碳二亞胺(l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropryl)-carbodiimide)和雙-(磺基琥珀酰亞胺基辛二酸酯 (bis-(sulfosuccinimidyl suberate傳。本發明的另一目的是提供了一種用于檢測HIV蛋白酶活性的試紙，該 試紙是將本發明的HIV蛋白酶熒光指示劑吸附到固體支持物而形成的。優選的，本發明用于檢測HIV蛋白酶活性的試紙的基質是天然的或合 成的，具有一定剛性的固體支撐物，優選的是紙或塑料薄膜。本發明的另一目的是提供了測定HIV蛋白酶活性的方法，該方法包括 使欲測定的蛋白酶樣品和本發明的一種或多種熒光指示劑接觸，然后測定所 述的樣品的熒光強度。本發明所用的術語"接觸"是指欲測樣品以固態、液態 的形式與本發明的熒光指示劑接觸或混合。本發明提供了試劑與樣品接觸測 定蛋白酶HIV活性的方法，并且通過測定熒光基團熒光的變化來指示HIV 蛋白酶的活性。本發明測定HIV蛋白酶活性的方法包括以下步驟 (1)將一定量的測試樣品與本發明所述的HIV蛋白酶熒光指示劑或試 紙接觸或混合；(2)測定所述樣品與本發明所述的HIV蛋白酶熒光指示劑或試紙接觸 或混合后的熒光強度值，以本發明所述的HIV蛋白酶熒光指示劑或試紙本身的熒光強度值為空白，計算所測試樣品的HIV蛋白酶的活性。在應用上述方法測試HIV蛋白酶的活性時，可用HIV蛋白酶/指示劑的 標準曲線來量化，所述的標準曲線可通過測定已知活性的HIV蛋白酶溶液 產生的熒光變化速率來繪制。當所述于測定樣品是組織樣品時，所述的"接觸"或"混合"時間即 是溫育時間，使生長的HIV蛋白酶切斷熒光HIV蛋白酶指示劑。通常該溫 育時間為10 60分鐘，溫度》37'C，優選37。C 38'C。本發明所例舉的熒光指示劑都可以用來測定樣品中HIV蛋白酶的活 性。樣品可以是"儲存"有HIV蛋白酶的樣品，例如用于研究或工業生產的樣 品，也可以是生物樣品。所述的樣品可以是組織切片，或懸浮的細胞，或是 含有生物體液的樣品，例如唾液、血液、活組織切片組織樣品，或是上述各 種樣品的代謝產物的細胞樣品，即是來自組織、血液、尿液、唾液或其他生 物體液、淋巴和活組織切片中的代謝產物，特別是部分組織，代謝細胞，代 謝組織等。所述樣品的測定可以組織切片、細胞懸浮液、培養基溶液等各種 形式進行。檢測方法包括使用熒光顯微鏡、酶標儀、流式細胞儀、熒光計或吸收 光譜，優選使用分光熒光計或采用熒光檢測器的HPLC方法檢測熒光的變 化。設定分光熒光計激發給體熒光團的激發波長，并檢測其發射波長處產生 的熒光，然后進行對比和計算。本發明的熒光指示劑的吸收或是發射都在近紅外區(〉600 nm)。因此， 本發明的測定方法中，所述的檢測在近紅外區(>600nm)進行。優選的，本發明利用熒光HIV蛋白酶底物測定HIV蛋白酶活性的方法 還提供了在實驗室和工業上利用熒光抑制劑檢驗或定量測定HIV蛋白酶活 性，特別是HIV蛋白酶儲存液活性的方法。實踐中，在使用前檢驗HIV蛋 白酶儲存液活性是非常必要的，因為HIV蛋白酶活性常常隨著時間而降低 (例如通過自身水解)，并且可以顯示酵母菌前體活化后活度的變化。只需將一定量的HIV蛋白酶的備用液加入到本發明的熒光HIV蛋白酶底物中，就可通過檢測熒光的增長來檢測。備用液和熒光指示劑也要在優化 的HIV蛋白酶的活性"消化緩沖液"內使用和檢測。適合測定HIV蛋白酶 活性的緩沖溶液己有很多報道。通常，選擇的緩沖溶液pH值是HIV蛋白酶 最適合的pH值。測量可以用熒光計，這個裝置有激發熒光分子的光源，并 能測定隨后發出的特定波長的光。與可調的不含HIV蛋白酶指示劑溶液相 比較，可以得到HIV蛋白酶的活性。活性水平可以用HIV蛋白酶/指示劑的 標準曲線來量化，標準曲線可通過測定已知活性的HIV蛋白酶溶液產生的 熒光變化速率來繪制。熒光化合物的測定最好用熒光計測定，也可通過其它已知的方法測定。 例如本發明中的熒光團發出的是可見光，肉眼就能觀測到熒光的變化；也 可通過接有數碼轉換器的相機進行鏡像分析來測定；也可通過濾光器在熒光 顯微鏡下進行測定，熒光顯微鏡只是給操作者提供一個形象的信號，但是這 個信號可以被膠片或視頻分析系統記錄，信號也可以非常容易的被鏡像分析 儀或光度計量化。在檢測樣品中HIV蛋白酶活性時，將樣品懸浮或溶解在緩沖溶液中(待 檢測的HIV蛋白酶最適宜的pH值)，將本發明中的一種熒光HIV蛋白酶指 示劑加入到此緩沖溶液中，并用分光熒光計檢測熒光的變化。設定分光熒光 計激發給體熒光團的激發波長，并檢測其發射波長處產生的熒光。本發明中的HIV蛋白酶指示劑同樣可用來檢測生物樣品中HIV蛋白酶 的活性。特別指出的是，本發明的HIV蛋白酶指示劑可測定分離出的生物 樣品中HIV蛋白酶的活性，這些生物樣品包括唾液，血液，血細胞，腫 瘤切片等，以及培養基中的細胞和組織等。這些信號可以被熒光顯微鏡，熒 光微板讀取計，熒光計和流式細胞儀量化。下面對檢測分離的生物樣品中HIV蛋白酶活性的方法進行詳細描述。分離生物樣品的化驗本發明提供了檢測分離的生物樣品中HIV蛋白酶活性的方法，可以通 過樣品與本發明中熒光HIV蛋白酶指示劑簡單的接觸，隨著時間變化檢測 指示劑熒光的變化。樣品可以懸浮在以上所述的"消化緩沖液"中；也可以 是透明的細胞殘骸，例如在分析前進行離心分離。本發明的熒光HIV蛋白酶指示劑也可以被吸附到固體支持物上的，吸 附有指示劑的固體支持物在化驗時與樣品溶液接觸。由于指示劑的消化作用 而產生的熒光隨時間的變化可通過以上所述的任何方式進行檢測。組織切片的原位檢測本發明還提供了組織切片原位檢測HIV蛋白酶活性的方法。這種檢測 HIV蛋白酶活性的方法與以前的方法(如染色和抗體標記)相比有明顯的優勢，與簡單標記的方法不同的是，原位檢測的方法用的是HIV蛋白酶指 示劑指示真實的活性，而不是簡單指出HIV蛋白酶是否存在。HIV蛋白酶 常常以非活性的前體(酶原)存在于組織中，這種前體是可以與HIV蛋白 酶標記物結合的，傳統的標記方法無法提供生理狀態的信息和組織中HIV 蛋白酶當時的活性信息。原位檢測的方法一般包括提供組織切片(特別是冷凍組織切片)，與組織切片接觸的本發明中的熒光HIV蛋白酶，肉眼觀測到的熒光結果。利 用熒光顯微鏡可進行清楚的觀察。熒光顯微鏡的"激發"光源引發"給體" 熒光團發出熒光，熒光顯微鏡裝備有濾光片優化熒光的檢測。有多種方法可將熒光指示劑引入到組織切片中。例如如上所述在緩沖溶液中放入熒光蛋白酶指示劑，來檢測組織切片。另外，熒光蛋白酶指示 劑可放在半固體介質如凝膠或瓊脂，這種介質可在組織樣品上擴散。在提供了HIV蛋白酶活性信號的同時，凝膠保持了樣品的潮濕度。熒光HIV蛋白 酶指示劑也可以接到聚合物上如塑料膜，步驟類似于Western Blots方法。將 塑料膜放到組織切片的樣品上滑動，在顯微鏡下觀測指示劑分子在樣品組織 中被切斷而產生的熒光。通常，組織樣品必須溫育一段時間，讓生長的HIV蛋白酶切斷熒光HIV 蛋白酶指示劑。溫育時間為10~60分鐘，溫度37。C 38。C。培養基細胞和組織切片細胞懸浮液的原位檢測另外的一個具體例子是，本發明提供了一種培養基細胞和組織切片細 胞懸浮液的原位檢測的方法，這些細胞來自組織切片樣品，或生物體液(如 唾液，血液，尿液，血漿等)。培養細胞可以是在細胞培養板中培養的，或 者是組織切片中的懸浮細胞經離心過濾得到的。同樣地，細胞的懸浮溶液按照標準方法制備并轉移到組織切片上。切片用磷酸鹽的鹽水緩沖液洗滌，然 后用半固體聚合物或用含熒光HIV蛋白酶指示劑覆蓋。切片在37"C培養必要的時間以利于HIV蛋白酶的生長來切斷HIV蛋白酶指示劑。然后，如前所述，用裝備有合適的濾光器的熒光顯微鏡檢測切片。另一種方法是將細胞在37"C與HIV蛋白酶指示劑培養后，用緩沖溶液 洗滌，然后轉移到毛細管中，在熒光顯微鏡下觀測。用流式細胞儀量化細胞 內酶的活性時，帶熒光指示劑的細胞在37t:培養后，用緩沖溶液簡單洗滌 后分析。本發明的又一目的是提供了一種應用本發明的熒光指示劑篩選HIV蛋 白酶抑制劑的方法。使用該方法可以高通量篩選HIV蛋白酶抑制劑，這在研 制治療艾滋病新藥時具有極大的實際應用價值。具體的，本發明篩選HIV蛋白酶抑制劑的方法包括以下步驟(1) 在沒有"測試物"存在的情況下，按照本發明測定HIV蛋白酶活 性的方法，測定某一HIV蛋白酶的活性，作為空白實驗；(2) 在有"測試物"存在的情況下，按照本發明測定HIV蛋白酶活性 的方法，測定該HIV蛋白酶的活性；和(3) 通過比較步驟(1)和步驟(2)所得到的所述HIV蛋白酶的活性， 計算和評述上述"測試物"對HIV蛋白酶的抑制作用。根據所述方法，通過各種"測試物"對HIV蛋白酶活性抑制作用的比 較，篩選出可以作為HIV蛋白酶抑制劑的"測試物"。通過以上描述可以看出，應用本發明的熒光指示劑可以簡單快速的測定 HIV蛋白酶的活性，和篩選HIV蛋白酶抑制劑。本發明的熒光指示劑的應用 將對抗艾滋病藥物的開發具有非常重要的意義。
圖1A是泛博生化Super Quencher 5在甲醇溶液(0.5 uM)中的吸收光 譜；圖2B是Cyanine5在甲醇溶液(0.1 uM)中的發射光譜。這兩個光譜 重疊得非常好，說明兩者之間具有最大的熒光共振能量轉移效率。 圖2顯示了熒光蛋白酶指示劑的熒光強度隨酶反應時間的變化。 圖3表示在不同的HIV蛋白酶抑制劑存在下，HIV蛋白酶受到抑制后熒光蛋白酶指示劑的熒光增長。
具體實施方式
本發明通過以下實例進行詳細說明。這些實例是為了能夠更清楚全面 地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。實施例1本發明熒光指示劑的合成按照下述反應流程合成具有下述化合物10結構的HIV蛋白酶的近紅外 熒光指示劑。將從Bachem公司購買的HIV多肽HVSFNFPQITH溶解在二甲亞砜 (DMSO)中，濃度為5mg/mL;將從北京泛博生物化學有限公司購買的Cyanine 5碘化乙酰胺(型號為#1054)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，濃度為 10mg/mL。然后，將上述O.lmL的多肽DMSO溶液與O.lmL染料DMF溶液在室溫混合，向其中加入與染料等當量的二異丙基乙基胺，得到的混合物 在室溫攪拌6~12小時。Super Quencher 5 succinimidyl ester (8)(1) 合成多肽骨架多肽骨架即可從Bachem和Novabiochem公司買到，也可以按照FMOC化學標準方法合成。合成的多肽用溫和的酸(乙酸二氯甲垸三氟乙酸體積比=2:7:1)在室溫下處理30分鐘，就可以從2-氯三苯甲基氯的樹脂上切割 下來。合成中所涉及到的支鏈保護基包括保護Asp，Ser,Thr,andTyr殘基 的叔丁基，保護Cys殘基的S-三苯甲基和S-叔丁基硫基，以及保護賴氨酸殘 基的t-Boc,Fmoc和4-甲基三苯甲基。支鏈保護基和FMOC基團在合成多肽的a-氨基上，不會被溫和酸從多 肽樹脂上用試劑切割下來。含保護基的多肽溶液被凍干，凍干后的多肽進一 步用30%TFA (三氟乙酸)二氯甲垸溶液處理，以脫掉t-Boc， 20%哌啶的 DMF或者N-甲基吡咯垸溶液脫掉Fmoc保護基，1~5% (v/v) TFA水溶液，或 1% TFA/5。/。三異丙基硅烷二氯甲烷溶液脫掉4-甲基三苯甲基保護基，10%巰 基乙醇溶液脫掉S-叔丁基硫基，用TFA:苯酚:水甲硫酚:二巰基乙垸= 85:5:5:2.5:2,5脫掉叔丁基，t陽Boc和S-三苯甲基,用TFA:苯酚:水卯:5:5 脫掉叔丁基和t-Boc基團。完全或部分脫掉支鏈的多肽后用C18反相柱HPLC純化，以含 0.075%TFA的水/乙腈為流動相進行梯度洗脫。然后，得到的多肽用給體發色團和受體淬滅劑進行修飾。(2) 引入熒光發射團將從Bachem公司購買的HIV多肽或按照上述方法制備的多肽溶解在 二甲亞砜(DMSO)中，濃度為5mg/mL;將從北京泛博生物化學有限公司購 買的Cyanine 5碘化乙酰胺(泛博生化公司生產，型號為#1054)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，濃度為10mg/mL。然后，將上述0.1mL的多肽DMSO 溶液與O.lmL染料DMF溶液在室溫混合，向其中加入與染料等當量的二異 丙基乙基胺(D正A)，得到的混合物在室溫(37°C)攪拌6 12小時。首先將Cyanine 5給體發射團接到帶末端氨基的多肽上。將多肽和熒光 探針按照摩爾比1:5溶解到盡可能少的N-甲基吡咯垸(NMP)中， 一般為 20~60uL。 1摩爾等當量的二異丙基乙基胺(D正A)也加入到反應混合物中。 反應在37'C維持6~12小時。(3) 引入熒光淬滅團將上述己經引入熒光發射團(Cyanine5)的多肽與含有熒光淬滅團的 分子(Super Quencher 5)偶聯導入淬滅團。該偶聯反應是通過多肽的氨基 與Super Quencher 5活性酯(琥珀酰亞胺酯)進行。具體地是，將HPLC純化的多肽與Super Quencher 5的活性酯以3:1 的比例混合。反應混合物于室溫攪拌6 12小時，然后用Waters的HPLC分 離純化，得到的最終產物即本發明的熒光測試試劑。其中所述HPLC的分離 條件是C3的分析用的反相柱，0.1 。/。TFA/乙腈梯度洗脫，流速lmL/min。上述產品的分子量是通過基質輔助激光解析飛行時間質譜儀(Kratos Analytical公司KompactMADLI 1)進行測定的。質譜儀用Leucine-Enkaphelin (556.6 amu), Bradykinin (1061.2 amu),禾卩Mellitin (2847.5 amu)進行了校準。 輔助樣品是a-氰基-4-羥基肉桂酸(a-cyano-4- hydroxycinnamic acid)。將樣 品放到靶上，1 mL 0.1% TFA的乙醇溶液滴到靶上后干燥。數據經50次累 計，每個樣品峰加1代表分子離子峰。實驗數值和計算數值吻合的非常好表 明最終純化的熒光團結合的多肽沒有任何副反應產物。實施例2本發明熒光指示劑的制備按照與實施例1類似的方法，采用相應的原料，制備下述熒光指示劑Super Quencher 5—Gaba-SQNYPIVQ—Cy5;RG(Cy5) —VSFNFPQITK—(Super Quencher 5)-R;Ac-RG(Alexa Fluor 647)—SQNYPIVQK—(Super Quencher 5)-R-NH2 ;禾口RRG(DyLight 647) —SQNYPIVQK—(Super Quencher 5)-RR。實施例3應用本發明的熒光蛋白酶指示劑測定HIV蛋白酶活性為了證明本發明中的熒光蛋白酶指示劑非常容易被HIV蛋白酶消化分 解，我們用實施例1制備的化合物10為底物，分析了在HIV蛋白酶存在下 化合物10的熒光強度變化。化合物10的DMSO備用液用緩沖溶液稀釋到熒光HIV蛋白酶指示劑 濃度在5 10uM之間(緩沖溶液是用50mM醋酸鈉，lMNaCl， ImM EDTA, lmM二巰基乙醇和lmg/mLBSA配制的，pH=5.4)。向此溶液中加入10個 單位的HIV蛋白酶(35 nM)開始酶的反應。同時，在加入HIV蛋白酶之前和之后30min進行HPLC分析。HIV蛋白酶消化反應在37"進行。HPLC 分離的樣品在650nm檢測，多肽片斷上的熒光團和淬滅劑都可被檢測。分析結果見圖2，圖2的譜圖顯示了熒光蛋白酶指示劑的熒光強度隨 酶反應時間的變化。其中1表示沒有HIV蛋白酶時的曲線；2表示有HIV 蛋白酶時的曲線，兩者均是孵化10分鐘后的結果。由圖2可以看出，在HIV 蛋白酶的作用下，熒光HIV蛋白酶指示劑水解使體系的熒光強度隨時間而 增強，根據此結果可以確認的是，本發明的HIV蛋白酶底物可以被用來快 速檢測HIV蛋白酶活性。實施例4用本發明的熒光HIV蛋白酶指示劑篩選HIV蛋白酶抑制劑本實施例中，在有或沒有熒光蛋白酶在抑制劑的情況下分別進行了實 驗，用于本實施例的HIV多肽抑制劑2-5的是氨基酸序列為SQNYPIVQ、 TATIMMQRGE、 RVSFNFPQITR和ATLNFPISQE的多肽。所用的所有HIV多肽抑制劑的濃度都是10uM。將含有方程式II, III的不同熒光HIV指示劑的DMSO備用液用緩沖溶 液稀釋到熒光HIV蛋白酶指示劑濃度為10uM(緩沖溶液是用50mM醋酸鈉， 1M NaCl， ImM EDTA, ImM 二巰基乙醇和lmg/mLBSA配置的，pH=5.4)。 向此溶液中加入IO個單位的HIV蛋白酶(35 nM)和HIV蛋白酶抑制劑開 始酶的反應。在加入HIV蛋白酶之前和之后30分鐘進行熒光強度分析。結果如圖3所示，圖3說明了存在和不存在熒光蛋白酶抑制劑的情 況下的實驗結果。比較HIV蛋白酶底物熒光變化，在不同的HIV蛋白酶 抑制劑存在下，HIV蛋白酶受到抑制后熒光蛋白酶指示劑的熒光增長，熒 光強度變化大小與HIV蛋白酶抑制劑的強弱直接相關，相對熒光強度越 低說明HIV蛋白酶抑制劑活性越強。根據上述實驗結果，即可對HIV蛋 白酶抑制劑進行評價。因此，通過此方法用本發明的熒光HIV蛋白酶指 示劑可篩選HIV蛋白酶抑制劑。以上已詳細描述了本發明的實施方案，對本領域技術人員來說很顯 然可以做很多改進和變化而不會背離本發明的基本精神。所有這些變化 和改進都在本發明的保護范圍之內。本文中所引用的所有出版物、專利 和專利公開文獻均全文引用作為參考。
權利要求
1、一種熒光指示劑，該指示劑可增強HIV蛋白酶的熒光強度，具有下述通式結構熒光淬滅劑——多肽鏈——熒光發射團 ......................(I)其中所述的熒光淬滅劑是最大吸收波長大于600nm的非熒光染料；所述的多肽鏈是含有HIV蛋白酶氨基酸的聚合物，可被HIV蛋白酶誘導水解；所述的熒光發射團是最大發射波長大于600nm的熒光染料。
2、 按照權利要求1所述的熒光指示劑，其中所述的多肽鏈含有2個到 50個可被HIV蛋白酶識別并切斷的氨基酸；優選所述的多肽鏈含有2 20 個氨基酸；更優選含有2 10個氨基酸；最優選的多肽鏈是選自以下的片段: HVSFNFPQITH; Gaba-SQNYPIVQ; VSFNFPQITK或SQNYPIVQK。
3、 按照權利要求1所述的熒光指示劑，其中所述的熒光發射團選自菁 染料、羅丹明及其衍生物、熒光素及其衍生物、香豆素和鑭系元素螯合物中 的一種或多種；優選的熒光發射團選自Cy5、 Cy5.5、 Cy7、 Cyanine5、 Alexa Fl匿647、 Alexa Fl匿680、 Alexa Fl匿750、 Super Fl麗647、 Super Fluor 680 或Super Fluor 750;更優選的熒光發射團是Cy5或Cyanine5;以及其中所述 的熒光淬滅劑選自偶氮染料、蒽醌類化合物、酞菁染料和重金屬絡合物；優 選的熒光淬滅劑是Super Quencher 5。
4、 按照權利要求1-3任意一項所述的熒光指示劑，其中所述的熒光指 示劑是Super Quencher 5—HVSFNFPQITH—C(Cyanine 5);Super Quencher 5 — Gaba-SQNYPIVQ—Cy5;RG(Cy5)—VSFNFPQITK—(Super Quencher 5)-R;Ac-RG(Alexa Fluor 647) —SQNYPIVQK—(Super Quencher 5)-R-NH2;或RRG(DyLight 647) —SQNYPIVQK—(Super Quencher 5)陽RR; 其中優選的熒光指示劑是Super Quencher 5 — HVSFNFPQITH —C(Cyanine 5)。
5、 用于檢測HIV蛋白酶活性的試紙，該試紙是將權利要求1-4任意一 項所述的HIV蛋白酶熒光指示劑吸附到固體支持物而制成的；優選的，所 述試紙的基質是紙或塑料薄膜。
6、 按照權利要求1-4任意一項所述熒光指示劑的制備方法，該方法包 括以下步驟(1) 將所需多肽底物用熒光發色團進行修飾，將所需的熒光發射團接 到多肽末端氨基上；和(2) 然后將含有熒光發射團的多肽與含有熒光淬滅團的分子偶聯，得 到所需的熒光指示劑；其中所述的多肽底物可按照常規方法合成。
7、 測定HIV蛋白酶活性的方法，該方法包括以下步驟(1) 將一定量的測試樣品與權利要求1-4任意一項所述的HIV蛋白酶 熒光指示劑或權利要求5的試紙接觸或混合；和(2) 測定步驟(1)所述接觸或混合后樣品的熒光強度值，以權利要求 1-4任意一項所述的HIV蛋白酶熒光指示劑或權利要求5的試紙本身的熒光 強度值為空白，計算所測試樣品的HIV蛋白酶的活性；其中所述的熒光指示劑的吸收或是發射都在近紅外區(>600nm);其中HIV蛋白酶的活性可用HIV蛋白酶/指示劑的標準曲線來量化，所 述的標準曲線可通過測定已知活性的HIV蛋白酶溶液產生的熒光變化速率 來繪制；以及其中所述的HIV蛋白酶活性的檢測可用熒光顯微鏡，酶標儀，流式細 胞儀，熒光計或吸收光譜實施，優選分光熒光計法或采用配備熒光檢測器的 HPLC方法。
8、 按照權利要求7所述的測定方法，其中所述的測試樣品可以是用于 研究或工業生產的樣品，或是生物樣品；優選的，其中所述的生物樣品可以 是組織切片，懸浮的細胞，或是含有生物體液的樣品；所述的生物體液可以是來自組織、淋巴、血液、尿液、唾液或其他的生物體液，或是上述各種樣 品的代謝產物；更優選的其中所述的生物樣品可以是組織切片、細胞懸浮液 或培養基溶液的形式。
9、 按照權利要求8所述的測定方法，其中所述的測試樣品是生物樣品 時，所述樣品需要與與權利要求1-4任意一項所述的HIV蛋白酶熒光指示劑 一起溫育10 60分鐘，溫育溫度37°C 38°C。
10、 篩選HIV蛋白酶抑制劑的方法，該方法包括以下步驟(1) 在沒有"測試物"存在的情況下，按照權利要求7-9任意一項所 述測定HIV蛋白酶活性的方法，測定某一 HIV蛋白酶的活性；(2) 在有"測試物"存在的情況下，按照權利要求7-9任意一項所述 測定HIV蛋白酶活性的方法，測定該HIV蛋白酶的活性；和(3) 通過比較步驟(1)和步驟(2)所得到的所述HIV蛋白酶的活性， 計算或評述上述"測試物"對HIV蛋白酶的抑制作用。
全文摘要
本發明提供了一個新型的多肽熒光試劑，HIV蛋白酶能大大增強該試劑的熒光強度。HIV蛋白酶將內淬滅的多肽斷開后產生更強的熒光產物，該產物在近紅外區發出高強度的熒光信號。該產物的近紅外熒光強度與HIV蛋白酶活性量成正比。鑒于其熒光信號在近紅外區，這種HIV蛋白酶指示劑非常適合測定各種生物樣品中蛋白酶的生物活性。本發明還提供了高通量篩選HIV蛋白酶抑制劑的方法，這對研制治療艾滋病新藥時具有極大的應用價值。
文檔編號G01N21/76GK101334362SQ200710123130
公開日2008年12月31日 申請日期2007年6月27日 優先權日2007年6月27日
發明者杜池敏, 第五振軍, 鄭超斌 申請人:北京泛博生物化學有限公司