專利名稱：：腫瘤相關抗原125磁微粒化學發光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種腫瘤相關抗原125磁微粒化學發光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。本發明的試劑盒結合了生物素一親和素免疫放大技術、免疫磁微粒技術和化學發光免疫分析技術。
背景技術：
：癌癥自從誕生之日起就對人類的生存健康構成了嚴重威脅。目前肺瘤治療的關鍵在于早期發現、早期治療，這已是人們的共識。但是目前醫院診斷早期腫瘤，主要是靠影像學和細胞病理學診斷技術，一般都是在具有明顯的g位性病變和臨床癥狀后才得以確診，但這已不是癌變的最早期。隨著腫瘤早期診斷進入蛋白質時代，以血液為代表的體液蛋白質成為腫瘤標志研究領域中的熱點。越來越多腫瘤標志物的發現對建立發展快速、高靈敏、高特異腫瘤標志物新型檢測技術提出了更高的要求。胂瘤相關抗原125(carbonhydrateantigen125,CA125)作為腫瘤相關抗原的一種，是一種高分子糖蛋白，主要含半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰氨基半乳糖鏈。血漿和體液中的CA125分別與分子量約為500kD和300kD的糖蛋白結合，而具有CA125免疫活性的最小亞基為50kD。CA125存于胚胎發育中的體腔上皮細胞中，于出生后消失，但在卵巢癌細胞中又重新出現。所以CA125主要用于惡性漿液性卯巢癌的診斷，也是卯巢癌手術和化療后療效觀察的重要指標。目前用于檢測CA125的免疫方法主要有酶免疫測定(enzymeimmunoassay,EIA)、it射免疫測定(radioimmunoassay,RIA)、免疫熒光測定(fluoroimmunoassay,FIA)、it射免疫顯影(radioimmunoimaging,RII)、抗體芯片(antibodymicroarrays)技術以及化學發光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)。這些超孩i量檢測技術的基本理論大體相同，但是所用示蹤劑及所發出的信號各不相同。根據大量的試驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩定性、準確性及發展前景來看，依次為化學發光免疫分析、熒光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析技術因其使用放射性元素作為標記物，因此對環境有一定污染性，并存在儀器成本貴，靈敏度不高，操作復雜，測定結果不穩定，試劑保存時間短等缺點。酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性。化學發光免疫分析法是一種較先進而有效的方法，可使檢測靈敏度達到10—18摩爾水平，而且檢測范圍可達6個數量級，又因為酶標記物穩定，可長期使用，因而得到了越來越多的關注。在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質成分較多，一定程度上影響了檢測靈敏度和準確性，所以從復雜的背景中快速分離、純化出目的待測物，是臨床檢驗工作者面臨的難題之一。免疫磁微粒技術是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學偶聯等方法包被上具有特異性親合力的各種免疫活性物質(抗原或抗體)，使其致敏為免疫磁微粒，具有分離速度快、效率高、可重復性好；操作簡單、不需要昂貴的儀器設備；不影響被分離細胞或其它生物材料的生物學性狀和功能等特點，在外加磁場作用下定向運動，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。采用微小的磁微粒作為固相可增加包被表面積，從而增加抗原或抗體的吸附量，既加快了反應速度，也使清洗和分離更簡便。作為用于化學發光免疫分析檢測技術的一種通用固相分離方法，磁微粒可大大提高有效包被量從而節省原料，同時可拓寬檢測的線性范圍，從而有效避免彎鉤效應的發生。將免疫磁微粒技術與化學發光免疫分析技術結合檢測待測物，可大大提高檢測的靈敏度和準確性，它以微米級磁微粒為載體，利用表面有機物提供的羧基活性基團與蛋白質氨基共價結合，采用抗體進行"搭橋"成免疫磁微粒，可進行抗原、抗體反應。該技術的新穎之處有(l)利用順磁鐵微粒為固相載體，外包被單克隆抗體，增加抗原、抗體的接觸面積及底物發光面積，提高反應的靈敏度，并采用旋轉磁場使磁微粒起攪拌作用及分離結合抗原-抗體與游離抗體的作用；(2)在液相反應中，使用發光增強劑，.將水分子從發光底物的發光位點排開，同時還可縮短發光的達峰時間；(3)使用單克隆抗體，提高了反應的特異性。生物素-親和素系統(biotin-avidinsystem,BAS)具有多級的信號放大作用，并且不增加非特異性干擾，且具有靈敏度高、特異性好、穩定性高、適用性強和實驗成本低等特點。生物素-親和素免疫放大技術可以直接用標記親和素連接生物素化大分子反應體系進4于;險測，這種方法稱為標記親和素-生物素法。待測反應體系可以利用生物素化抗體，使得親和素-生物素系統與免疫分析檢測體系偶聯，放大終反應先將針對不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與抗原(標準抗原和待測抗原)同時反應，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復合物，再加入親和素與復合物中的生物素結合，最終使反應信號放大，從而提高了免疫分析的靈敏度。化學發光免疫分析結合生物素-親和素系統和免疫磁微粒固相分離體系是一種檢測腫瘤相關抗原125的先進而有效的方法，有助于促進化學發光免疫分析技術在臨床檢驗、檢測中的應用與發展。
發明內容本發明同時解決了上述問題，即將生物素一親和素免疫放大技術和免疫磁微粒技術結合化學發光免疫分析技術，檢測腫瘤相關抗原125，提供了一種能夠筒便、快速、靈敏、穩定地檢測腫瘤相關抗原125的測定試劑盒，該試劑盒適于在產業上有效地推廣應用。本發明的目的是提供一種生物素一親和素免疫放大技術和免疫磁微粒技術結合化學發光免疫分析測定腫瘤相關抗原125的磁微粒化學發光免疫分析測定試劑合JULo本發明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。根據本發明的試劑盒包括l)紳瘤相關抗原125校準品；2)腫瘤相關抗原125單克隆抗體包被的^茲孩i:粒和生物素標記的腫瘤相關抗原125單克隆抗體的混合液；3)辣根過氧化物酶標記的鏈親和素；4)上述辣根過氧化物酶所作用的化學發光底物魯米諾或異魯米諾；以及5)反應管。根據本發明的試劑盒，其中，所述腫瘤相關抗原125單克隆抗體包被的磁微粒與生物素標記的肺瘤相關抗原125單克隆抗體的混合比例為1:1。根據本發明的試劑盒，其中，所述化學發光底物包含A液和B液，其中，A液是在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對石典苯酚；B液是在雙蒸水中加入一寧檬酸三鈉和種檬酸，配制成O.lMpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。根據本發明的試劑盒，其中，所述試劑盒使用的反應管材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。進一步，根據本發明的制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以腫瘤相關抗原125純品配制校準品；2)配制肺瘤相關抗原125單克隆抗體包被磁微粒和生物素標記腫瘤相關抗原125單克隆抗體的混合液；3)以辣根過氧化物酶標記鏈親和素；4)配制辣根過氧化物酶所作用的化學發光底物魯米諾或異魯米諾；5)分裝上述校準品、抗體包被磁微粒和生物素標記抗體的混合液、酶標記物、化學發光底物魯米諾或異魯米諾和反應管；以及6)組裝為成品。根據本發明的方法，在所述制備抗體包被磁微粒和生物素標記抗體的混合液的步驟2)中所述的混合液是由胂瘤相關抗原125單克隆抗體包被的磁微粒和生物素標記的腫瘤相關抗原125單克隆抗體以體積比為l;l混合，以2040%的小牛血清配制而成；所述磁微粒為2~3nm粒徑、四氧化三鐵內核、表面包裹帶有活性基團如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)的聚合物，其使用濃度為510mg/mL;所述抗體包被磁微粒是通過戊二醛兩步法將腫瘤相關抗原125單克隆抗體包凈皮于^茲樣i:粒上；以封閉液封閉包被的磁微粒，所述封閉夜為含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、pH值為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液；所述生物素標記腫瘤相關抗原125單克隆抗體是通過生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗體游離賴氨酸發生偶聯反應而實現的。根據本發明的方法，在所述以辣根過氧化物酶標記鏈親和素的步驟3)中，采用改良過碘酸鈉法以辣根過氧化物酶標記鏈親和素。根據本發明的方法，所述化學發光底物包含A液和B液，其中，A液是在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成O.IMpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成O.lMpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。在根據本發明制備上述試劑盒的方法中，使用透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃作為反應管材料。具體的上述試劑盒可以包括校準品、抗體包被磁微粒和生物素標記抗體的混合液、酶標記物、化學發光底物與洗滌緩沖液等。其中，所述校準品的原料為標準級，純度不低于90%;抗體包被于磁微粒上，與生物素標記的抗體形成混合液；標記鏈親和素的酶為辣根過氧化物酶；化學發光底物為魯米諾；洗滌緩沖液為磷酸鹽緩沖液。本發明"腫瘤相關抗原125磁微粒化學發光免疫分析測定試劑盒"可以非常有效地檢測出卵巢癌特別是惡性漿液性卵巢癌患者體內的肺瘤相關抗原125的含量，可以根據腫瘤相關抗原125含量的多少判斷治療效果及其病情的變化。本發明的試劑盒(化學發光法、生物素-親和素免疫放大技術與免疫磁微粒結合)具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點，且各項指標均達到同類進口試劑盒的分析法水平。并且，根據本發明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學發光測量儀，特別適合廣大的中小醫院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。根據本發明的試劑盒，腫瘤相關抗原125單抗包被的磁微粒、待測樣品中的腫瘤相關抗原125與生物素標記的腫瘤相關抗原125單抗結合，形成"雙抗體夾心"復合結構，之后酶標記的鏈親和素再與該復合結構結合，形成"磁微粒-抗體-待測抗原-抗體-生物素-親和素-酶"復合物，最后與化學發光底物作用而產生并放大光信號，在管式發光儀中對腫瘤相關抗原125進行高靈敏、高特異檢測。本發明采用"雙抗體直接夾心兩步法"反應模式，有效地利用了化學發光技術結合磁微粒和生物素-親和素免疫放大技術原理，定量檢測人體血清、血漿樣品中腫瘤相關抗原125含量，確保了檢測的靈敏度。使用的磁微粒具有超順磁、高分散、表面積大的特點。對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單可靠，可快速、高通量檢測大批樣品，便于操作和生產。本發明的試劑盒結構簡單，使用方便，價格便宜，攜帶便利，與市場上的酶聯免疫試劑盒、板式化學發光試劑盒相比，線性范圍寬，有效避免彎鉤效應，不需樣品稀釋，適用于大批量檢測樣品。圖1為實施例1所制備的試劑盒中的校準品線性圖(雙對數標準曲線)。圖2為本發明的試劑盒同國外試劑盒(Monobind公司孩i板式化學發光試劑盒)臨床血樣測值比對的相關曲線。具體實施方式實施例1制備本發明的腫瘤相關抗原125磁微粒化學發光免疫分析測定試劑合一、腫瘤相關抗原125校準品的制備用馬血清將肺瘤相關抗原125純品稀釋成校準品，濃度分別為0U/mL、20U/mL、80U/mL、200U/mL、400U/mL、800U/mL，共6瓶。二、腫瘤相關抗原125單克隆抗體包^^茲微粒與生物素標記腫瘤相關抗原125單克隆抗體的混合液的制備1、肺瘤相關抗原125單克隆抗體包被的磁微粒的制備將粒徑為23pm^磁微粒用戊二醛進行活化，室溫攪拌，混勻3小時后，加磁場，靜置2025min,倒出上清，用pH值為7.4的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，并用該溶液進行懸浮，濃度為50100mg/mL;每毫升懸浮液中加入腫瘤相關抗原125單克隆抗體40100嗎，在4。C下攪拌過夜后，加磁場，靜置1015min，倒出上清，用含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、0.02mol/L的磷酸緩沖液(pH為7.2)于室溫封閉34小時；最后用pH值為7.4、含吐溫-20和疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽洗滌緩沖液清洗35次，并用該溶液配制成5~10mg/mL的工作液。磁微粒在4°C保存。2、生物素標記的腫瘤相關抗原125單克隆抗體的制備生物素標記腫瘤相關抗原125單克隆抗體以生物素琥珀酰亞胺酯在孩"威性條件下與單抗發生偶聯反應，對PBS充分透析，生物素標記物以小牛血清稀釋，加入proclin300，-20。C以下保存。3、混合液的制備將腫瘤相關抗原125單克隆抗體包被的磁微粒與生物素標記的腫瘤相關抗原125單克隆抗體以體積比為1:1混合，以20~40%小牛血清配制而成。三、辣根過氧化物酶標記的鏈親和素的制備以l束才艮過氧化物酶標記鏈親和素采用改良過石輿酸鈉法，具體標記過程如下溶解4.4mgHRP于lmL蒸餾水中，加入0.4mL過碘酸鈉(5Ommol/L)室溫攪拌20min,經lmmol/L醋酸鈉緩沖液，pH4.4透析后加入8mg鏈親和素，攪拌2h，最后用200mmol/LNaBH4進行還原，經0.02MPBS緩沖液透析后，加等體積甘油，-20。C以下保存。'四、酶標記物的濃度選定采用方陣法選擇酶標記物的工作濃度范圍為1:3000-5000。，五、酶標記物稀釋液Tris12.120gBSA5gProclinlmL雙蒸水1000mL六、化學發光底物本發明所使用的辣根過氧化物酶(HRP)的化學發光底物液的配制方法A液在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的對石典笨酚。B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和杵檬酸，配制成0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，在此溶液中加入200mg/mL的過氧化氫溶液。使用方法A、B液雙組分試劑，在使用前根據使用量等體積混合。七、洗滌緩沖液洗滌緩沖液是含有0.1~0.5%吐溫-20、0.1。/。疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4。使用時用蒸餾水稀釋20倍。/\、半成品及成品纟且成上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定性檢定合格才能組裝成腫瘤相關抗原125磁微粒化學發光免疫分析測定試劑盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。實施例2本發明的試劑盒的使用方法一、樣品前處理取人的空腹晨血清樣品，3000rpm離心5min,取上層液25pL進行分析。二、4企測方法使用本試劑盒進行實驗前，需先取出抗體包被磁微粒與生物素標記抗體的混合液、校準品/待測樣品、酶標記的親和素在室溫放置15-30分鐘，使它們平衡到室溫；之后，將恒溫溫箱或者水浴鍋調至37°C;再后，準備好合適的^t量加樣器及對應吸頭并且檢查化學發光儀是否正常工作。使用本試劑盒按照實施例2的方法進行實驗的具體操作步驟如下將圓底聚苯乙烯試管編號后，向試管中加入25iaL血清樣品或系列校準品溶液，校準品每管加0U/mL、20U/mL、80U/mL、200U/mL、400U/mL、800U/mL各25faL，再加入抗體包被磁微粒與生物素標記抗體的混合液50|iL，37。C振蕩反應30min。用洗滌液清洗三遍后，加入辣才艮過氧化物酶標記的鏈親和素50pL，37。C振蕩反應15min。之后，將試管架置于磁分離器上分離5min,然后倒轉分離器倒出上清液，將倒轉的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管加入洗滌液500pL,充分混勻，置于磁分離器上分離5min,倒出上清液，將倒轉的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體，重復3次。各管加入化學發光底物200~400pL,充分混勻，置于磁分離器內，待磁微粒富集于底部后，暗處放置10min，而后在管式化學發光測量儀上依序測量各管的發光強度(RLU)。以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為縱坐標繪出標準曲線(雙對數曲線)，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的CA125的濃度，見附圖1,其中，I為發光強度，C為CA125濃度(單位為U/mL),相關系數r=0.9991,Y=4.23+0.85X。實施例3本發明的試劑盒的方法學檢定按照本領域中常規的制造及檢定規程對實施例1中制備的試劑盒進行檢定，結果如下1、試劑盒精密度測定(1)校準品精密度實驗將實施例1中制備的試劑盒分別取三批進行精密度實驗，每批抽取10個試劑盒。以實施例1中所抽取的試劑盒測定80U/mL的CA125校準品5次。計算測定濃度的變異系數。實施例1中的三批試劑盒的測定結果如表1所示，結果表明變異系數在3.0%~8.5%之間。表lCA125校準可重復性實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(2)樣本可重復性實驗取兩份正常人血清，分別添加CA125校準品至80U/mL和200U/mL。取實施例1中三個不同批次的試劑盒各3個，對樣品重復測定5次，分別計算變異系數。測定結果如表2、表3所示，表明本發明所制備的CA125磁微粒化學發光免疫分析測定試劑盒測定血清樣本的變異系數小于2.1%。表280U/mLCA125血清樣品可重復性實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表3200U/mLCA125血清樣品可重復性實驗<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>2、試劑盒準確度測定取兩個CA125臨床定值血清，濃度分別為37.8U/mL和103.6U/mL,分別向其中加入CA125的校準品溶液20U/mL、80U/mL和200U/mL,按照實施例1的方法對每個濃度做3個平行，計算回收率。結果如表4所示，表明CA125的添加回收率在86.8%~99.6%之間。表4實施例l的試劑盒的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3、試劑盒穩定性實驗對實施例1的試劑盒進行37。C7天加速實驗后，測定試劑盒的最大、最低發光強度、待測物的加標回收率，表明實施例1的試劑盒指標均在正常范圍之內。對實施例1的試劑盒主要組分(抗體包被磁微粒與生物素標記抗體的混合液、辣根過氧化物酶標記的鏈親和素溶液、校準品、發光底物液和洗滌緩沖液)進行28°C8個月的跟蹤實驗，結果表明各項指標完全符合臨床要求。考慮到試劑盒冷凍情況的發生，將實施例1的試劑盒放入-2(TC冷凍7天，測定結果也表明試劑盒的各項指標完全正常。從以上結果可以看出試劑盒可以在2~8。C至少可以保存6個月以上。經過大量的實驗證明，本發明試劑盒的方法學指標如下氺全測范圍0800U/mL;靈敏度最小檢出限為0.3U/mL;精密度小于10%(n=30);準確性平均回收率在85.0%~100.0%之間；特異性與CA19-9、CEA、AFP、CA50、CA153等常見的肺瘤標志物的交叉反應率小于0.1%;穩定性各試劑組分置37t:,考察7天后，各組分仍穩定。說明"腫瘤相關抗原125磁微粒化學發光免疫分析測定試劑盒"的臨床檢測范圍、靈敏度、精密度、準確性、特異性和穩定性是完全符合臨床要求的。綜上，在本發明的研究過程中，本發明的發明人首先對所用的原材料進行了篩選實驗和質量檢定，包括包被抗體的活性、磁微粒的吸附性能和變異大小、HRP的活性、化學發光底物的發光強度及發光持續時間等。然后對包被方法進行了研究，用不同的包被緩沖液和封閉液進行實驗，選擇出最適合的包被液和封閉液，通過抗體不同包被濃度實驗找到最佳的濃度條件。對于HRP的標記可以有不同的方法，通過反復探索和對比實驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可靠的標記方法，并對不同的酶稀釋液進行了長期的考察實驗，配制出了能夠使酶標記物長期保持活性穩定的稀釋液。本發明的發明人還對試劑盒的反應模式和反應條件進行了實驗研究，最終確定了雙抗體夾心兩步法反應模式，并就不同的反應時間對實驗結果的影響進行了實驗，確定最適合的反應時間。利用本發明方法進行檢測，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測及篩查實驗室，可有效地診斷惡性漿液性卵巢癌，并可用于卵巢癌手術和化療后的療效觀察。實施例4本發明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對用本發明的試劑盒和Monobind公司的CA125微板式化學發光試劑盒對80份腫瘤病人的臨床血清樣品同時進行檢測，所采用的80份臨床血樣來自首都醫科大學附屬天壇醫院和首都醫科大學附屬友誼醫院。其檢測結果見附圖2，以本發明方法測定的血樣CA125結果為橫坐標，.以Monobind測定的結果為縱坐標作回歸分析，相關方程為Y=1.010X-1.055,相關系數r=0.9850。經統計學處理結果表明，本發明方法同國外試劑盒臨床血樣測值相關性良好。權利要求1、一種腫瘤相關抗原125磁微粒化學發光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)腫瘤相關抗原125校準品；2)腫瘤相關抗原125單克隆抗體包被的磁微粒和生物素標記的腫瘤相關抗原125單克隆抗體的混合液；3)辣根過氧化物酶標記的鏈親和素；4)上述辣根過氧化物酶所作用的化學發光底物魯米諾或異魯米諾；以及5)反應管。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述肝瘤相關抗原125單克隆抗體包被的磁微粒與生物素標記的腫瘤相關抗原125單克隆抗體的混合比例為1:1。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發光底物包含A液和B液，其中，A液是0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒使用的反應管材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。5、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以腫瘤相關抗原125純品配制才交準品；2)配制腫瘤相關抗原125單克隆抗體包被磁微粒和生物素標記腫瘤相關抗原125單克隆抗體的混合液；3)以辣才艮過氧化物酶標記鏈親和素；4)配制辣根過氧化物酶所作用的化學發光底物魯米諾或異魯米諾；5)分裝上述校準品、抗體包被^t微粒和生物素標記抗體的混合液、酶標記物、化學發光底物魯米諾或異魯米諾和反應管；以及6)組裝為成品。6、如權利要求5所述的方法，其特征在于，在所述配制抗體包被磁微粒和生物素標記抗體的混合液的步驟2)中所述的混合液是由腫瘤相關抗原125單克隆抗體包被的磁微粒和生物素標記的肺瘤相關抗原125單克隆抗體以體積比為1:1混合，以2040%'的小牛血清配制而成；所述磁微粒為23(im粒徑、四氧化三鐵內核、表面包裹帶有活性基團的聚合物，其使用濃度為510mg/mL;所述抗體包被磁微粒是通過戊二醛兩步法將胂瘤相關抗原125單克隆抗體包被于磁微粒上；以封閉液封閉包被的磁微粒，所述封閉液為含有0.2%1.0%牛血清白蛋白、pH值為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液；所述生物素標記腫瘤相關抗原125單克隆抗體是通過生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗體游離賴氨酸發生偶聯反應而實現的。7、如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述活性基團為氨基或羧基。8、如權利要求5所述的方法，其特征在于，在所述以辣根過氧化物酶標記鏈親和素的步驟3)中，采用改良過碘酸鈉法以辣根過氧化物酶標記鏈親和素。9、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述化學發光底物包含A液和B液，其中，A液是0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對碘苯酚；B液是0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氬溶液。10、如權利要求5所述的方法，其特征在于，使用透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃作為反應管材料。全文摘要本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種CA125磁微粒化學發光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。根據本發明試劑盒包括1)CA125校準品；2)CA125單克隆抗體包被磁微粒和生物素標記CA125單克隆抗體的混合液；3)辣根過氧化物酶標記的鏈親和素；4)化學發光底物；以及5)反應管。進一步，根據本發明制備上述試劑盒的方法為1)以CA125純品配制校準品；2)配制抗體包被磁微粒和生物素標記抗體的混合液；3)用辣根過氧化物酶標記鏈親和素；4)配制化學發光底物；5)分裝上述校準品、混合液、酶標記物、化學發光底物和反應管；以及6)組裝為成品。本發明試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點。文檔編號G01N33/577GK101398431SQ20071012256公開日2009年4月1日申請日期2007年9月27日優先權日2007年9月27日發明者應希堂,李振甲,林金明,栩王,胡國茂申請人:北京科美東雅生物技術有限公司